黨參青霉病病原菌鑒定及生物學(xué)特性

呂丙鈺，楊董云，薛華麗，楊志敏

（1.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)理學(xué)院，甘肅 蘭州 730070；2.蘭州市食品藥品檢驗(yàn)檢測研究院，甘肅 蘭州 730070）

黨參（Codonopsis Penicilliosis（Franch.）Nannf.）是我國傳統(tǒng)的中藥材，屬于桔?？贫嗄晟荼局参?。性平、味甘，具有補(bǔ)中益氣，健脾益肺之功效［1］。還具有免疫調(diào)節(jié)、改善胃潰瘍、抗炎、抗氧化、調(diào)節(jié)糖脂代謝及抗腫瘤等多種藥理作用［2］。據(jù)研究，黨參富含生物堿、聚炔類、木質(zhì)素類、黃酮類化合物和多糖等活性成分［3］。

隨著黨參栽培面積的不斷擴(kuò)大，黨參病害已經(jīng)成為制約其產(chǎn)量與品質(zhì)的關(guān)鍵因素。目前，已報(bào)道的黨參的病害有Septoria codonopsidis Ziling引起的斑枯病、Botrytis cinerea Pers.引起的灰霉病、Fu?sarium oxysporum Schl.引起的根腐病、Sphaero?theca codonopisi（Golov.）Z.Y.Zhao引起的白粉病、Puccinia campanumoeae Pat.引起的銹病、Helicoba?sidium mompa Tanaka引起的紫紋羽?。?-5］等。然而，上述病害的研究主要集中在田間，即采收之前。對(duì)黨參采后青霉病的報(bào)道甚少，陳娟等［6］調(diào)查了江西藥材市場7種藥材飲片，其中6種藥材如：甘草、黃芩、巴戟天、白術(shù)、當(dāng)歸、黨參中均存在青霉屬真菌的污染，且均分離出皮落青霉（Penicillium crustosum）。在甘肅，黨參的采收期正值10月中下旬，處于低溫高濕的季節(jié)，而當(dāng)?shù)氐霓r(nóng)民采收后通常會(huì)選擇自然晾干，然而，不利的外界環(huán)境條件極易導(dǎo)致新鮮黨參在采后發(fā)病，且病害主要為青霉病，農(nóng)民針對(duì)這些病害的主要處理措施僅是局限于簡單的水洗，或者刷掉發(fā)病處表面的菌落，黨參表面的病原菌雖然可以清除，但是致病菌產(chǎn)生的毒素會(huì)在黨參體內(nèi)大量積累。黨參作為一種藥食同源的植物，這不僅嚴(yán)重影響黨參的品質(zhì)，重要的是，會(huì)對(duì)人體健康帶來巨大的威脅。

據(jù)報(bào)道，大部分青霉屬病原菌均可代謝產(chǎn)生棒曲霉素（patulin）［7］。而棒曲霉素具有致畸、致癌、影響生育和免疫抑制等毒理作用［8］。世界上很多國家都對(duì)果汁產(chǎn)品中棒曲霉素的最大限量做了規(guī)定，如歐盟（European Union，EU）、美國食品與藥物管理局（USFood and Drug Database，USFDA）規(guī)定果汁產(chǎn)品中棒曲霉素的最大限量為50μg/kg［9-10］，世界衛(wèi)生組織（World Health Organization，WHO）建議正常人每天棒曲霉素的攝入量不超過0.4μg/kg體質(zhì)量［11］。然而，對(duì)中草藥中棒曲霉素的限量標(biāo)準(zhǔn)，目前尚未見報(bào)道。

本試驗(yàn)對(duì)甘肅省黨參青霉病病原菌進(jìn)行分離純化，通過形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)技術(shù)對(duì)病原菌進(jìn)行鑒定，并對(duì)病原菌的生物學(xué)特性以及產(chǎn)毒情況進(jìn)行研究，該研究可為后期病害的綜合防治提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 樣本采集

黨參采收自甘肅省定西市岷縣的黨參種植基地，裝袋后24 h內(nèi)運(yùn)往甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)理學(xué)院化學(xué)生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室，室溫貯藏，待其自然發(fā)病。

