不同年齡段放牧牦牛生長發(fā)育及肌內(nèi)脂肪沉積規(guī)律研究

柏 琴 張翔飛 羅曉林 官久強 安添午 趙洪文 李華德 周建旭 朱友軍 謝榮清 黃艷玲*

(1.西南民族大學畜牧獸醫(yī)學院，成都 610041；2.四川省草原科學研究院，成都 611731；3.小金縣科學技術(shù)和農(nóng)業(yè)畜牧水務(wù)局，小金 624200)

肉類食品是人類飲食結(jié)構(gòu)中最重要的一類，也是攝取營養(yǎng)物質(zhì)的重要來源。隨著現(xiàn)代生活水平的提高，人們越來越關(guān)注肉產(chǎn)品的品質(zhì)，不僅注重食用品質(zhì)，同時強調(diào)肉的保健功能。牛肉因其高蛋白質(zhì)、低脂肪、富含煙酸、鐵等營養(yǎng)成分而倍受消費者青睞[1]。目前我國已成為世界第四大牛肉生產(chǎn)國，第二大牛肉消費國和第一大肉牛進口國，但從人均牛肉占有量來看，我國仍遠低于發(fā)達國家水平乃至世界平均水平，牛肉需求缺口巨大。

牦牛(Bosgrunniens)是青藏高原及其毗鄰地區(qū)的主要畜種之一，其肉、奶產(chǎn)品是當?shù)匦竽翗I(yè)經(jīng)濟發(fā)展和牧民增收的重要來源。牦牛肉產(chǎn)品具有營養(yǎng)豐富，富含必需氨基酸、不飽和脂肪酸、礦物質(zhì)，天然無污染等特點[2]，是藏區(qū)牧民飲食中動物性蛋白質(zhì)的主要來源，也是我國牛肉市場的重要供給保障。然而，現(xiàn)階段牦牛養(yǎng)殖仍多采用“靠天養(yǎng)畜”的傳統(tǒng)放牧模式，生產(chǎn)周期長、效率低，并且牦牛肉在食用品質(zhì)方面如肌肉嫩度、系水力等相對肉牛品種較差[3]，一定程度上制約了牦牛產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。因此，牦牛肌肉品質(zhì)的研究是推動當前高原畜牧業(yè)發(fā)展的重要方向。

脂肪廣泛分布于機體的各種組織，在動物生命活動中起到關(guān)鍵作用，包括應對饑餓、哺乳和肉產(chǎn)品改善等[4]。動物機體脂肪的沉積是脂肪合成與分解代謝動態(tài)平衡的結(jié)果，也是供能物質(zhì)的攝入量與機體能量消耗之間的平衡狀態(tài)，此過程受一系列激素和脂肪代謝酶的共同作用。脂肪在肌肉內(nèi)沉積形成肌內(nèi)脂肪(intramuscular fat，IMF)，俗稱大理石花紋，主要成分是磷脂(存在于細胞膜中)和甘油三酯(脂滴)，分布于肌外膜、肌束膜與肌內(nèi)膜。有研究表明，IMF含量、脂肪酸組成與肉品質(zhì)的剪切力、嫩度、風味、感官評分密切相關(guān)[5]。IMF因夾在肌周結(jié)締組織中削弱了膠原纖維之間的關(guān)聯(lián)，減少了破壞結(jié)締組織所需的力量，從而可提高肉的嫩度[6]。同時，IMF中所含的脂溶性成分及其降解物(如醛和醇)可提高肉品的風味。由此可見，IMF沉積在肉品質(zhì)改善方面發(fā)揮了重要作用。石斌剛[7]研究發(fā)現(xiàn)，犢牛、青年牛和成年牛的肉品質(zhì)存在顯著差異，表明年齡對牦牛肉品質(zhì)有顯著影響。牦牛生長發(fā)育過程中IMF沉積的時序及其營養(yǎng)代謝規(guī)律如何，目前鮮有報道。鑒于此，本研究選擇不同年齡段的放牧牦牛，研究其生長發(fā)育和IMF沉積規(guī)律，以期為提高牦牛肉品質(zhì)的研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗設(shè)計

