仔豬空腸和回腸微生物多樣性分析

路暢，郭玉龍，郭艷博，劉婷，高鵬飛，李步高，郭曉紅

（山西農業(yè)大學 動物科學學院，山西 晉中 030801）

哺乳動物胃腸道是一個多功能器官，擁有復雜的動態(tài)微生物群落，是營養(yǎng)物質消化、吸收和代謝的主要場所，同時在生理、免疫等方面發(fā)揮重要作用［1-2］。腸道微生物的早期定殖是動物生長發(fā)育及后期生產性能充分發(fā)揮保障的基礎［3］。豬腸道菌群定殖過程受諸多因素影響，斷奶、飼料更換以及環(huán)境的改變均會導致群落結構發(fā)生顯著變化，很容易影響腸道發(fā)育及黏膜免疫系統(tǒng)的形成［4-6］。預先了解仔豬腸道群落形成特點，分析影響腸道健康發(fā)育的菌群，有助于制定促進早期腸道內環(huán)境穩(wěn)態(tài)發(fā)展的策略，及時對仔豬腸道菌群進行有效干預，改善仔豬腸道健康，提高生長速度和后期生產性能。

動物在出生前腸道屬于無菌狀態(tài)，出生后受到母體及周圍環(huán)境影響，各種微生物快速在腸道定殖［7］。仔豬階段是腸道微生物早期定殖的關鍵時期，由于仔豬各腸段功能不同，微生物菌群結構具有顯著差異，小腸和大腸之間以及管腔和粘膜之間微生物分布都不相同，而且糞便與腸道菌群組成也存在差異［8-10］。研究發(fā)現(xiàn)，梭菌屬、乳酸菌、幽門螺桿菌等作為厚壁菌門的主要成員在回腸中大量富集，擬桿菌在盲腸及結腸的腔內和黏膜中豐度顯著增加，在不同發(fā)育階段菌群豐度及多樣性隨年齡增長而增加［11-14］。此外，腸道微生物能夠通過其代謝產物促進腸干細胞增殖，如乳酸菌可促進仔豬早期腸黏膜結構發(fā)育，同時能使Wnt/βcatenin 通路活化導致腸上皮細胞再生，最終維持細胞穩(wěn)態(tài)［15-16］。

目前雖然圍繞腸道菌群對宿主的影響開展了許多研究，但仔豬階段微生物對腸道結構發(fā)育的作用還未明確。馬身豬作為山西地方豬種，具有產仔多、肉品質好、耐粗飼、抗逆性強等優(yōu)點，但其生長速度較慢，脂肪沉積嚴重且瘦肉率低；晉汾白豬是以馬身豬、二花臉豬、長白豬和大白豬為親本選育而成的新品種，具有生長發(fā)育速度快、肉質好等特點［17］。本研究將馬身豬（地方品種）和晉汾白豬（培育品種）仔豬作為研究對象，對初生（1 日齡）、哺育末期（28 日齡）、保育末期（70 日齡）3 個關鍵時期空腸和回腸微生物菌群結構進行分析，探究不同豬種腸道微生物特點及小腸結構發(fā)育與微生物多樣性的關系，以期發(fā)現(xiàn)仔豬腸道發(fā)育過程中重要的微生物，旨在為后期仔豬健康飼養(yǎng)提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 試驗動物和樣品采集

本研究于2018 年8-11 月在山西省大同市種豬場進行，每個品種各選擇3 頭健康母豬，圍產期飼料中不添加抗生素或其它藥物以及益生菌等影響腸道微生物結構的物質。選擇第4 胎次的仔豬，在喂養(yǎng)28 d 斷奶后單窩喂養(yǎng)。在出生第1 天、28 天（哺育結束）和70 天（保育結束）時，分別在各窩隨機選擇3 頭公豬進行屠宰，取空腸、回腸內容物收集于1.5 mL 凍存管中，液氮保存。每頭豬分別采集1 cm 的空腸與回腸組織，去除內容物并放入多聚甲醛固定液保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 小腸絨毛結構測定

按常規(guī)步驟將取樣組織制作成石蠟塊，在室溫下切出厚度為7 μm 的空腸、回腸組織石蠟切片（每頭豬各做2 張），并用伊紅-蘇木精（HE）試劑染色。后對切片中方向相同的5 根絨毛測量其絨毛長度（Vlength）和隱窩深度（Cdepth），并計算絨隱比（V/C）［17］。

