海發(fā)菜提取物脫鎂葉綠素酸鹽A對六種癌細胞的光毒性

黃細香，蔡曉璇，王天吉，黃妙恩，李立，呂應(yīng)年

0 引言

癌癥是嚴(yán)重危害人民健康的一種疾病，傳統(tǒng)治療方式有手術(shù)、放療及化療，隨著醫(yī)學(xué)發(fā)展，靶向與內(nèi)分泌治療取得了良好效果[1]。光動力治療（photodynamic therapy,PDT）是一種新興非侵入性治療方式，在腫瘤輔助治療中發(fā)揮重要作用[2]。PDT是將光敏劑聚集在腫瘤部位，用特定波長進行照射產(chǎn)生大量多線態(tài)氧，從而對腫瘤細胞產(chǎn)生殺傷作用[3]。光敏劑是光動力治療不可缺少的關(guān)鍵因素，脫鎂葉綠素酸鹽A（pheophorbide a,PPBa）是第二代光敏劑，在光動力抗腫瘤治療中引起了廣泛關(guān)注。PPBa是一種葉綠素的降解產(chǎn)物，在植物光合作用和光轉(zhuǎn)化過程中起著至關(guān)重要的作用[4]。PPBa具有抗癌[5]、抗病毒[6]、抗炎[7]、抗氧化[8]、免疫刺激和抗寄生蟲等活性[9]。有研究報道，PPBa毒性低、單線態(tài)氧產(chǎn)率高并且在650～700 nm有強吸收，使PPBa有較強的組織穿透力，能更好發(fā)揮光動力治療效果[10]。由于PPBa水溶性差、腫瘤靶向性不足，在產(chǎn)生治療作用的同時也會對正常組織產(chǎn)生不良反應(yīng)；為了克服PPBa的不足，研究者對PPBa進行劑型改造。已有研究表明，將PPBa載入納米材料中形成納米粒，并在納米粒表面進行靶向修飾，能有效改善PPBa的溶解性和靶向性，使PPBa高濃度聚集在腫瘤部位，從而得到理想療效，并降低不良反應(yīng)[11-15]。本課題組前期研究從一種大型海洋紅藻海發(fā)菜中提取并純化PPBa[16]，但尚未進行抗腫瘤藥理活性研究。

為提高海藻資源的利用價值，探索新型藥用化合物，本實驗將從海發(fā)菜中提取鑒定的PPBa進行抗腫瘤活性的篩選，研究PPBa對不同癌細胞的殺傷力和使用安全性、光照強度和給藥濃度對其活性的影響、藥物在細胞中的攝取部位、單線態(tài)氧產(chǎn)生情況及光漂性大小，為后期的藥物活性研究及劑型改造提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

實驗細胞均購自上海ATCC細胞庫，PBS、DMEM培養(yǎng)基、胰蛋白酶、血清（批號分別為8121049、8121412、20210602、2176404）均購自上海慧穎生物科技有限公司；活性氧檢測試劑盒、4%多聚甲醛固定液MTT、Hoechst33342染色液（批號分別為061521210827、P0099、060321210713）均購上海自碧云天生物技術(shù)有限公司。

1.2 方法

1.2.1 高效液相確定照射波長 精密稱取5 mg PPBa，置于50 ml容量瓶中，用甲醇溶解并定容，取相應(yīng)體積PPBa甲醇溶液將其配制成80 μg/ml的PPBa溶液，用高效液相色譜儀進行全波長掃描。

1.2.2 MTT法檢測PPBa對癌細胞的光毒性與暗毒性 將乳腺癌細胞（MCF-7）、肺癌細胞（A549）、宮頸癌細胞（HeLa）和3種肝癌細胞（HepG2、hep3B、sk-Hep1）接種于96孔板中，每種細胞分為光反應(yīng)組和暗反應(yīng)組，5%CO2、37℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)過夜，加入濃度梯度藥物（0、0.313、0.625、1.250、2.500、5.000、10.000 μmol/L）PPBa處理細胞，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，光反應(yīng)組給予3 J/cm2波段為670～680 nm的紅光進行照射，暗反應(yīng)組不進行光照處理，繼續(xù)培養(yǎng)24 h，MTT法檢測細胞活性。

