阜新地區(qū)鵪鶉源主要病原菌分離、鑒定

劉耀川，龔商羽

（1.遼寧省動物疫病預(yù)防控制中心，遼寧 沈陽 110164；2.錦州市動物疫病預(yù)防控制中心，遼寧 錦州 121000）

鵪鶉作為野生鳥類，長期以來廣泛分布于自然環(huán)境中。近年來隨著人們生活水平不斷提高，蛋用及肉用鵪鶉的飼養(yǎng)規(guī)模也逐漸擴(kuò)大，而與之相關(guān)的細(xì)菌病的報道也隨之增加，嚴(yán)重制約了鵪鶉規(guī)模化養(yǎng)殖的發(fā)展。由于野生鵪鶉在自然環(huán)境中具有較高的自由度，因此也成為病原的傳播媒介。特別是在禽類養(yǎng)殖密度較高及人類生活區(qū)附近，極易造成病原快速傳播，不僅威脅養(yǎng)殖業(yè)安全，同時也對公共衛(wèi)生安全造成嚴(yán)重威脅。

本研究對阜新地區(qū)鵪鶉飼養(yǎng)場及自然環(huán)境中發(fā)現(xiàn)的急性死亡鵪鶉進(jìn)行病原菌分離、鑒定，為該地區(qū)鵪鶉細(xì)菌病治療、預(yù)防提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1 樣本來源 在阜新市某蛋用鵪鶉養(yǎng)殖場內(nèi)，選取急性死亡鵪鶉（69只）及臨床表現(xiàn)精神萎靡、食欲不振、羽毛松亂、縮頭、排白色糞便的鵪鶉（155只）；同時收集在自然環(huán)境中發(fā)現(xiàn)的野生鵪鶉尸體14只。

1.1.2 主要儀器 解剖用手術(shù)器械、酒精燈、無菌棉拭子、5mL離心管、10mL離心管、高壓立式蒸汽滅菌器（DOZ/CQ30L）、生物安全柜（AirBio 2680C）、立式電熱恒溫培養(yǎng)箱（HitPot 6079）、電熱恒溫振蕩培養(yǎng)器（TZD-68C）、酒精燈、各量程微量移液器（Eppednorf）等，由阜新市動物疫病預(yù)防控制中心提供。

1.1.3 主要試劑 沙門氏菌生化鑒定管（11種×10支，J2201）、腸桿菌科細(xì)菌生化鑒定管（15種×10支，J2002）購于杭州微生物試劑有限公司；革蘭氏染色液試劑盒（HB8278）購于青島海博科技公司；普通瓊脂培養(yǎng)基、營養(yǎng)肉湯、S-S瓊脂（Salmonella Shigella agar）、麥康凱瓊脂購于北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司。

1.2 方 法

1.2.1 樣品采集 對死亡鵪鶉尸體胸廓區(qū)域用碘酊-酒精消毒后，用手術(shù)剪沿胸廓正中線剪開暴露肝臟。將手術(shù)刀片用酒精燈灼燒后對肝臟組織表面燒烙，然后切取合適大小的肝臟組織塊，存放于含有無菌生理鹽水的離心管中，將離心管密封、標(biāo)記后，置于4℃保溫箱中，盡快送至實驗室。

對患病鵪鶉，用無菌棉拭子采集其泄殖腔內(nèi)容物。采集后將棉拭子頭存放于含無菌生理鹽水的離心管中，標(biāo)記后置于4℃保溫箱中送至實驗室。

1.2.2 培養(yǎng)基配置 按照產(chǎn)品說明書要求，用無菌去離子水對NB、營養(yǎng)瓊脂、麥康凱瓊脂、S-S瓊脂進(jìn)行配置、分裝。NB分裝于5mL離心管中，營養(yǎng)瓊脂、麥康凱瓊脂、S-S瓊脂分別制備成90mm的固體培養(yǎng)基。上述培養(yǎng)基均需在無菌生物安全柜中制備，密封后在37℃恒溫培養(yǎng)箱中過夜培養(yǎng)，檢菌合格后放于4℃冰箱中保存、備用。

