‘南水6 號(hào)’水果黃瓜的制種技術(shù)研究和制種純度檢測(cè)

劉 爽，王克征，錢(qián)春桃

（南京農(nóng)業(yè)大學(xué) 園藝學(xué)院，江蘇 南京 210000）

水果黃瓜最早是從歐洲引進(jìn)我國(guó)，其品質(zhì)優(yōu)良，口感鮮脆，具有良好的市場(chǎng)推廣價(jià)值。近年我國(guó)也培育了很多優(yōu)良水果黃瓜品種，如‘ 綠翠’、‘ 綠美一號(hào)’等。南京農(nóng)業(yè)大學(xué)葫蘆科作物遺傳與種質(zhì)創(chuàng)新實(shí)驗(yàn)室培育的水果黃瓜‘ 南水6 號(hào)’ 外皮呈深綠色，且表皮光滑，果實(shí)呈短棒形，果形較為順直，果肉較厚，口感鮮嫩可口，風(fēng)味獨(dú)特，具有良好的商品性。

與密刺黃瓜相比，水果黃瓜制種存在制種量較低的問(wèn)題。胡安杰等通過(guò)研究‘ 翠綠’高產(chǎn)高效雜交制種技術(shù)，每公頃獲得雜交種子448 kg。苗兵兵等通過(guò)總結(jié)華南地區(qū)水果黃瓜的制種技術(shù)，最終得出水果黃瓜的單瓜籽粒數(shù)量100～200 粒，千粒質(zhì)量16～32 g，產(chǎn)量224～298 kg·hm。莫偉欽等通過(guò)制種實(shí)踐總結(jié)得出，‘ 莞綠1 號(hào)’ 水果黃瓜制種成本大約為30 萬(wàn)元·hm，生產(chǎn)種子30 萬(wàn)粒·hm。不同的水果黃瓜新品種需要建立特定的制種技術(shù)，以便其品種推廣應(yīng)用。

為了更好地推廣應(yīng)用‘ 南水6 號(hào)’黃瓜新品種，研究相應(yīng)的配套制種技術(shù)顯得十分重要。筆者研究了授粉時(shí)間、留瓜節(jié)位、留瓜數(shù)、瓜齡和后熟時(shí)間等對(duì)雜交種子的產(chǎn)量和質(zhì)量的影響，以確定‘ 南水6 號(hào)’相應(yīng)的制種技術(shù)，并利用線(xiàn)粒體引物和田間性狀觀察，對(duì)獲得的雜種進(jìn)行純度鑒定。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

本試驗(yàn)于2021 年春季在南京市白馬教學(xué)基地網(wǎng)室進(jìn)行（N31°14’～32°36’,E118°22’～119°14’），母本來(lái)自歐洲雌性系品種‘ NY-2’，父本為來(lái)自‘ 一休小葉’ 的高代自交系‘ NY-m’，雜交種為‘ 南水6號(hào)’。父本提前1 周催芽，播種使用72 孔穴盤(pán)，基質(zhì)為草炭蛭石珍珠巖按照3∶1∶1 比例混合而成。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)和方法

1.2.1 不同授粉時(shí)間處理 選擇開(kāi)花前1 d 的雌雄花套花，分別在開(kāi)花當(dāng)天7:00、8:00、9:00、10:00、11:00、12:00、13:00、14:00、15:00、16:00、17:00、18:00進(jìn)行授粉，3 朵雄花授粉1 朵雌花，授粉過(guò)程均由1人完成，以保證授粉效果一致。

1.2.2 不同留瓜數(shù)和留瓜節(jié)位 留瓜數(shù)設(shè)單株留1個(gè)瓜、留2 個(gè)瓜、留3 個(gè)瓜、留4 個(gè)瓜、留5 個(gè)瓜和留6 個(gè)瓜6 個(gè)處理。采用隨機(jī)區(qū)組試驗(yàn)，各處理選取10株進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，重復(fù)3 次。收瓜后統(tǒng)計(jì)平均單瓜種子數(shù)、單株種子數(shù)和千粒質(zhì)量。留瓜部位分為低節(jié)位（6節(jié)及以下）、中節(jié)位（7～14 節(jié)）和高節(jié)位（15 節(jié)及以上）3 個(gè)處理，每株留3 個(gè)種瓜。