本試驗從四川省草原科學研究院紅原牦牛科技園區(qū)隨機選取不同年齡段(0.5、1.5、2.5、3.5、4.5歲)的健康麥洼公牦牛作為研究對象，每個年齡段6頭，共30頭牦牛。試驗牛均在同一天然牧場內(nèi)放牧，飼養(yǎng)管理條件一致，冬季補飼少量青干草以避免牛只過度掉膘死亡。

1.2 樣品采集和檢測指標

1.2.1 體重測定

利用牛用電子稱測定不同年齡段牦牛晨牧前體重。

1.2.2 血清生化指標測定

晨牧前采集各年齡段牦牛頸靜脈血，靜置后離心分離血清，-80 ℃凍存，待測血清生化指標。

血清代謝物含量：利用全自動生化分析儀(Chemray 800，深圳雷杜生命科學股份有限公司)測定血清葡萄糖(GLU)、尿素氮(UN)、白蛋白(ALB)、總蛋白(TP)、球蛋白(GLB)、甘油三酯(TG)、膽固醇(CHO)含量；血清非酯化脂肪酸(NEFA)、β-羥基丁酸(BHBA)含量采用酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)法通過酶標儀(Epoch，BioTek，美國)測定，試劑盒購自上海酶聯(lián)生物科技有限公司，操作步驟試劑盒說明書執(zhí)行。

血清能量代謝相關(guān)激素水平：采用ELISA法通過酶標儀(Epoch，BioTek，美國)測定血清脂聯(lián)素(APN)、胰高血糖素(GLN)、胰島素樣生長因子-Ⅰ(IGF-Ⅰ)、胰島素(INS)、瘦素(LEP)、抵抗素(RETN)水平，試劑盒購自上海酶聯(lián)生物科技有限公司。

1.2.3 肌肉品質(zhì)測定

對各年齡段牦牛進行統(tǒng)一屠宰，屠宰前禁食24 h，屠宰后采集背最長肌(第12～13肋骨處)樣品，用于肉質(zhì)性狀(pH、熟肉率、剪切力)和營養(yǎng)成分(IMF、脂肪酸)含量測定。使用在pH 4.0和7.0緩沖液中校準過的pH計(pHS-3D型，雷磁，上海)分別測定宰后1 h和4 ℃冰箱保存24 h肌肉的pH；將肉樣在80 ℃的恒溫水浴鍋加熱至肉樣中心溫度為70 ℃，冷卻后，沿肌纖維平行方向截取肉柱(寬1.0 cm、厚1.0 cm)后用CLM-3B數(shù)顯式型肌肉嫩度儀測定其剪切力；參照Li等[8]的稱重法測定肌肉的熟肉率。樣品將經(jīng)過預處理后，采用索氏脂肪抽提法測定IMF含量。采用氣相色譜(gas chromatography,GC)法測定肌肉中脂肪酸組成，測定方法參考文獻[9]。

1.2.4 肌肉中脂肪代謝關(guān)鍵酶活性測定

另采集牛背最長肌肉(第12～13肋骨處)樣品，立即放于液氮保存，用于脂肪代謝關(guān)鍵酶活性測定。取適量肌肉樣品，用4倍勻漿介質(zhì)研磨，然后將研磨液3 000～4 000 r/min離心10 min，取上清制備成20%的組織勻漿，分析其中脂肪合成關(guān)鍵酶——乙酰輔酶A羧化酶(ACC)、脂肪酸合成酶(FAS)、二酰甘油?；D(zhuǎn)移酶-1(DGAT-1)、硬脂酰輔酶A去飽和酶(SCD)、脂蛋白脂酶(LPL)與脂肪分解關(guān)鍵酶——激素敏感脂肪酶(HSL)、脂酰輔酶A氧化酶(ACOX)、肉堿脂酰轉(zhuǎn)移酶-Ⅰ(CPT-Ⅰ)活性，采用ELISA法測定，試劑盒購自上海酶聯(lián)生物科技有限公司，具體操作步驟按照使用說明書。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

試驗數(shù)據(jù)經(jīng)Excel 2010初步整理后，利用SAS 9.4統(tǒng)計軟件的one-way ANOVA程序進行方差分析，采用Student-Newman-Keuls(SNK)模型進行組間多重比較，結(jié)果變異程度以均值標準誤(SEM)表示，以P<0.05為差異顯著。