1.2 培養(yǎng)基

PDA培養(yǎng)基：馬鈴薯200 g，葡萄糖10 g，瓊脂17 g，水1 000 mL；察氏培養(yǎng)基：NaNO33 g，KH2PO41 g，KCl 0.5 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，F(xiàn)eSO40.01 g，蔗糖30 g，瓊脂17 g，蒸餾水1 000 mL。

1.3 病原菌分離純化

取5 mm×5 mm的具有典型青霉病癥狀的黨參病健交界處組織，用1%的次氯酸鈉消毒3 min，再用無菌水沖洗3次，去除殘留的次氯酸鈉［12］。將其接種于PDA培養(yǎng)基，25℃恒溫培養(yǎng)5~7 d，用打孔器將菌落轉(zhuǎn)移至新的PDA培養(yǎng)基上，純化2~3次后，得到單一菌株。

1.4 病原菌鑒定

1.4.1形態(tài)學(xué)鑒定 將孢子懸液接到PDA培養(yǎng)基上，25℃恒溫培養(yǎng)2 d，分別使用激光共聚焦和光學(xué)顯微鏡觀察孢子梗形態(tài)；培養(yǎng)7 d，觀察菌落形態(tài)、顏色及大小。

1.4.2 分子生物學(xué)鑒定 將病原菌接種到PDA上培養(yǎng)7 d，根據(jù)Edwards等［13］的CTAB法提取DNA，使 用 真 菌 通 用 引 物ITS1：5′-TCCGTA GGTGAACCTGCGG-3′和ITS4：5′-TCCTCC GCTTATTGATATGC-3′進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系為：總體積為50μL，其中上下游引物各1μL，模板DNA1-2μL，1×TaqPCR Mix 46~47μL。PCR擴(kuò)增程序?yàn)椋?4℃預(yù)變性5 min，94℃變性10 s，53℃退火10 s，72℃延伸30 s，30個(gè)循環(huán)，72℃保溫5 min。擴(kuò)增產(chǎn)物由2%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳。擴(kuò)增片段由北京博邁德生物有限公司進(jìn)行測序，將測得序列在NCBI中BLAST中搜索并進(jìn)行同源性分析，利用MEGA 7.0軟件采用鄰接法（neighbor-joining，NJ）構(gòu)建ITS系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.5 致病性檢測

將健康黨參用1%的次氯酸鈉消毒3 min，用無菌水沖洗3次，洗去殘留的次氯酸鈉。配置1×106CFU/mL的孢子懸液，人工噴灑于新鮮健康黨參表面，以噴灑無菌水作為對(duì)照，待其自然晾干后，在溫度15℃、濕度50%RH的條件下裝袋培養(yǎng)，觀察其發(fā)病情況，并從發(fā)病部位對(duì)病原菌進(jìn)行分離純化，采用柯赫氏法則進(jìn)行驗(yàn)證。

1.6 生物學(xué)特性

1.6.1 溫度對(duì)病原菌生長及產(chǎn)孢量的影響 取2μL 1×106CFU/mL孢子懸浮液接種于PDA培養(yǎng)基上，然后置于溫度為10、15、20、25、28、30、35℃的培養(yǎng)箱中恒溫培養(yǎng)7 d，十字交叉法測菌落直徑。分別加10 mL無菌水于上述PDA平板中，用涂布器刮取孢子，再加無菌水，稀釋孢子懸浮液濃度至1×106CFU/mL，用血球計(jì)數(shù)板法測定產(chǎn)孢量。每處理3個(gè)重復(fù)。

1.6.2 致死溫度 將1×106CFU/mL的孢子懸浮液分別在35、40、45、50、55、60、65℃下水浴加熱10 min，接種2μL于PDA培養(yǎng)基上，培養(yǎng)7 d后，觀察菌落生長情況，十字交叉法測菌落直徑，并計(jì)算菌絲生長速率［14］，每處理3個(gè)重復(fù)。