1.2.3 不同瓜齡及后熟處理 瓜齡（從授粉開(kāi)始到采收種瓜的時(shí)間）設(shè)3 個(gè)處理（30，35，40 d），后熟時(shí)間設(shè)4 個(gè)處理（0,5,10,15 d；采瓜齡為40 d 的種瓜）。

1.2.4 苗期線(xiàn)粒體SSR 分子標(biāo)記鑒定 本研究采用改良CTAB 法提取黃瓜DNA：各取父母本2 株，待測(cè)樣品（從種植的F中隨機(jī)選?。?2 株，利用本實(shí)驗(yàn)室研發(fā)引物mtSSR10對(duì)田間栽培的待測(cè)樣品進(jìn)行分子標(biāo)記純度鑒定。以上述提取基因組DNA 為模板進(jìn)行PCR 擴(kuò)增—電泳分離—觀察結(jié)果。參照趙宇優(yōu)化擴(kuò)增程序。將PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物采用1%的瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行分離檢測(cè)，電泳儀調(diào)至210 V，電泳1 h 后，使用硝酸銀染色呈像，觀察父母本及測(cè)定樣品的條帶位置，與測(cè)定樣品的編號(hào)進(jìn)行對(duì)比，進(jìn)行雜種真實(shí)性鑒定。

1.2.5 F植物性狀觀察 對(duì)雜種的鑒定觀察包括對(duì)植株整體性狀的觀察以及對(duì)獲得的F代種子與父母本的對(duì)比觀察。植物的田間性狀觀察采用DUS檢測(cè)方法，基于植物學(xué)性狀對(duì)62 株‘ 南水6 號(hào)’及其父母本進(jìn)行觀察，在相同的栽培條件下，分別從苗期、開(kāi)花期、結(jié)果期等對(duì)待測(cè)樣品進(jìn)行性狀觀察。

1.3 數(shù)據(jù)處理

本試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Excel 進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理，采用SPSS 進(jìn)行方差分析。

2 結(jié)果與分析

本研究獲得了‘ 南水6 號(hào)’F種子，F(xiàn)種子與父本種子在寬度以及千粒質(zhì)量性狀上差異不大，性狀界于雙親之間（表1、圖1）。

表1 F1 和雙親的種子性狀

圖1 F1 和雙親的種子形態(tài)

2.1 授粉時(shí)間對(duì)單瓜種子數(shù)的影響

通過(guò)表2 可知，授粉工作在8:00 以后開(kāi)始，9:00效果最佳，隨后效果逐漸變差，13:00—14:00 效果最差，隨后效果逐漸變好，16:00—17:00 效果接近最好水平。在制種實(shí)踐中，如果工作量大，可延長(zhǎng)至11:00左右或者在16:00 進(jìn)行（表2）。

表2 不同授粉時(shí)間下空氣的溫度、濕度和單瓜種子數(shù)

不同授粉時(shí)間對(duì)種子產(chǎn)量的影響，可能與不同時(shí)間對(duì)應(yīng)的空氣溫濕度等環(huán)境因子不同有關(guān)。黃瓜的授粉效果受溫濕度影響，7:00 溫度較低，加之濕度高，影響雄花散粉，故授粉效果不好。隨后溫度升高，相對(duì)濕度降低，溫度達(dá)到25 ℃左右授粉效果最好，之后濕度有所下降，授粉效果隨之下降。下午隨著溫度下降，授粉效果有所改善。