2 結(jié) 果

2.1 不同年齡段牦牛體重比較

由圖1可知，隨著年齡的增長，牦牛體重顯著增加(P<0.05)。

數(shù)據(jù)柱形標注不同字母表示差異顯著(P<0.05)。圖2同。

2.2 不同年齡段牦牛血清代謝物含量比較

由表1可知，血清UN含量隨著牦牛年齡的增長先升高后趨于平穩(wěn)，2.5、3.5和4.5歲牦牛血清UN顯著高于0.5歲牦牛(P<0.05)；2.5和4.5歲牦牛血清CHO含量顯著高于0.5歲牦牛(P<0.05)，且2.5歲牦牛還顯著高于1.5歲牦牛(P<0.05)；所測其他血清代謝物含量在不同年齡段牦牛之間無顯著差異(P>0.05)。

表1 不同年齡段牦牛血清代謝物含量比較

2.3 不同年齡段牦牛血清能量代謝相關(guān)激素水平比較

由表2可知，4.5歲牦牛血清INS水平顯著高于0.5、1.5和2.5歲牦牛(P<0.05)，3.5與4.5歲牦牛之間無顯著差異(P>0.05)；血清LEP水平隨著牦牛年齡的增長而升高，其中2.5、3.5和4.5歲牦牛顯著高于0.5歲牦牛(P<0.05)，4.5歲牦牛顯著高于1.5歲牦牛(P<0.05)；血清GLN、IGF-Ⅰ和RETN水平隨著牦牛年齡的增長雖有波動但整體上呈逐漸降低趨勢，其中3.5和4.5歲牦牛血清GLN、RETN水平顯著低于1.5歲牦牛(P<0.05)，2.5、3.5和4.5歲牦牛血清IGF-Ⅰ水平顯著低于0.5和1.5歲牦牛(P<0.05)；血清APN水平在不同年齡段牦牛之間無顯著差異(P>0.05)。

表2 不同年齡段牦牛血清能量代謝相關(guān)激素水平比較

2.4 不同年齡段牦牛肌肉品質(zhì)比較

由表3可知，牦牛肌肉的剪切力隨著年齡的增長逐漸增大，其中0.5和1.5歲牦牛顯著低于4.5歲牦牛(P<0.05)，而2.5、3.5和4.5歲牦牛之間差異不顯著(P>0.05)；牦牛肌肉的熟肉率隨著年齡的增長有所降低，但各年齡段牦牛之間差異不顯著(P>0.05)；各年齡段牦牛肌肉pH1 h無顯著差異(P>0.05)，平均值為6.68；牦牛肌肉pH24 h表現(xiàn)為3.5和4.5歲牦牛顯著高于0.5歲牦牛(P<0.05)，平均值為5.70，從宰后1 h到4 ℃冰箱保存24 h，肌肉pH平均下降0.98。

表3 不同年齡段牦牛肌肉品質(zhì)比較

2.5 不同年齡段牦牛肌肉IMF含量和脂肪酸組成比較

如圖2可知，隨著牦牛年齡的增長，IMF含量逐漸增加，其中4.5歲牦牛顯著高于0.5、1.5和2.5歲牦牛(P<0.05)，4.5和3.5歲牦牛之間差異不顯著(P>0.05)。