1.2.3 病原菌擴(kuò)增 在無菌生物安全柜中，用無菌眼科剪將死亡鵪鶉肝臟在存放的離心管中充分剪碎。在震蕩混勻儀上對離心管充分震動、混勻，用同樣的方法處理盛放泄殖腔棉拭子頭的離心管。樣品充分混勻后，取其中的生理鹽水混勻液100μL接種于5mL的NB肉湯中。將NB肉湯置于恒溫振蕩培養(yǎng)箱中，37℃180rpm過夜培養(yǎng)。

取100μL過夜培養(yǎng)的NB肉湯，在無菌生物安全柜中用三角玻璃棒將其均勻涂布于普通營養(yǎng)瓊脂上，正置片刻，待菌液完全吸收后，將瓊脂培養(yǎng)基倒置于37℃恒溫培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)12h。觀察培養(yǎng)的普通瓊脂，選取大小不同的單獨菌落，進(jìn)行NB肉湯擴(kuò)增。并將擴(kuò)增后的菌液保存于終濃度為30%的甘油溶液中，于-80℃保存，待檢。

1.2.4 病原菌分離 用接種針取保存的甘油菌，分別于麥康凱瓊脂培養(yǎng)基和S-S瓊脂培養(yǎng)基中進(jìn)行劃線培養(yǎng)。劃線完畢后，將培養(yǎng)基倒置于37℃恒溫培養(yǎng)箱中，需氧條件下培養(yǎng)18～24h。

1.2.5 革蘭氏染色鏡檢 在麥康凱培養(yǎng)基中選取經(jīng)典紅色圓形、具有金屬光澤的單獨菌落；在S-S瓊脂培養(yǎng)基中，選取無色、圓形、小菌落，進(jìn)行NB純化培養(yǎng)。用接種環(huán)分別挑取等量的生理鹽水和細(xì)菌培養(yǎng)物，充分混合后，按革蘭氏染色試劑盒說明書操作要求對病原菌進(jìn)行染色、鏡檢，觀察細(xì)菌染色結(jié)果與形態(tài)，對其進(jìn)行初步鑒定。

1.2.6 生化反應(yīng)鑒定 取初步鑒定的大腸桿菌分離株和沙門氏菌分離株，在無菌生物安全柜中，分別接種于腸桿菌科生化鑒定管和沙門氏菌生化鑒定管中。每個鑒定管在接種后應(yīng)用1滴液體石蠟對反應(yīng)面進(jìn)行封閉處理，并用封口膜對鑒定管進(jìn)行封口、標(biāo)記后，將鑒定管放置于37℃恒溫培養(yǎng)箱中過夜培養(yǎng)。培養(yǎng)后，根據(jù)反應(yīng)管中顏色變化，對照編碼手冊對病原分離株進(jìn)行賦碼。最終根據(jù)賦碼結(jié)果確定病原菌分離株的種類。

2 結(jié)果與分析

2.1 病原菌初步分離結(jié)果根據(jù)鑒別培養(yǎng)基生長特點，以及革蘭氏染色、鏡檢觀察，在麥康凱瓊脂上見到呈現(xiàn)典型金屬紅色光澤、圓形小菌落，革蘭氏染色鏡檢呈兩端鈍圓、散在、無芽孢的陰性短桿菌為大腸桿菌疑似株；在麥康凱瓊脂呈現(xiàn)半透明、圓形隆起、灰白色小菌落，在S-S瓊脂中呈現(xiàn)無色、圓形小菌落，革蘭氏染色為陰性短桿菌、中等大小、兩端鈍圓，為沙門氏菌疑似株。

在83只死亡鵪鶉肝臟樣本中，得到大腸桿菌疑似分離株42株、沙門氏菌疑似分離株33株；在155份泄殖腔棉拭子樣本中，得到大腸桿菌疑似分離株92株、沙門氏菌疑似分離株66株。

