青蒿琥酯通過PI3K/GSK-3β通路對1型糖尿病小鼠胰島素抵抗的改善作用研究*

許艷玲 ，趙玉珠 ，付裕 ，穆中一

（1.沈陽市第五人民醫(yī)院內(nèi)分泌一科，沈陽 110000；2.遼寧省腫瘤醫(yī)院泌尿外科，沈陽 110000）

糖尿病是胰島素相對或絕對不足而導致的新陳代謝慢性紊亂綜合征[1]，1型糖尿病是由于胰島β細胞破壞導致的自身免疫缺陷[2]。研究表明，肥胖和胰島素抵抗是1型糖尿病的顯著特征，其患者的所有慢性并發(fā)癥與胰島素抵抗密切相關(guān)[3]。目前，治療1型糖尿病的主要藥物為免疫抑制劑如環(huán)孢素，但長期使用會機體造成不良反應[4]。因此，尋找對1型糖尿病有效且不良反應少的藥物成為研究熱點。

青蒿琥酯是青蒿素的半合成水溶性衍生物之一，具有抗炎抗菌、調(diào)節(jié)免疫、抗腫瘤等藥理作用[5]。研究表明，青蒿琥酯可抑制1型糖尿病大鼠的心血管并發(fā)癥[6]、視網(wǎng)膜病變[7]等。但青蒿琥酯對1型糖尿病的胰島素抵抗的研究較少。因此，本研究通過建立1型糖尿病動物模型，觀察青蒿琥酯對1型糖尿病的胰島素抵抗作用以及磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）/蛋白激酶 B（AKT）/糖原合成酶激酶-3β（GSK3β）/肝糖原合成酶（GS）信號通路的變化，為臨床應用提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 SPF級的雄性Balb/c小鼠60只[南方醫(yī)科大學實驗動物中心提供，許可證號：SCXK（粵）2016-0041]，12周齡，體質(zhì)量（20±5）g。所有小鼠均飼養(yǎng)于恒溫（25±2）℃，濕度50%～60%的無特殊病原體環(huán)境中，高壓滅菌的水和飼料隨意進食。本實驗方案通過本校實驗動物中心的批準，并且在國家衛(wèi)生研究所關(guān)于保護和使用實驗動物的方針指導下進行。

1.2 試劑及試劑盒 青蒿琥酯（60 mg，桂林南藥股份有限公司生產(chǎn)，批號：LA150444）；鏈脲佐菌素（STZ）（美國 Sigma，CA-OOS-105），胰島素（3 mL，賽諾菲制藥有限公司，批號：113439）；尿蛋白試劑盒（Merck，批號：232-917-9）；福爾馬林（濟南百博生物技術(shù)股份有限公司）；戊巴比妥鈉（上海信裕生物科技有限公司）；葡萄糖測定試劑盒（Merck，批號：MAK013-1KT）；胰島素酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）試劑盒（上海碧云天生物技術(shù)有限公司，批號：PI608）；硫代巴比妥酸試劑盒（齊一生物科技有限公司，批號：QY-R2814）；游離脂肪酸測定試劑盒（Merck，批號：MAK044-1KT）；Trizol試劑、RIPA 緩沖液、PMSF、BSA和BCA試劑（上海碧云天生物技術(shù)有限公司，批號：R0016，P0013B，ST505，P0007，P0012S）；PrimeScriptTM RT試劑盒（Takara Biotechnology，批號：RR037B）；SYBR-Green qPCR Master Mix（北京康潤誠業(yè)生物科技有限公司，批號：4309155）；兔抗鼠磷脂酰肌醇 3-激酶（PI3K）、蛋白激酶 B（Akt）、磷酸化蛋白激酶 B（p-Akt）、糖原合成酶激酶-3（GSK3β）、谷氨酰胺合成酶（GS）和GAPDH單分子抗體（Abcam，批號：ab278545，ab38449，ab8805，ab32391，ab81230，ab9485）；兔抗鼠 p-PI3K 和 p-GSK3β（CST，批號：17366，9322）山羊抗兔二抗（CST，批號：7074）；UltraSignal超敏 ECL化學發(fā)光底物（4A Biotech，批號：4AW011-100）。

1.3 實驗方法

1.3.1 實驗動物分組和建模 適應飼養(yǎng)1周后，將小鼠隨機分為4組：健康對照組、模型組、青蒿琥酯組和胰島素組，每組15只。除健康對照組外，其余各組小鼠單次空腹腹腔注射STZ 60 mg/kg[8]。48 h后尾靜脈采血測血糖，血糖含量≥10.0 nmol/L，認定為糖尿病模型構(gòu)建成功。健康對照組空腹注射等量的生理鹽水。青蒿琥酯干預濃度選取100 mg/kg，每次灌胃前將青蒿琥酯與生理鹽水渦旋成青蒿琥酯混懸液[9]。血糖檢測完畢后，青蒿琥酯組按100 mg/kg青蒿琥酯混懸液灌胃，每日1次。健康對照組和模型組每日灌胃等量生理鹽水，連續(xù)4周。胰島素組皮下注射4 U/kg甘精胰島素注射液[10]，每日1次，連續(xù)5 d。造模、干預期間死亡大鼠隨后補齊。