1.3 DNA 抽提、PCR 擴增和測序

按照天根試劑盒說明書的方法與步驟，分別對200 mg 空腸與回腸內容物提取DNA。利用引物 對 微 生 物 的V3-V4 區(qū) 進 行 擴 增（341F：5’-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3’和 806R：5’-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3’）。具體步驟同郭曉紅等已發(fā)表論文方法與材料部分［17］?；厥赵噭┖袑ξ⑸颬CR 產物切膠回收，并用濃度為2%的瓊脂糖凝膠電泳對仔豬腸道微生物DNA 檢測。隨后將微生物樣品在Miseq PE300 平臺進行建庫并測序。下機數(shù)據(jù)得到Clean Data 使用FLASH 軟件組裝讀段（reads）。

1.4 OTU 聚類分析

使用UPARSE 軟件將高質量的reads 從頭拼接并富集成OTU（operational taxonomic units）代表序列。將優(yōu)化序列與OTU 代表序列比對，進行序列分類，以相似度97%作為分類標準。

1.5 腸道微生物多樣性分析

利用Mothur 軟件（v.1.34.0）計算α 多樣性指數(shù)［18］，分析仔豬腸道菌群多樣性，并繪制OUT 稀疏曲線和Rank 豐度曲線。利用R（v.3.0.2）基于加權的UniFrac 距離進行主成分分析（posterior cerebral artery，PCA）。

1.6 樣本組成及差異分析

將步驟1.5 中得到的OTU 序列進行分類（比對SILVA 數(shù)據(jù)庫），分別在門（Phylum）和屬（Genus）水平統(tǒng)計馬身豬和晉汾白豬仔豬空腸與回腸微生物構成，并繪制Venn 圖。

1.7 環(huán)境因子相關分析

使用R 軟件中vegan 包對環(huán)境因子（包括腸道絨毛結構和血清免疫指標）與腸道微生物在門和屬的相關性分析。計算菌群微生物與腸道絨毛結構和血清免疫指標的Spearman 相關性系數(shù)，選擇前15 個相關性最高的微生物繪制相關性熱圖。

2 結果與分析

2.1 仔豬回腸與空腸形態(tài)結構比較分析

2.1.1 腸道組織切片結果分析

由圖1 組織切片可見，隨著日齡增加，2 品種仔豬空腸與回腸絨毛長度逐漸變短，但橫切面呈現(xiàn)逐漸變寬的趨勢。晉汾白豬仔豬初生（1 d）時小腸已經出現(xiàn)腸道褶皺，而在馬身豬仔豬腸道中未發(fā)現(xiàn)此現(xiàn)象；此外，馬身豬仔豬初生（1 d）時空腸與回腸絨毛較長，而在哺育與保育末期（28 d 和70 d）晉汾白豬的腸絨毛長度大于馬身豬（圖1）。

圖1 馬身豬和晉汾白豬空腸與回腸組織切片（200×）Fig.1 Jejunum and ileum biopsy of Mashen and Jinfen White piglets（200×）

2.1.2 仔豬腸絨毛高度和隱窩深度比較

從初生到70 日齡，2 品種豬（除馬身豬回腸）空腸和回腸絨毛呈逐漸降低趨勢，且初生時的回腸絨毛高度極顯著高于28 日齡和70 日齡（圖2A、圖2D，P＜0.01）。此外，2 品種豬空腸隱窩深度隨仔豬生長發(fā)育也不斷加深，70 日齡的小腸隱窩深度最高（圖2B、圖2E）。空腸和回腸的絨隱比（Villus/Crypt）隨日齡增加呈極顯著遞減趨勢（圖2C、圖2F）。

通過品種間進行比較發(fā)現(xiàn)，馬身豬仔豬空腸絨毛長度在1 日齡和28 日齡時極顯著高于晉汾白豬（圖2A，P＜0.01）。2 品種仔豬回腸絨毛長度在初生時沒有差異，但在28 日齡時馬身豬回腸絨毛高度極顯著高于晉汾白豬（P＜0.01），在70 日齡時卻顯著低于晉汾白豬（圖2D，P＜0.05）。比較隱窩深度發(fā)現(xiàn)，馬身豬仔豬空腸隱窩深度極顯著高于晉汾白豬（除28 日齡回腸），但在保育末期（70 日齡）卻顯著低于晉汾白豬（圖2B，P＜0.05）。與空腸不同，1 日齡和70 日齡馬身豬仔豬回腸隱窩深度顯著高于晉汾白豬（P＜0.05），28 日齡卻無顯著差異（圖2E）。馬身豬在哺育末期空腸與回腸組織的絨隱比顯著高于晉汾白豬（圖2C、圖2F，P＜0.05）。