1.6.3 光照對(duì)病原菌生長及產(chǎn)孢量的影響 接種2μL 1×106CFU/mL的孢子懸浮液于PDA培養(yǎng)基上，分別置于24 h黑暗、12 h光照12 h黑暗、24 h光照3個(gè)不同光照條件下，7 d后用十字交叉法測菌落直徑。分別加10 mL無菌水于上述PDA平板中，用涂布器刮取孢子，再加無菌水，稀釋孢子懸浮液濃度至1×106CFU/mL，用血球計(jì)數(shù)板法測定產(chǎn)孢量。每處理3次重復(fù)。

1.6.4 pH對(duì)病原菌生長及產(chǎn)孢量的影響 根據(jù)田守波等［15］的方法，用0.1 mol/L HCl和0.1 mol/L NaOH調(diào)節(jié)PDA的pH值為4、5、6、7、8、9、10、11，在不同pH的PDA上接種2μL 1×106個(gè)/mL孢子懸浮液，25℃恒溫培養(yǎng)7 d，用十字交叉法測菌落直徑。分別加10 mL無菌水于上述PDA平板中，用涂布器刮取孢子，再加無菌水，稀釋孢子懸浮液濃度至1×106CFU/mL，用血球計(jì)數(shù)板法測定產(chǎn)孢量。每處理3次重復(fù)。

1.6.5 碳源對(duì)病原菌生長及產(chǎn)孢量的影響 以察氏培養(yǎng)基為基礎(chǔ)，將其中的蔗糖分別以麥芽糖、D-果糖、甘露醇、葡萄糖、β-環(huán)糊精等質(zhì)量代替［16］，接種2μL 1×106CFU/mL的孢子懸浮液于不同培養(yǎng)基上，7 d后測量菌落直徑。分別加10 mL無菌水于上述PDA平板中，用涂布器刮取孢子，再加無菌水，稀釋孢子懸浮液濃度至1×106CFU/mL，用血球計(jì)數(shù)板法測定產(chǎn)孢量。每處理3次重復(fù)。

1.6.6 氮源對(duì)病原菌生長及產(chǎn)孢量的影響 以察氏培養(yǎng)基為基礎(chǔ)，將其中的NaNO3分別以蛋白胨、牛肉膏、酵母粉、硫酸銨、甘氨酸、尿素等質(zhì)量代替［16］，接種2μL 1×106CFU/mL的孢子懸浮液于不同培養(yǎng)基上，7 d后測量菌落直徑。分別加10 mL無菌水于上述PDA平板中，用涂布器刮取孢子，再加無菌水，稀釋孢子懸浮液濃度至1×106CFU/mL，用血球計(jì)數(shù)板法測定產(chǎn)孢量。每處理3次重復(fù)。

1.7 病原菌代謝產(chǎn)生毒素分析

1.7.1 樣品制備 將健康黨參用1%的次氯酸鈉消毒3 min，用無菌水沖洗3次，洗去殘留的次氯酸鈉。配置1×106CFU/mL的孢子懸浮液，人工噴灑于新鮮健康黨參表面，待其自然晾干后，放入保鮮袋中培養(yǎng)（溫度15℃、濕度50%RH），待其發(fā)病。

1.7.2 毒素提取 根據(jù)柳漆利等［17］方法進(jìn)行修改。待其發(fā)病后，取病部組織切碎，置于研缽中，倒入液氮迅速研磨。取5 g上述樣品于離心管中，加入20 mL乙酸乙酯（1∶1，V∶V）萃取，置于旋渦混合器渦旋3 min，放入高速冷凍離心機(jī)（5 000 r/min，4℃）中離心5 min，重復(fù)上述操作3次。收集3次上清液于圓底燒瓶中，在45℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮至干，用2 mL pH為4的乙酸復(fù)溶，經(jīng)過0.22μm的有機(jī)濾膜過濾，最后用高效液相色譜進(jìn)行測定。

1.7.3 毒素測定 根據(jù)《GB 5009.185-2016食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品中展青霉素的測定》［18］稍作修改后進(jìn)行測定。色譜條件［19］：色譜柱：C18反相柱（250 nm×4.6 nm×5μm）；檢測器：紫外檢測器；波長：276 nm；流動(dòng)相：乙腈∶水（1∶9，V∶V）；流速：1.0 mL/min；柱溫：30℃；進(jìn)樣量：20μL。