2.2 病原菌生化鑒定結(jié)果對初步分離的疑似病原菌分離株進(jìn)行生化反應(yīng)鑒定，并根據(jù)編碼結(jié)果進(jìn)行病原菌種類確定，最終在134株大腸桿菌疑似株中確定大腸桿菌分離株71株；在99株沙門氏菌疑似株中確定沙門氏菌分離株36株。

根據(jù)不同樣品來源對病原菌分離結(jié)果進(jìn)行分析可知，在飼養(yǎng)場獲得的224個樣品中（69個尸體樣本、155個泄殖腔棉拭子樣本）共分離到大腸桿菌57株、沙門氏菌22株。其中69個尸體樣本中大腸桿菌和沙門氏菌分別為27株和12株；155個棉拭子樣本中大腸桿菌和沙門氏菌分別為30株和10株。在14個野生鵪鶉尸體中分離到大腸桿菌和沙門氏菌各14株。綜合分析，本研究大腸桿菌和沙門氏菌的總體分離率分別為29.8%（71/238）和15.1%（36/238），占比分別為66.4%（71/107）和33.6%（36/107）。病原菌分離、鑒定具體結(jié)果見表1及圖1。

表1 鵪鶉源病原菌分離、鑒定結(jié)果

3 討論

大腸桿菌和沙門氏菌是禽類細(xì)菌病的主要病原，如能夠引起雞白痢、腹瀉、禽大腸桿菌病等，對規(guī)?；蓊愷B(yǎng)殖威脅巨大。鵪鶉作為近年來新興的集約化飼養(yǎng)禽類，因具有較高的經(jīng)濟(jì)附加值，其在畜牧養(yǎng)殖業(yè)中的地位逐漸提高。隨著飼養(yǎng)規(guī)模不斷壯大，鵪鶉細(xì)菌病的報道也逐漸增多，如李超等報道，揚州地區(qū)鵪鶉養(yǎng)殖場因沙門氏菌感染而造成大量死亡；夏維婕等對山東地區(qū)某鵪鶉養(yǎng)殖場調(diào)查發(fā)現(xiàn)，引起該場鵪鶉死亡的主要病原菌為大腸桿菌；張宗植等對延吉市某鵪鶉養(yǎng)殖場死亡病例研究發(fā)現(xiàn)，大腸桿菌和沙門氏菌混合感染是造成死亡的最主要致病菌；陳鑫等報道，南通地區(qū)鵪鶉飼養(yǎng)場送檢的10只鵪鶉，沙門氏菌分離率為100%；杭柏林等報道，在河南新鄉(xiāng)某鵪鶉養(yǎng)殖場死亡病例中，致病性大腸桿菌檢出率為100%；李章程等對四川地區(qū)產(chǎn)蛋鵪鶉死亡病例檢測結(jié)果表明，該場致病性大腸桿菌檢出率為100%。本研究對阜新地區(qū)野生及飼養(yǎng)鵪鶉進(jìn)行病原分離、鑒定，結(jié)果表明大腸桿菌和沙門氏菌為最主要致病菌，分離率分別為29.8%及15.1%。與報道數(shù)據(jù)相比分離率有一定差異，可能與地區(qū)性優(yōu)勢菌株差異有關(guān)。對自然環(huán)境中發(fā)現(xiàn)的野生鵪鶉尸體樣本分析發(fā)現(xiàn)，野生鵪鶉的混合感染情況十分嚴(yán)重，在14只野生鵪鶉尸體中均發(fā)現(xiàn)大腸桿菌和沙門氏菌混合感染。對飼養(yǎng)場內(nèi)獲得的樣本數(shù)據(jù)進(jìn)行分析也可發(fā)現(xiàn)，在病死鵪鶉尸體獲得的69份肝臟樣本中，大腸桿菌和沙門氏菌的分離率分別為39.1%和17.4%，而在患病但未死亡的鵪鶉泄殖腔棉拭子樣本中，上述分離率則為19.4%和6.5%，顯著低于死亡病例中的分離率，推測2種病原菌在鵪鶉感染、患病直至死亡的整個過程中均扮演著重要角色。建議該鵪鶉養(yǎng)殖場根據(jù)研究結(jié)果，合理制定治療方案及周圍環(huán)境綜合防控方案。