圖2 馬身豬和晉汾白豬小腸絨毛結構Fig.2 The intestinal morphology of Mashen and Jinfen White piglets

2.2 樣本物種注釋與評估

對馬身豬和晉汾白豬仔豬腸道內容物樣品進行測序，共檢測到1 872 432 個高質量序列，得到2032 個OUTs，其中2 個品種共有核心OTU 840個，940 個為晉汾白豬所特有，252 個為馬身豬特有，核心OTUs 占晉汾白豬（馬身豬）總OTUs 的47.19%（76.92%）。將97%相似水平的OTU 代表序列匹配到已知細菌的序列，在晉汾白豬中檢測 到28 個 門，55 個 綱，106 個目，205 個 科 和518 個屬，在馬身豬中檢測到19 個門，35 個綱，66 個目，124 個 科 和325 個 屬。

2.3 腸道群落多樣性分析

對腸道微生物主成分分析，發(fā)現(xiàn)2 品種仔豬腸道整體菌群相似且區(qū)分不明顯（圖3A），與之前結腸中的研究結果一致［17］。馬身豬空腸、回腸3 個發(fā)育時期菌群結構差異明顯能夠完全區(qū)分，而空腸與回腸菌群結構相似不能完全區(qū)分，說明晉汾白豬腸道菌群與馬身豬相似（圖3B）。通過對腸道微生 物α 多 樣 性分 析 發(fā) 現(xiàn)，除Simpson 以 外，ACE、Chao、Shannon 變化趨勢較相似（圖3C）。晉汾白豬28 日齡時空腸菌群多樣性顯著減少，70 日齡時顯著增加，馬身豬仔豬3 個發(fā)育階段腸道菌群變化穩(wěn)定，無顯著差異。此外，晉汾白豬仔豬回腸菌群多樣性隨日齡逐漸增加，而馬身豬回腸菌群多樣性在70 日齡時顯著減少（P＜0.05），并在保育結束（70 日齡）時微生物多樣性極顯著低于晉汾白豬（圖3C，P＜0.01）。

圖3 馬身豬和晉汾白豬空腸、回腸微生物多樣性分析Fig.3 Microbial diversity in jejunum and ileum of Mashen and Jinfen White piglets

2.4 腸道菌群組成分析

通過微生物組成分析，發(fā)現(xiàn)晉汾白豬和馬身豬仔豬腸道微生物主要包括厚壁菌門（Firmicutes）、變形菌門（Proteobacteria）和擬桿菌門（Bacteroidetes）。其中，厚壁菌門隨仔豬發(fā)育豐度逐漸增加，保育結束（70 日齡）所占比例最大。2 品種仔豬回腸厚壁菌門豐度均高于空腸，而且晉汾白豬腸道該菌比例（32.29%～54.92%）顯著低于馬身豬（61.34%～87.67%）。變形菌門在哺育結束（28 日齡）時豐度達到最高，在70 日齡時急劇減少，初生時晉汾白豬該菌豐度（72.29%）顯著高于馬身豬（15.60%）。兩品種仔豬腸道中擬桿菌門豐度變化與厚壁菌門相反，空腸中擬桿菌門所占比例均高于回腸，晉汾白豬腸道中所占比例（0.70%～3.89%）高于馬身豬（0.11%～1.9%）（圖4A）。

晉汾白豬和馬身豬仔豬腸道微生物群中共鑒定出518 和325 個屬，晉汾白豬腸道菌屬多樣性顯著高于馬身豬（圖4B）。乳酸桿菌（Lactobacillus）、假單胞菌（Pseudomonas）、狹義梭菌屬1（Clostridium_sensu_stricto_1）在2 品種仔豬腸道中所占比例較高。馬身豬仔豬腸道中的乳酸菌在初生和保育結束時豐度比較高，該菌在空腸這2 階段豐度平均占比分別為46.76%、95.25%，回腸中分別占37.37%、86.75%，且晉汾白豬乳酸桿菌含量均顯著低于馬身豬。假單胞菌作為變形菌門中的主要菌屬，晉汾白豬仔豬腸道中其豐度占比是馬身豬仔豬的2 倍，哺育結束時該菌含量顯著增加。分析發(fā)現(xiàn)，狹義梭菌屬在馬身豬仔豬初生時豐度較高，隨后很快消失，1 日齡馬身豬仔豬該菌豐度是晉汾白豬的1.7 倍；晉汾白豬腸道中該菌在各個時期均存在且豐度較高。2 個品種保育結束（70 日齡）時鏈球菌屬（Streptococcus）出現(xiàn)較高豐度，在晉汾白豬中的含量是馬身豬的3～4 倍（圖4B）。