2.2 留瓜數(shù)和留瓜節(jié)位對(duì)種子產(chǎn)量影響

由表3 可知，單瓜種子數(shù)隨著單株留瓜數(shù)的增加而減少，單株留1 個(gè)瓜獲得的單瓜種子數(shù)量最多，有271 粒，但是單株種子數(shù)最少。單株留6個(gè)瓜獲得的單瓜種子數(shù)最少，僅有146 粒，單株種子數(shù)最多，但是種子千粒質(zhì)量較低，種子質(zhì)量不好。單株留4 個(gè)瓜得到的單瓜種子數(shù)以及單株獲得的種子數(shù)均較高，而且千粒質(zhì)量與單株留1 個(gè)瓜或2 個(gè)瓜差異不大。單株留5 個(gè)瓜得到的千粒質(zhì)量與單株留1 個(gè)瓜或2 個(gè)瓜差異較大。因此，單株留4 個(gè)瓜是‘ 南水6 號(hào)’最理想的留瓜數(shù)。如果種植區(qū)域營(yíng)養(yǎng)條件較好，植株長(zhǎng)勢(shì)較旺盛，可以考慮適當(dāng)增加留瓜數(shù)。

表3 不同留瓜數(shù)平均單瓜種子數(shù)、單株種子數(shù)和千粒質(zhì)量比較

由表4 可知，不同節(jié)位留瓜單瓜種子數(shù)和千粒質(zhì)量有所不同。中節(jié)位留瓜單瓜種子數(shù)和種子的千粒質(zhì)量最好，分別為260 粒和27.8 g。雖然高節(jié)位留瓜的單瓜種子數(shù)和千粒質(zhì)量比中節(jié)位低，但是與中節(jié)位差異性不顯著，在黃瓜制種過(guò)程中，如果營(yíng)養(yǎng)狀況良好，高節(jié)位的瓜可以進(jìn)行授粉處理，以增加種子產(chǎn)量。

表4 不同留瓜部位單瓜種子數(shù)和千粒質(zhì)量比較

2.3 瓜齡和后熟對(duì)種子質(zhì)量的影響

由表5 可知，千粒質(zhì)量和發(fā)芽率隨著瓜齡的增加而提高。瓜齡30 d 和瓜齡40 d 差異顯著，瓜齡30 d和瓜齡35 d 差異不顯著，瓜齡30 d 較瓜齡40 d，數(shù)據(jù)較低，差異顯著。因此，適當(dāng)延長(zhǎng)坐瓜時(shí)間可以提高制種產(chǎn)量。筆者在實(shí)踐中發(fā)現(xiàn)，春季瓜齡不宜過(guò)長(zhǎng)，否則容易出現(xiàn)瓜內(nèi)發(fā)芽現(xiàn)象。

表5 不同瓜齡的種子千粒質(zhì)量、發(fā)芽勢(shì)和發(fā)芽率比較

由表6 可知，后熟可以提高種子千粒質(zhì)量、發(fā)芽勢(shì)以及發(fā)芽率，后熟5 d 及以上的種子千粒質(zhì)量都在27 g 以上，而發(fā)芽率都超過(guò)81%。其中以后熟10 d處理種子質(zhì)量為最好，千粒質(zhì)量達(dá)30.4 g，發(fā)芽勢(shì)為95.2%，發(fā)芽率可達(dá)90.0%，而未后熟種子千粒質(zhì)量?jī)H為25.2 g，發(fā)芽勢(shì)為79.3%，發(fā)芽率僅為86.7%，兩者差異達(dá)顯著水平。后熟15 d 處理的種子千粒質(zhì)量、發(fā)芽勢(shì)以及發(fā)芽率均較后熟10 d 低，有下降趨勢(shì)，但千粒質(zhì)量差異不顯著。

表6 不同后熟天數(shù)的種子千粒質(zhì)量、發(fā)芽率和發(fā)芽勢(shì)比較

2.4 純度鑒定

2.4.1 苗期線(xiàn)粒體SSR 分子標(biāo)記鑒定 利用引物mtSSR10 對(duì)田間栽培的待測(cè)樣品進(jìn)行分子標(biāo)記純度鑒定，擴(kuò)增電泳結(jié)果如圖2 所示，61 個(gè)檢測(cè)樣品中，有個(gè)1 樣品電泳條帶與母本一致，60 個(gè)樣品電泳條帶與父本一致，表明60 粒種子為真雜種F‘ 南水6 號(hào)’，1 粒種子可能為母本自交種（假雜種）。拔除該單株后，剩余60 株繼續(xù)進(jìn)行田間性狀觀察鑒定。