圖2 不同年齡段牦牛肌肉IMF含量比較

由表4可知，牦牛肌肉飽和脂肪酸、不飽和脂肪酸等組成和含量在不同年齡段牦牛之間均無顯著差異(P>0.05)。

表4 不同年齡段牦牛肌肉脂肪酸組成比較

2.6 不同年齡段牦牛肌肉中脂肪代謝關(guān)鍵酶活性比較

由表5可知，在肌肉中脂肪合成代謝關(guān)鍵酶方面：1.5、2.5、3.5和4.5歲牦牛ACC活性顯著高于0.5歲牦牛(P<0.05)；3.5和4.5歲牦牛DGAT-1活性顯著高于0.5和1.5歲牦牛(P<0.05)；FAS與SCD活性在各年齡段牦牛之間無顯著差異(P>0.05)；LPL活性隨著牦牛年齡的增長而升高，其中4.5歲牦牛顯著高于0.5、1.5歲牦牛(P<0.05)，2.5、3.5和4.5歲牦牛之間無顯著差異(P>0.05)。在肌肉中脂肪分解代謝關(guān)鍵酶方面：HSL活性隨著牦牛年齡的增長總體呈現(xiàn)降低的趨勢，其中1.5歲牦牛顯著高于3.5歲牦牛(P<0.05)，2.5、3.5和4.5歲牦牛之間無顯著差異(P>0.05)；ACOX、CPT-Ⅰ活性在不同年齡段牦牛之間無顯著差異(P>0.05)。

表5 不同年齡段牦牛肌肉中脂肪代謝關(guān)鍵酶活性比較

3 討 論

3.1 不同年齡段牦牛生長發(fā)育與血清激素水平變化

體重作為家畜生產(chǎn)性能的重要數(shù)量指標和經(jīng)濟指標，直接反映了動物的生長發(fā)育情況。本研究中，隨著年齡的增長，牦牛的體重顯著增加，說明年齡對牦牛生長發(fā)育有顯著影響。石斌剛[7]對放牧條件下6、30和54月齡牦牛進行了比較，發(fā)現(xiàn)牦牛在6～30月齡段生長速度比30～54月齡段快，即6～30月齡段是牦牛主要的生長發(fā)育段。本研究也發(fā)現(xiàn)，隨著牦牛生長期的延長，生長速度呈現(xiàn)前期快后期慢的特點，其中以1.5～2.5歲段生長速度最快。

血液中TG、CHO、NEFA和BHBA含量能夠反映機體脂肪代謝和能量平衡狀態(tài)[10]。TG是動物貯存脂肪的主要形式，動物機體可分解TG為NEFA，再通過血液循環(huán)為機體供能[11]。CHO由高密度脂蛋白膽固醇、低密度脂蛋白膽固醇、極低密度脂蛋白膽固醇等組成，在機體脂肪代謝與能量代謝過程發(fā)揮重要作用。有研究表明血液CHO含量與肌肉IMF含量呈顯著正相關(guān)關(guān)系[12]。在本研究中，0.5、1.5及2.5歲牦牛血清CHO含量逐漸增加，并在2.5歲時達到峰值，顯著高于0.5和1.5歲牦牛，而與3.5和4.5歲牦牛無顯著差異，表明在2.5歲前血清CHO含量隨年齡的增加逐漸升高，而在2.5歲以后血清CHO含量相對穩(wěn)定，該結(jié)果也與本試驗中IMF沉積結(jié)果相符。血清UN含量的高低可以反映動物體內(nèi)蛋白質(zhì)代謝和氨基酸的平衡狀況。本研究結(jié)果顯示，牦牛血清UN含量隨著年齡的增長先升高后趨于平穩(wěn)，推測與幼齡牦牛早期肌肉組織發(fā)育的大量蛋白質(zhì)、氨基酸需求，以及隨著年齡增長機體生長發(fā)育成熟，牧草采食量提高和瘤胃發(fā)酵功能逐漸完善，提供了更多可吸收利用的氨氮有關(guān)。

脂肪沉積是脂肪合成與分解代謝的一種平衡狀態(tài)，受到各類激素、因子的調(diào)控作用[13]。在脂肪合成代謝中，INS有顯著的促進作用，將能量以脂肪形式儲存起來，使血液中游離脂肪酸(FFA)含量減少，同時抑制脂肪的分解，主要通過誘導脂肪酸合成過程中的關(guān)鍵酶ACC和FAS表達，從而促進脂肪沉積[14]。LEP水平與動物機體脂肪含量密切相關(guān)，研究發(fā)現(xiàn)，當哺乳動物能量攝入平衡時，體脂增加，會促使脂肪細胞LEP分泌增多[15]。本試驗中，牦牛血清INS和LEP水平隨年齡的增長而逐漸升高，并且INS水平表現(xiàn)為4.5歲牦牛顯著高于0.5、1.5和2.5歲牦牛，而LEP水平表現(xiàn)為4.5歲牦牛顯著高于0.5和1.5歲牦牛，說明牦牛機體對脂肪沉積的促進調(diào)控主要在生長發(fā)育后期。GLN與IGF-Ⅰ同樣是機體能量代謝調(diào)控的重要激素，研究表明GLN能夠顯著促進脂肪分解代謝關(guān)鍵酶HSL表達[16]，從而促進脂肪分解，而IGF-Ⅰ具有促進蛋白質(zhì)合成、刺激肌肉生長、抑制脂肪積累的生物學功能。本研究發(fā)現(xiàn)牦牛血清GLN、IGF-Ⅰ水平在2.5～4.5歲間顯著降低，亦表明機體脂肪沉積的負向調(diào)控減弱。近年來，RETN與脂肪代謝的關(guān)系成為研究熱點，劉小平等[17]認為RETN與動物肌內(nèi)脂肪沉積密切相關(guān)。在本研究中，血清RETN水平在牦牛3.5～4.5歲時顯著低于1.5歲時，提示RETN對牦牛IMF沉積可能存在負調(diào)控。