2 結(jié)果與分析

2.1 病原菌分離和致病性檢測

通過組織分離法從發(fā)病的新鮮黨參組織中分離純化得到5株病原菌，其中1株菌的病情指數(shù)最高，為50%，命名為LBY-1。將其孢子懸浮液噴灑于健康的黨參表面，在溫度為15℃，濕度為50%RH的條件下裝袋培養(yǎng)。發(fā)病初期，病斑表面會(huì)生出顆粒狀霉斑，直徑為2~3 mm，顏色為白色；中期逐漸形成一簇簇菌落，表面覆有一層青色粉狀物；后期菌斑不斷擴(kuò)大蔓延，顏色變?yōu)榛揖G色，病斑處組織軟腐且霉味嚴(yán)重（圖1-A），與自然發(fā)病癥狀（圖1-B）相似。再從該發(fā)病黨參上取病健交界處組織于PDA上培養(yǎng)，分離純化，得到了相同的菌株。

2.2 形態(tài)學(xué)鑒定

通過單菌落純化，得到的菌落在PDA平板上呈現(xiàn)灰綠色，菌落分散生長，菌落質(zhì)地濃密有顆粒感（圖2-A），背面呈白色，不產(chǎn)色素（圖2-B）。分生孢子梗直立，有分隔，無色，頂端分支呈掃帚狀（圖2-C、2-D、2-E、2-F）。分生孢子串生，無色單孢，球形或扁球形，大小為（2.1~3.4）μm×（3.4~4.2）μm，分生孢子數(shù)量較多。根據(jù)形態(tài)學(xué)結(jié)果，初步鑒定為Peni?cillium expansum.

圖1新鮮黨參病害癥狀Figure 1 Symptoms of fresh Dangshen

圖2 病原菌菌落形態(tài)、分生孢子梗形態(tài)Figure 2 Colony morphology、conidiophore and conidium of pathogen

2.3 分子生物學(xué)鑒定

擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳檢測，在500~600 bp得到一條清晰的條帶，經(jīng)測序分析，得知該序列的長度為587 bp（圖3）。將該序列在NCBI中的BLAST進(jìn)行搜索，得到100個(gè)同源序列，選取合適的序列，用MEGA7軟件構(gòu)建ITS系統(tǒng)發(fā)育樹（圖4）。由圖4可見，病原菌LBY-1與DQ339556.1，KP204877.1，MT 872088.1在同一個(gè)分支上，且同源性為100%。因此，致病菌LBY-1被鑒定為Penicil?lium expansum.

圖3 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物凝膠電泳圖Figure 3 Gel electrophoresis image of PCR amplification product

圖4 基于r DNA-ITS序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹Figure 4 Phylogenetic tree constructed based on rDNAITS sequence

2.4 生物學(xué)特性分析

2.4.1 溫度對(duì)擴(kuò)展青霉菌落生長和產(chǎn)孢的影響擴(kuò)展青霉在10~30℃均能生長，溫度為10℃時(shí)，菌落生長緩慢，菌落直徑為14.75 mm，生長速率為2.11 mm/d；溫度為20℃時(shí)，菌絲生長較快，菌落直徑為51.25 mm；溫度為25℃時(shí)，菌落直徑達(dá)到最大為61 mm，生長速率為8.71 mm/d；當(dāng)溫度到30℃時(shí)，菌絲生長變得緩慢，菌落直徑為12 mm；35℃時(shí)，菌落不生長。病原菌在10℃時(shí)不產(chǎn)孢，20℃時(shí)的產(chǎn)孢量為25℃時(shí)的一半，為4.28×106CFU/mL；25℃時(shí)產(chǎn)孢量最高，為11.27×106CFU/mL；30℃時(shí)，該病原菌不產(chǎn)孢（圖5）。

圖5 不同溫度對(duì)菌落直徑和產(chǎn)孢量的影響Figure 5 Effects of different temperatures on colony diameter and sporulation

2.4.2致死溫度 將擴(kuò)展青霉在35、40、45、50、55、60、65℃水浴加熱，恒溫處理10 min。該病原菌在35~60℃均能生長，60℃時(shí)，病原菌生長速率明顯降低，生長速率為1.048 mm/d，在65℃時(shí)病原菌不能生長（圖6），這表明65℃處理10 min可使該病原菌致死。