圖2 引物mtSSR10 對(duì)‘南水6 號(hào)’純度檢測(cè)

2.4.2 F植物性狀觀察 從兩葉一心時(shí)期開(kāi)始對(duì)父母本以及F進(jìn)行性狀觀察（表7）。統(tǒng)計(jì)對(duì)比后發(fā)現(xiàn)，‘ 南水6 號(hào)’ 與其母本第一分枝節(jié)位、分枝性、葉毛數(shù)量以及果實(shí)性狀等方面存在差異，利用具有多態(tài)性的性狀進(jìn)行田間鑒定，鑒定結(jié)果為100 %。

表7 黃瓜植株差異性狀田間調(diào)查結(jié)果

3 結(jié)論與討論

‘ 南水6 號(hào)’最佳授粉時(shí)間為9:00 前后，其次是16:00 左右，留瓜節(jié)位以中部節(jié)位（7～14 節(jié)）為宜，單株留瓜數(shù)為4 個(gè)。‘ 南水6 號(hào)’種瓜采收時(shí)間為花后40 d，后熟時(shí)間以10 d 為宜。

利用mtSSR10 檢測(cè)種子純度以及全生育期采用差異性狀進(jìn)行田間種子純度鑒定，鑒定出本次‘ 南水6 號(hào)’制種純度為98.4%。

3.1 授粉時(shí)間對(duì)種子產(chǎn)量的影響

黃瓜雜交過(guò)程中，授粉的質(zhì)量直接影響種子的產(chǎn)量和質(zhì)量。授粉質(zhì)量除了受自身因素影響，如柱頭生長(zhǎng)狀況、雄花的花粉質(zhì)量等，還受外界環(huán)境的影響，其中溫度和濕度是主要的影響因素。受精能力受溫濕度的影響較大。授粉時(shí)，應(yīng)盡量在最佳授粉溫度內(nèi)進(jìn)行授粉工作，以達(dá)到最佳的授粉效果。最佳授粉時(shí)間為9:00—11:00。陳正武等從試驗(yàn)中得出，人工授粉時(shí)，最佳授粉時(shí)間是8:00—11:00，其中9:00 左右授粉，獲得的種子產(chǎn)量和質(zhì)量最高，此時(shí)溫度是25°C 左右，黃瓜雌蕊雄蕊的開(kāi)花散粉狀態(tài)較好，花粉活力高，萌發(fā)力強(qiáng)。而11:00 以后，隨著溫度的升高，花粉、柱頭活力減弱，授粉效果不佳。本研究發(fā)現(xiàn)，16:00 時(shí)授粉也可以獲得理想的授粉效果。

3.2 留瓜節(jié)位和留瓜數(shù)對(duì)種子產(chǎn)量的影響

本試驗(yàn)表明，留瓜節(jié)位和留瓜數(shù)與‘ 南水6 號(hào)’制種產(chǎn)量和質(zhì)量有關(guān)。康高強(qiáng)等研究表明，中部節(jié)位的種瓜質(zhì)量和種子數(shù)最高，低節(jié)位或高節(jié)位制種，種子的發(fā)芽率、發(fā)芽勢(shì)、千粒質(zhì)量等較差。楊森等通過(guò)對(duì)黃瓜單瓜種子數(shù)及千粒質(zhì)量的分析總結(jié)出，種子數(shù)和千粒質(zhì)量最高的來(lái)自中部節(jié)位的瓜，且種子變異指數(shù)較??；種子數(shù)和千粒質(zhì)量最小的來(lái)自低節(jié)位的瓜，變異指數(shù)較大；高節(jié)位留瓜的變異指數(shù)最大。黃瓜中部節(jié)位的種瓜，發(fā)育時(shí)溫度可能最適宜。種子數(shù)隨著留瓜數(shù)的增加而增加，但是隨著留瓜數(shù)的數(shù)量增加，種子的千粒質(zhì)量有所下降；單株留1 個(gè)瓜雖然千粒質(zhì)量較高，但是種子產(chǎn)量較低，制種成本高。通過(guò)本試驗(yàn)可知，單株留4 個(gè)種瓜可以收獲理想的制種產(chǎn)量和質(zhì)量；如果留瓜過(guò)多，植株的營(yíng)養(yǎng)消耗大，種瓜營(yíng)養(yǎng)供給不充分，種子產(chǎn)量和質(zhì)量反而會(huì)下降。