圖4 馬身豬和晉汾白豬小腸微生物組成Fig.4 The composition of intestinal microbes between Mashen and Jinfen White piglet

2.5 空腸和回腸特有腸道菌群分析

對2 個品種仔豬空腸和回腸特異菌屬進行分析，在晉汾白豬空腸和回腸中分別檢測到453 種和373 種菌屬，而在馬身豬空腸和回腸中僅發(fā)現(xiàn)307種和183 種菌屬。其中，晉汾白豬特有菌屬221種，馬身豬特有菌屬僅25 種，說明晉汾白豬腸道微生物多樣性顯著高于馬身豬（圖5）。

圖5 馬身豬和晉汾白豬仔豬空腸與回腸微生物數(shù)量（屬水平）Fig.5 The number of microbiota in the jejunum and ileum of two breeds at genus level

通過對小腸特有菌群分析，發(fā)現(xiàn)空腸與回腸特有菌屬所屬門類差異較大。在門水平，晉汾白豬腸道特異菌群主要集中在放線菌門、厚壁菌門、擬桿菌門、酸桿菌門（Acidobacteria）、Parcubacteria、綠彎菌門（Chloroflexi）等8 個菌門；而馬身豬腸道特有菌群主要分布于變形菌門、厚壁菌門、疣微菌門、擬桿菌門、綠菌門、綠彎菌門、藍藻門（Cyanobacteria）等9 個菌門（圖6）。在屬水平，Quinella、游動放線菌（Actinoplanes）、氣微菌屬（Aeromicrobium）、動膠菌屬（Zoogloea）等菌屬特異性富集于在晉汾白豬仔豬回腸與空腸中（圖6A）；馬身豬仔豬空腸和回腸特有菌屬主要包括粘螺旋藻（Mucispirillum）、Thiopseudomonas、Sinibacillus、索 氏菌屬（Thauera）、氣斯氏菌屬（Aerisardovi）、Anaerofilum等（圖6B）。

圖6 晉汾白豬和馬身豬空腸、回腸特有微生物組成Fig.6 The component of peculiar microorganisms in jejunum and ileum of Jinfen White and Mashen piglets

2.6 微生物與腸道指標關聯(lián)分析結果

通過對腸道微生物菌群與腸絨毛結構和血清生化指標進行相關性分析（圖7），發(fā)現(xiàn)馬身豬仔豬血清中脂多糖（LPS）、二胺氧化酶（DAO）、絨毛長度（Vlength）關聯(lián)的菌群與D 乳酸（D-LA）、白介素6（IL-6）、腫瘤壞死因子α（TNF-α）、隱窩深度（Cdepth）關聯(lián)的菌群相關性結果相反，但在晉汾白豬仔豬中區(qū)分度不明顯。其中，馬身豬仔豬的腸道絨毛長度和隱窩深度與15 個菌屬的相關性呈現(xiàn)相反的趨勢，絨毛長度與鏈球菌、unclassfied_o_Lactobacillales極顯著正相關，但隱窩深度與二者極顯著負相關（P＜0.001）。D-LA 與4 種菌顯著負相關（P＜0.05），但僅與乳酸桿菌顯著正相關（圖7A，P＜0.01）。對于晉汾白豬而言，鏈球菌、北里孢菌（Kitasatospora）、羅氏菌（Rothia）、莫拉 氏 菌（Moraxella）和 魏 斯 氏 菌（Weissella）與TNF-α 和隱窩深度顯著正相關，但與D-LA、IL-6以及LPS 顯著負相關（圖7B，P＜0.05）。此外，鏈球菌在2 品種仔豬中均與DAO 和LPS 負相關，與TNF-α 和Cdepth 顯著正相關（P＜0.05）。乳酸桿菌與DAO 在馬身豬中極顯著正相關卻在晉汾白豬中極顯著負相關（P＜0.001），但與LPS 在2 品種豬中顯著負相關（P＜0.05）。