圖6 致死溫度的測定Figure 6 Determination of lethal temperature

2.4.3 光照對(duì)擴(kuò)展青霉菌落生長和產(chǎn)孢的影響不同的光照條件對(duì)擴(kuò)展青霉菌落生長和產(chǎn)孢有顯著的影響。病原菌在24 h黑暗、12 h光照12 h黑暗、24 h光照3個(gè)不同光照條件下均能生長，24 h光照條件下的菌落生長最快，菌落直徑為46.3 mm，12 h光照12 h黑暗條件下菌落生長次之，菌落直徑為43.5 mm，24 h黑暗條件下的菌落直徑最小，為39 mm。24 h光照條件下的產(chǎn)孢量最高，為6.78×106CFU/mL，24 h黑暗條件下病原菌產(chǎn)孢量最低，為2.6×106CFU/mL。這說明光照條件有利于病原菌菌落的生長及產(chǎn)孢（圖7）。

圖7 不同光照條件對(duì)菌落直徑和產(chǎn)孢量的影響Figure 7 Effects of different light conditions on colony diameter and sporulation

2.4.4 pH對(duì)擴(kuò)展青霉菌落生長和產(chǎn)孢的影響擴(kuò)展青霉在pH 4~11時(shí)均能生長及產(chǎn)孢，說明該病原菌對(duì)pH的適應(yīng)范圍較寬。pH=7時(shí)，菌落直徑最大，為28.3 mm，pH=6時(shí)，該病原菌產(chǎn)孢量最高，為4.55×106CFU/mL。偏酸或偏堿的環(huán)境一定程度抑制了病原菌的生長和產(chǎn)孢（圖8）。

圖8 不同p H對(duì)菌落直徑和產(chǎn)孢量的影響Figure 8 Effects of different pH on colony diameter and sporulation

2.4.5碳源對(duì)擴(kuò)展青霉菌落生長和產(chǎn)孢的影響 擴(kuò)展青霉在以察氏培養(yǎng)基為基礎(chǔ)的不同碳源的培養(yǎng)基上均能生長，碳源為葡萄糖時(shí)，菌落直徑最大，平均為29.88 mm；碳源為甘露醇時(shí)，菌落直徑次之，平均為28.38 mm；當(dāng)碳源為D-果糖時(shí)，平均菌落直徑為25.5 mm；當(dāng)碳源為麥芽糖和蔗糖時(shí)，二者的菌落直徑相近，分別為24.5、24 mm；當(dāng)碳源為β-環(huán)糊精時(shí)，菌落直徑最小，為19.25mm。該病原菌在6種碳源上均可以產(chǎn)孢，當(dāng)碳源為β-環(huán)糊精時(shí)，產(chǎn)孢量最高，為4.97×106CFU/mL；碳源為D-果糖、麥芽糖、蔗糖、甘露醇時(shí)，產(chǎn)孢量分別為1.85×106、1.7×106、1.32×106、0.85×106CFU/mL；碳源為葡萄糖時(shí)，產(chǎn)孢量最低，為0.67×106CFU/mL。由此可見，該病原菌在以葡萄糖為碳源時(shí)，菌落直徑最大，產(chǎn)孢量反而最低；反之，以β環(huán)糊精為碳源時(shí)，菌落直徑最小，而產(chǎn)孢量卻最高（圖9）。

圖9 不同碳源對(duì)菌落直徑和產(chǎn)孢量的影響Figure 9 Effects of different carbon source on colony diameter and sporulation

2.4.6 氮源對(duì)擴(kuò)展青霉菌落生長和產(chǎn)孢的影響

擴(kuò)展青霉在以察氏培養(yǎng)基為基礎(chǔ)的不同氮源條件下均能生長，氮源是蛋白胨時(shí)，其菌落直徑最大為25.5 mm；氮源是甘氨酸時(shí)，菌落直徑次之，為24.83 mm；氮源為酵母粉、硫酸銨、牛肉膏時(shí)，其菌落直徑分別為21.5、20.5、20 mm；氮源為尿素時(shí)，菌落直徑最小，為10.5 mm。病原菌在這6種不同氮源條件下均能產(chǎn)孢，氮源為酵母粉時(shí)，產(chǎn)孢量最高，為1.17×106CFU/mL；氮源為硫酸銨時(shí)，產(chǎn)孢量次之，為1×106CFU/mL；而當(dāng)?shù)礊槟蛩貢r(shí)，產(chǎn)孢量最小，為0.13×106CFU/mL。因此可見，當(dāng)?shù)礊槟蛩貢r(shí)，既不適合該病原菌生長，也不適合產(chǎn)孢（圖10）。