1.2.3 光MTT法檢測照強度對藥物光毒性的影響 將MCF-7細胞接種于96孔板中，8000個/孔，設(shè)6個復(fù)孔，于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，加入濃度為10 μmol/L的PPBa，培養(yǎng)4 h，670～680 nm紅外光照射0、1.5、3、6、12 J/cm2，繼續(xù)培養(yǎng)24 h，加入MTT，每孔20 μl，培養(yǎng)4 h，吸去培養(yǎng)基，加入DMSO溶解，每孔150 μl，490 nm處測吸光度值。

1.2.4 MTT法檢測藥物濃度對光毒性的影響 將MCF-7細胞接種于96孔板中，8000個/孔，設(shè)6個復(fù)孔，于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，加入濃度梯度為0、1.250、2.500、5.000、10.000、20.000、40.000 μmol/L的PPBa，培養(yǎng)4 h，670～680 nm紅外光照射10 min，繼續(xù)培養(yǎng)24 h，加入MTT，每孔20 μl，培養(yǎng)4 h，吸去培養(yǎng)基，加入DMSO溶解，每孔150 μl，490 nm處測吸光度值。

1.2.5 Hoechst染色觀察PPBa的體外攝取 PPBa在細胞中的攝取主要通過Hoechst細胞核染色劑對細胞進行染色，并且利用PPBa自身熒光進行攝取部位的觀察：將MCF-7細胞接種于6孔板中，每孔5×105個，培養(yǎng)箱培養(yǎng)過夜，加入PPBa，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，吸去培養(yǎng)基，用PBS洗三遍，洗掉未進入細胞的藥物，用4%的多聚甲醛溶液固定30 min，用PBS洗三遍，加入Hoechst染色液，每孔1 ml，染色20 min，用PBS洗三遍，每次3～5 min，用共聚焦顯微鏡觀察細胞攝取情況。

1.2.6 流式檢測單線態(tài)氧（ROS）的產(chǎn)生 ROS的產(chǎn)生主要通過熒光共聚焦顯微鏡進行拍攝觀察和流式進行定量檢測，將MCF-7細胞接種于6孔板中，每孔7×105個，培養(yǎng)箱培養(yǎng)過夜，加入PPBa，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，用活性氧檢測試劑盒的染液孵育20 min，給予3 J/cm2670～680 nm紅外光照射，繼續(xù)培養(yǎng)1 h，進行樣品處理之后上機觀察或測試。

1.2.7 NAC單線態(tài)氧抑制劑對PPBa光毒性的影響 MTT法觀察N-乙酰半胱氨酸（NAC）單線態(tài)氧抑制劑對PPBa光毒性的影響，將MCF-7細胞接種于96孔板中，每孔5×103個，實驗組分別是PPBa單獨處理組和PPBa與NAC（PPBa+NAC）共同處理組，培養(yǎng)箱培養(yǎng)過夜，加入藥物，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，給予670～680 nm紅外光照射，繼續(xù)培養(yǎng)24 h，加入MTT，每孔20 μl，培養(yǎng)4 h，吸去培養(yǎng)基，加入DMSO溶解，每孔150 μl，490 nm處測吸光度值。

1.2.8 吸光度法觀察PPBa的光穩(wěn)定性 光漂白性是指光敏劑藥物在光照射下發(fā)生分解而失去活性。光漂白性高說明在光作用下光敏劑迅速分解而失去作用，因此理想的光敏劑一般要求具有極低的光漂白性。本實驗測定PPBa在常用濃度范圍內(nèi)的光漂白性，取高、低兩個濃度（20 μg/ml、2.5 μg/ml）用酶標(biāo)儀在660 nm處測其吸光度值，每隔10 min檢測一次，測定50 min。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

本研究采用GraphPad軟件進行單因素方差分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 照射光波長的確定

實驗結(jié)果表明，PPBa在350～400 nm和650～680 nm兩個波段有強吸收，并且在350～400 nm波段的吸收較強，見圖1。但由于350～400 nm波段屬于紫外光區(qū)，紫外光本身對細胞有殺傷抑制作用，將干擾實驗藥物對細胞存活率的影響，而650～680 nm處于可見光區(qū)，對細胞沒有殺傷抑制作用，因此本研究選擇650～680 nm波段的光進行實驗。