圖7 馬身豬和晉汾白豬腸道微生物與指標相關性分析（屬水平）Fig.7 Spearman correlation analysis between microbiota and environmental variables in two pig breeds at genus level

3 討論

中國地方豬種在抵抗外界壓力和疾病的能力得到廣泛認可［19-20］，其中腸道微生態(tài)在維持健康和抵抗疾病方面發(fā)揮不容忽視的作用［21］。研究表明，仔豬腸道微生物多樣性會隨日齡增加發(fā)生顯著變化，此過程受飼料及遺傳等多種因素影響［6，22］。本研究發(fā)現(xiàn)，晉汾白豬與馬身豬仔豬小腸微生物結構相似，但3 個時間點的腸道微生物多樣性差異顯著，說明腸道微生物的形成受到飼料、環(huán)境等因素的影響較大。其中，日齡和飲食是引起菌群差異的重要驅動因素，而馬身豬仔豬的腸道菌群分類比晉汾白豬少，更穩(wěn)定，也可能是地方品種對環(huán)境改變有較強的適應能力的原因。

有研究指出，豬腸道中有大量的厚壁菌門、擬桿菌門和變形菌門微生物，本研究結果與以上相符［23-24］。厚壁菌門具有獲取食物能量的潛力［25-26］，馬身豬仔豬腸道厚壁菌門豐度顯著高于晉汾白豬，高豐度的厚壁菌門可能促進了馬身豬脂肪積累。此外，乳酸桿菌是哺乳動物腸道中的主要菌屬，在母乳及植物性食物的代謝中發(fā)揮著重要的作用［27］。在本研究中馬身豬仔豬腸道中的乳酸桿菌豐度較高，這對于維護腸道健康及營養(yǎng)物質的消化吸收有重要作用。Romboutsia能夠降低血漿中促炎細胞因子水平，而假單胞菌屬、狹義梭菌屬等是腸道潛在致病菌［28］。本研究中這些菌屬在2品種仔豬各時期均有較高豐度，提示仔豬階段要注意環(huán)境和飼料等外界因素的影響，應加強仔豬護理防止腸道疾病的發(fā)生。從整體來看，馬身豬有益菌群豐度占比高于晉汾白豬，說明馬身豬腸道微生物在其抗逆性方面發(fā)揮重要作用。

本研究分析表明，腸道菌群與腸道發(fā)育以及機體免疫之間存在相關性，其中血清DAO、D-LA和LPS 含量可以改變腸道通透性腸黏膜功能［29-30］。乳酸桿菌的代謝產物具有抑菌、屏障保護作用，可以競爭致病菌的黏附位置并減少致病菌的黏附侵害，減少致病菌LPS 的產生［31-32］。此外，魏斯氏菌對腸黏膜具有抗炎和保護作用，在小鼠中可抑制脂多糖誘導巨噬細胞產生NO 和IL-6，而在人中主要抑制上皮細胞產生IL-8［33］。本研究通過關聯(lián)分析發(fā)現(xiàn)狹義梭菌屬、假單胞菌屬等微生物與這些指標顯著正相關，而乳酸桿菌、魏斯氏菌等有益菌是負相關，所以在實際生產中應注意對仔豬腸道微生物調控，促進有益菌大量富集，維護腸道健康。

4 結論

本研究通過比較馬身豬和晉汾白豬仔階段小腸微生物多樣性，分析了仔豬關鍵生長階段的菌屬變化情況，與晉汾白豬相比，馬身豬仔豬腸道菌群組成更加保守，微生物多樣性顯著小于晉汾白豬。乳酸桿菌、Ferruginibacter、Thiopseudomonas、索氏菌屬、粘螺旋藻等是馬身豬的特異菌群，可能對馬身豬抗逆性能具有影響。Quinella、Haliangium、動膠菌屬、Anoxybacillus、毛螺菌科等為晉汾白豬特異菌屬，對營養(yǎng)吸收代謝具有重要作用。微生物對仔豬健康及后期生產性能的發(fā)揮具有重要作用，本研究結果可為不同品種仔豬腸道微生態(tài)的調控研究及仔豬健康飼養(yǎng)提供參考。