3.2 不同年齡段牦牛肌肉品質(zhì)與IMF沉積規(guī)律分析

在肌肉品質(zhì)研究中，牛肉的嫩度、多汁性是決定其品質(zhì)的關(guān)鍵因素，而肉產(chǎn)品嫩度的評定通常用剪切力反映，它的大小與嫩度呈負相關(guān)。本研究中，隨著牦牛年齡的增長，背最長肌的剪切力逐漸增大，2.5、3.5和4.5歲牦牛肌肉剪切力顯著高于0.5歲牦牛，牛肉嫩度逐漸下降，表明年齡影響了牦牛肉品質(zhì)，年齡增長會引起牛肉嫩度和品質(zhì)下降，這與付洋洋[18]研究發(fā)現(xiàn)的舍飼牦牛肉剪切力隨著年齡增長逐漸增大的結(jié)果一致。由此可見，牦牛的飼養(yǎng)并非年齡越大越好，飼養(yǎng)周期過長、出欄年齡過大會影響牦牛肉產(chǎn)品品質(zhì)。熟肉率是衡量肌肉在蒸煮過程中損失狀況的指標，其值越大，肉質(zhì)保水性越好，咀嚼時越多汁[19]。本研究中，隨著牦牛年齡的增長，肌肉熟肉率逐漸降低，但各年齡段牦牛之間差異不顯著，表明肌肉熟肉率受到年齡影響，但作用效果較小。

肌肉中的脂肪含量、脂肪酸組成與肉品質(zhì)密切相關(guān)[20]。動物在整個生長過程中，青年時期側(cè)重于骨骼與肌肉的發(fā)育，生長速度較快，前期主要是蛋白質(zhì)沉積，性成熟過后生長速度變緩，逐漸由蛋白質(zhì)沉積為主轉(zhuǎn)變?yōu)橹境练e為主[21]。Setiyono等[22]報道，年齡對肌肉蛋白質(zhì)沉積的影響較小，而對肌肉脂肪沉積的影響較大。本研究發(fā)現(xiàn)，隨著年齡的增長，牦牛肌肉IMF含量逐漸增加，并且3.5和4.5歲牦牛顯著高于0.5和1.5歲牦牛。徐瑛[23]比較了放牧條件下不同年齡(3～7歲)牦牛的IMF含量，結(jié)果表明，隨著年齡的增長，牦牛肉中脂肪含量更加豐富，與本研究結(jié)果相似。這提示，隨著年齡的增長，牦牛機體在能量代謝相關(guān)激素的調(diào)控下，脂肪合成代謝得到促進，肌肉中IMF含量增加。

在評價肉品質(zhì)時，脂肪酸組成是一個重要的指標[24]，IMF中脂肪酸的種類和比例不僅對風味物質(zhì)的影響很大[25]，而且也是人體必需的營養(yǎng)素，具有較高的營養(yǎng)價值[26]。Cho等[27]對不同年齡段韓國肉牛背最長肌脂肪酸組成進行分析后發(fā)現(xiàn)，各年齡段之間脂肪酸組成差異不顯著。付洋洋[18]比較了舍飼條件下1.5、2.5和4.5歲牦牛肉的脂肪酸組成，發(fā)現(xiàn)各組間無顯著變化。同時，Zorzi等[28]研究表明，內(nèi)洛爾牛的同一部位間脂肪酸組成差異極小。本研究中，放牧條件下不同年齡段牦牛之間背最長肌中脂肪酸組成同樣沒有顯著差異，表明牦牛IMF沉積過程中各類型脂肪酸是同步沉積的，在比例上無顯著變化。