圖10 不同氮源對(duì)菌落直徑和產(chǎn)孢量的影響Figure 10 Effects of different nitrogen source on colony diameter and sporulation

2.5 病原菌毒素測定

通過液相色譜分析發(fā)現(xiàn)，在擴(kuò)展青霉侵染黨參致其發(fā)生青霉病的組織中，檢測到了棒曲霉毒素的積累，其含量為1.75μg/g（圖11）。

圖11 棒曲霉素的液相色譜圖Figure 11 Liquid chromatogram of patulin

3 討論

本研究對(duì)甘肅岷縣新鮮黨參采后青霉病病害的致病菌進(jìn)行分離純化、致病性檢測，并通過形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)技術(shù)進(jìn)行分析，確定引起新鮮黨參采后青霉病的主要致病菌為擴(kuò)展青霉。目前對(duì)中草藥病害致病菌有相關(guān)的研究報(bào)道，周默等［20］從內(nèi)蒙古莫旗地區(qū)的黃芪根腐病中分離鑒定得到其主要致病菌有尖孢鐮刀菌、腐皮鐮刀菌、銳頂鐮刀菌和木賊鐮刀菌；張晶晶等［21］從東北地區(qū)的人參根腐病中分離鑒定出的主要致病菌為腐皮鐮刀菌和尖孢鐮刀菌；陳燕萍等［22］從太子參酸腐病中分離鑒定出的主要致病菌為尖孢鐮刀菌；徐雪芬等［23］從黨參根腐病中分離鑒定出的主要致病菌為茄鐮孢菌和銳頂鐮孢菌；王艷等［1］從黨參斑枯病中分離鑒定出的主要致病菌為黨參殼針孢。這表明不同地區(qū)，不同種類、不同品種的中藥材，引起病害發(fā)生的主要致病菌不同。而上述報(bào)道的病害主要發(fā)生在田間，對(duì)于新鮮中藥材采后貯藏期間病害報(bào)道較少，陳娟等［6］從采后貯藏期間的當(dāng)歸飲片中分離出皮落青霉（Penicillium crus?tosum）、鮮綠青霉（P.viridicatum）和橘灰青霉（P.au?rantiogriseum），從黨參飲片中分離出短密青霉（Penicillium brevicompactum）和橘灰青霉（P.auran?tiogriseum）等。然而，藥材飲片與新鮮藥材在原料上存在差異，同時(shí)上述研究未對(duì)分離出的病原菌進(jìn)行系統(tǒng)的生物學(xué)特性與毒素積累的研究。

本試驗(yàn)通過掃描電鏡和激光共聚焦顯微鏡對(duì)引起黨參青霉病主要致病菌的分生孢子及分生孢子梗進(jìn)行形態(tài)觀察。分生孢子梗直立，無色，有分隔，頂端分支呈掃帚狀。分生孢子串生，無色單孢，球形或扁球形，大小為（2.1~3.4）μm×（3.4~4.2）μm。魏景超［24］的真菌鑒定手冊中描述的擴(kuò)展青霉的分生孢子梗壁光滑或微粗糙，帚狀；分生孢子多，呈橢圓形，部分變亞球形，長徑3~3.5μm，與本研究結(jié)果一致；潘春青等［25］報(bào)道的正常的擴(kuò)展青霉孢子呈球形或橢球形，表面粗糙，周邊完整，也與本試驗(yàn)研究結(jié)果一致。由此表明，在甘肅岷縣新鮮黨參采后青霉病病害的主要致病菌為Penicillium expansum。