3.3 種瓜瓜齡和后熟對(duì)種子質(zhì)量的影響

潘耀平等研究認(rèn)為，種子成熟度表現(xiàn)在種子千粒質(zhì)量及種子質(zhì)量方面。若種子完全成熟，表現(xiàn)為種子千粒質(zhì)量高、種子大小一致、飽滿(mǎn)，種子質(zhì)量高。成俊蘭等認(rèn)為，未完全成熟的種子風(fēng)干后，雖然種子外觀各項(xiàng)指標(biāo)與成熟種子相比并無(wú)明顯差異，但種子內(nèi)部中空，在后期發(fā)芽率試驗(yàn)中表明種子質(zhì)量較差。本試驗(yàn)結(jié)果證明，‘ 南水6 號(hào)’瓜齡在40 d 后采摘，可以獲得最理想的種子產(chǎn)量和質(zhì)量?！?南水6號(hào)’在50 d 左右采摘的種瓜內(nèi)部出現(xiàn)了瓜內(nèi)發(fā)芽的現(xiàn)象，這可能與春季制種后期溫度升高有關(guān)。

通過(guò)后熟種子可以吸收種瓜內(nèi)的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，促進(jìn)種子發(fā)育，改善種子質(zhì)量，也可以解決因惡劣天氣或栽培因素導(dǎo)致的種瓜過(guò)早采摘和種子未成熟的問(wèn)題。聶小蘭等發(fā)現(xiàn)，后熟10 d 左右可提高種子的千粒質(zhì)量、發(fā)芽率，以及發(fā)芽勢(shì)，種子質(zhì)量最好，本研究的結(jié)果與之一致。龐金安等也認(rèn)為，后熟時(shí)間過(guò)長(zhǎng)會(huì)降低種子質(zhì)量，本研究也得到類(lèi)似的結(jié)果，即后熟時(shí)間多于10 d 時(shí)，種子千粒質(zhì)量和發(fā)芽率有下降趨勢(shì)，甚至出現(xiàn)種子在果實(shí)內(nèi)發(fā)芽的現(xiàn)象。

3.4 種子純度分析

‘ 南水6 號(hào)’的種子生產(chǎn)過(guò)程中，其假雜種主要來(lái)自于母本自交種，假雜種的電泳條帶應(yīng)該與母本一致，而F真雜種嚴(yán)格遵循線(xiàn)粒體父系遺傳特性，其條帶應(yīng)與父本一致。通過(guò)本試驗(yàn)驗(yàn)證，1 粒種子可能為母本自交種（假雜種），原因可能是制種的母本在生長(zhǎng)前期受環(huán)境等因素影響出現(xiàn)雄花，沒(méi)有及時(shí)去除。

田間性狀觀察對(duì)黃瓜種子純度有良好的鑒定作用。研究結(jié)果可以看出，‘ 南水6 號(hào)’與其母本第一分枝節(jié)位、分枝性、葉毛數(shù)量、果實(shí)性狀等方面存在差異，種子性狀處于父母本中間型。研究還發(fā)現(xiàn)，春季母本植株偶爾出現(xiàn)雄花，秋季母本出現(xiàn)較多雄花。這可能與高溫容易誘導(dǎo)黃瓜出現(xiàn)雄性花原基分化有關(guān)。制種過(guò)程中出現(xiàn)雄花會(huì)對(duì)制種質(zhì)量產(chǎn)生影響，因此，‘ 南水6 號(hào)’制種最好在春季進(jìn)行。