3.3 不同年齡段牦牛肌肉中脂肪代謝關(guān)鍵酶活性分析

脂肪合成和分解是在一系列關(guān)鍵酶的參與和催化下完成的，這些關(guān)鍵酶活性的高低影響組織中脂肪的合成、分解和轉(zhuǎn)運[29]。動物機體可改變脂肪合成酶和分解酶的數(shù)量與活性、脂肪運輸體的數(shù)量及運輸方向，進而實現(xiàn)對脂肪沉積的調(diào)控[30]。Herrera-Marcos等[31]、Gamarra等[32]研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)AS、ACC、SCD、DGAT-1都是脂肪合成代謝的正向促進因子，其中ACC催化脂肪酸合成的第1步反應，是脂肪酸合成過程的限速酶；DGAT-1作為?；D(zhuǎn)移酶，以甘油和脂肪酸為底物，催化甘油三酯的合成，在快速生長期其表達水平增高；LPL是脂肪轉(zhuǎn)運的關(guān)鍵酶，其活性是判斷FFA流向的有效標志，活性高說明體內(nèi)FFA向脂肪組織匯集而進行脂質(zhì)集聚和能量儲備[33]。在本研究中，隨著年齡的增長，牦牛肌肉中ACC、DGAT-1和LPL活性逐漸增加，并在3.5～4.5歲段達到高峰，說明隨著年齡的增長，脂肪合成速度得到增強，促進了牦牛肌肉中的脂肪合成，這與肌肉IMF含量結(jié)果相一致。同時，Rumberger等[34]研究表明ACC的活性隨INS含量的升高而升高，二者呈線性正相關(guān)，本試驗也表現(xiàn)出類似結(jié)果。FAS是一種多功能的復合酶，其活性的高低對控制動物體脂肪沉積發(fā)揮重要作用，F(xiàn)AS具有催化丙二酸單酰輔酶A合成脂肪酸的功能，因此提高FAS的活性可促進脂肪沉積[35]；SCD是哺乳動物飽和脂肪酸脫氫形成單不飽和脂肪酸的限速酶。本研究中，F(xiàn)AS和SCD活性在各年齡段之間無顯著差異。此外，脂肪分解關(guān)鍵酶也可調(diào)控IMF沉積，HSL、CPT-1都是脂肪分解或脂肪酸氧化的正向促進因子[36]，HSL啟動分解脂肪組織中的TG釋放出FFA，是調(diào)控能量平衡的關(guān)鍵酶和限速酶[37]，對細胞內(nèi)調(diào)節(jié)TG含量起重要作用；CPT-1是脂肪酸氧化的限速酶之一，主要功能使脂肪酸發(fā)生β氧化[38]。本研究中，3.5歲牦牛肌肉HSL活性顯著低于1.5歲牦牛，表明3.5歲牦牛的脂肪分解能力受到抑制。姚飛[39]研究了蘇尼特羊發(fā)育階段對IMF沉積的影響，發(fā)現(xiàn)IMF含量增加的同時HSL活性逐漸降低、FAS活性升高，與本研究結(jié)果相一致。由此可見，隨著年齡的增長，牦牛肌肉中脂肪合成關(guān)鍵酶活性升高，而脂肪分解關(guān)鍵酶活性降低，從而促進肌肉IMF的沉積。

4 結(jié) 論

① 隨著年齡的增長和體重的增加，牦牛自2.5歲起肌肉IMF開始快速沉積，至3.5～4.5歲時達到IMF沉積旺盛期。

② 牦牛機體通過能量代謝相關(guān)激素、因子作用于肌肉脂肪代謝途徑，提升脂肪合成代謝關(guān)鍵酶ACC、DGAT-1、LPL的活性，抑制脂肪分解代謝關(guān)鍵酶HSL的活性，從而促進肌肉IMF的沉積。