圖1 PPBa的高效液相全波長掃描圖Figure 1 Full wavelength scanning diagram of PPBa

2.2 PPBa對癌細胞的光毒性與暗毒性

光反應(yīng)組的6組細胞在藥物濃度達到2.500 μmol/L時存活率均低于50%，各組細胞的IC50分別為MCF-7：1.033 μmol/L、A549：1.911 μmol/L、HeLa：2.319 μmol/L、HepG2：2.015 μmol/L、Hep3B：2.089 μmol/L、sk-Hep1：2.467 μmol/L，而暗反應(yīng)的6組細胞存活率都很高，甚至有些高濃度還具有促增殖作用。PPBa對各種癌細胞都具有很強的光毒性殺傷力，其中對乳腺癌細胞殺傷力最強，而對各種細胞極低的暗毒性則保證了PPBa在治療過程中良好的安全性。相對其他癌細胞而言，PPBa對MCF-7的光毒性相對較強，因此后續(xù)實驗在MCF-7細胞上進行，見圖2。

圖2 PPBa對不同癌細胞的暗毒性和光毒性Figure 2 Dark toxicity and phototoxicity of PPBA to different cancer cells

2.3 光照強度對藥物光毒性的影響

在無光照時，PPBa沒有毒性，甚至在5.000、10.000 μmol/L兩個高濃度出現(xiàn)了明顯的促增殖作用，細胞存活率升高；在有光照時，PPBa都表現(xiàn)出光毒性，細胞存活率降低；且在同一光照強度下，光毒性隨藥物濃度增加而增加。當(dāng)光照強度在3 J/cm2及以上時，藥物在2.500、5.000、10.000 μmol/L的給藥濃度都有很大的光毒性，細胞的存活率小于50%。當(dāng)光照強度在12 J/cm2時，1.250 μmol/L與后面三個給藥濃度對癌細胞光毒性殺傷力相當(dāng)，細胞抑制率都達到了85%左右，分別為1.250 μmol/L：84.640%、2.500 μmol/L：86.570%、5.000 μmol/L：85.960%、10.000 μmol/L：84.780%。當(dāng)光照強度＜12 J/cm2的另外三個光照強度在給藥濃度為1.250 μmol/L時細胞抑制率分別為1.5 J/cm2：29.639%、3 J/cm2：49.890%、6 J/cm2:71.050%，而0.313 μmol/L、0.625 μmol/L在所選光照強度下沒有明顯變化。PPBa需達到一定藥物濃度才能產(chǎn)生較強的光毒性，并且可通過控制光照強度最大地發(fā)揮藥物的光毒性。因此在進行光動力抗腫瘤研究時，探索并確定適合光敏劑發(fā)揮藥效的光照強度，對發(fā)揮光敏劑的理想效果尤其關(guān)鍵，見圖3。

2.4 藥物濃度對光毒性的影響

當(dāng)濃度在2.500 μmol/L以下時PPBa的光毒性隨藥物的濃度增加而增大，具有濃度依賴性，當(dāng)藥物濃度達到2.500 μmol/L及以上時，PPBa的光毒性不再隨藥物的濃度增加而變化，而是趨于穩(wěn)定，見圖4。

2.5 PPBa的體外攝取

Hoechst染色的細胞核呈藍色，PPBa在激光激發(fā)下呈現(xiàn)紫色，從三張圖結(jié)合分析可以看出，PPBa的主要攝取部位是在細胞質(zhì)中，因此在后期的劑型改造中可以通過對劑型進行靶向癌細胞細胞質(zhì)的表面修飾增強藥物的靶向能力，從而提高藥物在目標(biāo)部位的積累量，見圖5。

2.6 單線態(tài)氧（ROS）產(chǎn)生情況

根據(jù)PPBa對腫瘤細胞的光毒性實驗結(jié)果可以看出，1.250、2.500和5.000 μmol/L這三個濃度對腫瘤細胞的殺傷作用的梯度性比較強，因此，流式細胞實驗選擇這三種濃度進行。圖6A為熒光共聚焦顯微鏡拍攝的細胞熒光圖，隨著藥物濃度的增加，熒光強度增強，說明單線態(tài)氧的產(chǎn)生量在增加。實驗結(jié)果表明單線態(tài)氧的產(chǎn)生量與藥物濃度成正相關(guān)。圖6B是細胞流式的結(jié)果，F(xiàn)ITC的陽性率隨著藥物濃度的增加顯著上升，分別為Control：0.120%、1.250 μmol/L：1.660%、2.500 μmol/L：22.200%、5.000 μmol/L：40.100%。這一結(jié)果表明同一光照強度下，隨著藥物濃度的增加，產(chǎn)生的ROS的量也在增加，而光敏劑對腫瘤細胞的殺傷作用就是由于在光照下產(chǎn)生大量的ROS，這與2.2藥物對腫瘤細胞的光毒性隨藥物濃度增加而增強結(jié)果相符。因此根據(jù)這一結(jié)果，可以用于評價藥物劑型改造對活性氧產(chǎn)生的影響，從而評價劑型改造對藥物治療作用的影響。