生物學(xué)特性試驗(yàn)表明，P.expansum菌落生長的最適溫度為25℃、最適pH為7、產(chǎn)孢的最適溫度為25℃、最適pH為6，65℃處理10 min可致死；這與楊美華等［26］報(bào)道的在南京中醫(yī)藥大學(xué)生物制藥教研室保藏的擴(kuò)展青霉的生長特性相似，擴(kuò)展青霉在25℃時(shí)，菌絲體生物量最高，為4.185 mg/L，pH=6時(shí)，其菌絲生物量最高，為3.986 mg/L。丁仁惠等［27］在柑橘采后青霉病主要病原菌的生物學(xué)特性研究中發(fā)現(xiàn)，指狀青霉和意大利青霉的最適生長溫度為28~30℃，最適生長pH為6~7，致死溫度為75℃。本研究發(fā)現(xiàn)：24 h光照處理時(shí)，菌落直徑最大，且產(chǎn)孢量最高，而24 h黑暗處理，菌落直徑最小且產(chǎn)孢量最低，因此光照有利于菌落的生長及產(chǎn)孢；在碳源試驗(yàn)中，葡萄糖利于菌落生長而不利于產(chǎn)孢，β-環(huán)糊精利于擴(kuò)展青霉產(chǎn)孢，而不利于菌絲生長；在氮源試驗(yàn)中，蛋白胨利于菌絲生長，酵母粉利于產(chǎn)孢，而尿素既不利于菌落生長又不利于產(chǎn)孢。該結(jié)果與郭東起等［28］從冬棗的青腐病中分離得到的橘青霉的生長特性類似，其最適生長pH為7~8，致死溫度為75℃，硝酸鹽類利于橘青霉生長繁殖，而銨鹽有抑制作用，葡萄糖利于橘青霉的生長和產(chǎn)孢，光照利于橘青霉的菌落生長，而黑暗條件利于產(chǎn)孢。王帆等［29］對(duì)赭綠青霉生物學(xué)特性研究也發(fā)現(xiàn)，赭綠青霉的最適生長和產(chǎn)孢溫度均為28℃，最適生長pH為6，最適產(chǎn)孢pH為7，最適的菌落生長碳源為麥芽糖，最適產(chǎn)孢碳源為葡萄糖，最適生長和產(chǎn)孢氮源均為蛋白胨。由此表明，不同宿主青霉病病害組織中分離得到的病原菌種類不同，病原菌的生物學(xué)特性也存在顯著差異。甘肅岷縣10月中下旬以后，降雨增多，濕度明顯升高，非常容易引起新鮮黨參青霉病的發(fā)生，且光照利于擴(kuò)展青霉的生長和產(chǎn)孢，因此新鮮黨參采后要低溫、干燥、避光貯藏，這樣可以適當(dāng)減輕病害發(fā)生。

本研究中測定棒曲霉素時(shí)，標(biāo)樣的出峰位置在3.306 min（圖11-A），試樣的出峰位置在3.029 min（圖11-B），出峰位置不能完全重合，其原因可能是中草藥的基質(zhì)效應(yīng)［30］所導(dǎo)致，但不影響檢測結(jié)果。本研究表明，青霉病黨參組織中檢測到棒曲霉素的積累。棒曲霉素是一種常見的真菌毒素，對(duì)人體、動(dòng)物、植物、細(xì)菌等均有毒害作用，急性中毒主要影響和損傷消化系統(tǒng)、肝臟和腎臟等，長期接觸會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞損傷、肺充血、致畸、致癌等遺傳毒性［31］。黨參作為一種特殊植物，屬于藥食同源，其主要功效還是治療病害，然而青霉病黨參不僅不能有效治療病害，可能還會(huì)危害患者的身心健康。

4 結(jié)論

新鮮黨參青霉病的主要致病菌為擴(kuò)展青霉（Penicillium expansum），且它會(huì)代謝產(chǎn)生棒曲霉素。在25℃，pH 6~7，24 h光照時(shí)，適合菌絲生長且產(chǎn)孢；最適生長碳源為葡萄糖，氮源為蛋白胨；最適產(chǎn)孢碳源為β-環(huán)糊精，氮源為酵母粉；65℃處理10 min可致死。本試驗(yàn)為新鮮黨參的病害研究與防控以及其他中草藥病害的研究與探索奠定了理論基礎(chǔ)。