圖6 單線態(tài)氧(ROS)的產(chǎn)生情況：熒光共聚焦圖(A)和細胞流式圖(B)Figure 6 ROS production diagram of PPBa:fluorescence confocal diagram(A) and cell flow cytometry diagram(B)

2.7 NAC單線態(tài)氧抑制劑對PPBa光毒性的影響

結(jié)果表明，單獨用PPBa對細胞進行處理時，PPBa對細胞產(chǎn)生明顯的光毒性，而PPBa與單線態(tài)氧抑制劑NAC聯(lián)合處理細胞時，PPBa沒有對細胞產(chǎn)生光毒性，反而表現(xiàn)出一定的促增殖作用，見圖7。說明PPBa的光毒性主要是PPBa在光照下生成大量ROS產(chǎn)生的。

圖7 NAC對PPBa光毒性的影響Figure 7 Effect of NAC on phototoxicity of PPBa

2.8 PPBa的光漂白性

結(jié)果表明，PPBa在常用濃度范圍內(nèi)（低濃度）的光漂白性很低，在50 min內(nèi)日光燈下都小于10%，可見PPBa是一種理想的光敏劑，可用于光動力抗腫瘤治療的后續(xù)研究，見圖8。

圖8 PPBa在660nm處吸光度與時間的關(guān)系Figure 8 Relationship between absorbance of PPBa at 660 nm and time

3 討論

光毒性和暗毒性是評價光動力治療效果的兩個重要指標(biāo)，光毒性主要評價的是在適當(dāng)波長光的激發(fā)下對腫瘤組織殺傷力的大小，而暗毒性大小則評價在沒有進行光處理時藥物對細胞的影響，主要考察藥物在用于治療時的安全性[17]。本研究結(jié)果顯示，各種癌細胞加入PPBa處理后，具有很強的光毒性，而暗毒性都極低，相反有些濃度還具有促增殖作用。

光動力療法有三個必不可少的要素：光敏劑、氧氣和光，如何將這三者進行合理的使用，對發(fā)揮出理想的光動力效果十分重要[18]。本研究顯示，PPBa的光照強度和給藥濃度對PPBa的光毒性都有不同程度的影響，當(dāng)PPBa的給藥濃度達到一定量時，在規(guī)范范圍內(nèi)加強光照強度可以增強藥物的光毒性殺傷力得到更好的治療效果；PPBa在所選濃度范圍內(nèi)暗毒性都極低，光毒性則在PPBa濃度＜2.5 μmol/L時具有顯著的濃度依賴性，當(dāng)濃度＞2.5 μmol/L時光毒性趨于平穩(wěn)，不再隨濃度增加而產(chǎn)生顯著的變化。

藥物能否進入細胞是藥物發(fā)生療效的重要影響因素，如果一個藥物不能有效被細胞攝取，則不能很好發(fā)揮藥物原有的療效，據(jù)藥物攝取部位不同可以對藥物進行相應(yīng)的改造，使其更好地被細胞攝取，從而發(fā)揮更好的療效[19]。研究表明，PPBa發(fā)揮光動力治療效果是通過PPBa在特定波段的光照射產(chǎn)生單線態(tài)氧對細胞產(chǎn)生強大的殺傷作用來殺滅腫瘤細胞[20]。光漂性是光敏劑的一個特性，一個理想光敏劑應(yīng)該具有極低的光漂性，光漂性低說明具有良好的穩(wěn)定性。本研究結(jié)果顯示，PPBa的光漂性很低，在50 min內(nèi)僅僅光漂了10%左右，具有較強的抗光漂能力。

綜上所述，PPBa具備作為光敏劑的優(yōu)良特性，在光動力抗腫瘤方面有很大的潛力，本研究只是初步對PPBa的體外抗腫瘤活性做了簡單的探索，PPBa產(chǎn)生作用的機制十分復(fù)雜，需要進一步的實驗探索和驗證。后續(xù)實驗中，本課題組將對PPBa進行劑型改造，并在本研究基礎(chǔ)上考察劑型改造對PPBa光毒性暗毒性、細胞內(nèi)攝取、單線態(tài)氧的產(chǎn)生及光漂白性的影響。