1.3.2 空腹血糖（FBG）、空腹胰島素（FINS）、胰島素抵抗指數(shù)（HOMA-IR）、肝臟三酰甘油（TG）、丙二醛（MDA）、血清游離脂肪酸（FFA）的檢測 藥物干預結(jié)束12 h，所有小鼠給予10%水合氯醛（3 mL/kg）腹腔注射，待麻醉后，將小鼠仰臥于解剖板上固定，分離腹主動脈，采取3 mL全血，3 000 r/min離心10 min分離血清，離心半徑為10 cm，于-20℃冰箱保存。葡萄糖測定試劑盒檢測血清中FBG含量，胰島素ELISA試劑盒檢測血清中FINS含量。HOMA-IR=（FBG×FINS）/22.5。TG由日立7020全自動生化分析儀檢測。MDA由硫代巴比妥酸試劑盒檢測。FFA由游離脂肪酸測定試劑盒（酶法）檢測。

1.3.3 蘇木精-伊紅（HE）染色觀察小鼠胰腺組織病理學 所有小鼠取血后，安樂死小鼠，摘取完整胰腺組織，取部分組織置入4%多聚甲醛中固定24 h，脫水、石蠟包埋、切片，進行HE染色，鏡下觀察小鼠胰島病理學。

1.3.4 Westernblot檢測 迅速剝離出肝組織，放入冰PBS洗去血水后。稱取所有組小鼠肝組織0.5 mg，放入低溫勻漿機100 Hz勻漿10 min后，RIPA緩沖液和苯甲基磺酰氟（PMSF）抑制蛋白降解液（100∶1）將樣本裂解后提取各組總蛋白。通過BCA試劑檢測蛋白質(zhì)的總濃度，將各組的總蛋白濃度調(diào)為一致后，將其于100℃進行變性后保存至-20℃。聚丙烯酰酶凝膠電泳（SDS-PAGE）分離總蛋白后，將其轉(zhuǎn)膜至聚偏二氟乙烯（PVDF）膜。然后用5%脫脂牛奶封閉2h，TBST洗滌3次，每次10min后，將其放入對應的一抗（PI3K、p-PI3K、Akt、p-Akt、GSK3β、p-GSK3β、GS和 GAPDH）和一抗稀釋混懸液（1∶1 000）中，4℃孵育過夜。TBST洗滌3次，放入二抗和二抗稀釋液（1∶4 000）混懸液中，室溫孵育2 h。TBST洗滌3次，每次10 min，將超敏發(fā)光液ECL滴在膜上，放入化學發(fā)光成像儀（USA）進行蛋白顯影。通過Image J軟件進行分析，相對蛋白表達以GAPDH標準化。

1.3.5 統(tǒng)計學方法 應用SPSS 20.0軟件進行數(shù)據(jù)分析，資料以均數(shù)±標準差（±s）表示，多組數(shù)據(jù)間的比較采用單因素方差分析（One-way ANOVA），組間兩兩比較采用LSD法，P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 青蒿琥酯對糖尿病小鼠空腹血糖的影響 STZ注射前，各組小鼠FBG值均差異無顯著性。STZ注射后7 d，與健康對照組比較，模型組、青蒿琥酯組和胰島素組的FBG值顯著增加（P＜0.05）。藥物干預4周后，與健康對照組比較，模型組的FBG含量顯著增加（P＜0.05）。與模型組比較，青蒿琥酯組和胰島素組的FBG含量顯著降低（P＜0.05）。與青蒿琥酯組比較，胰島素組的FBG含量顯著降低（P<0.05）。見表1。

表1 各組小鼠FBG值（±s）Tab.1 FBG values of mice in each group（±s）mmol/L

表1 各組小鼠FBG值（±s）Tab.1 FBG values of mice in each group（±s）mmol/L

注：與健康對照組比較，*P＜0.05；與模型組比較，#P＜0.05。

組別 動物數(shù) STZ注射前 STZ注射后 給藥4周后健康對照組 10 5.23±0.18 5.33±0.26 5.88±0.59模型組 10 5.46±0.36 18.48±0.39* 29.18±0.39*青蒿琥酯組 10 5.31±0.21 19.72±0.81* 18.38±0.72*#胰島素組 10 5.36±0.25 18.96±0.75* 11.31±0.35*#

2.2 青蒿琥酯對糖尿病小鼠空腹胰島素的影響 與健康對照組比較，模型組的FINS和HOMA-IR顯著增加（P＜0.05）。與模型組比較，青蒿琥酯組和胰島素組FINS和HOMA-IR顯著降低（P＜0.05）與青蒿酯組比較，胰島素組的FINS和HOMA-IR顯著降低（P<0.05）。見表 2。

表2 各組小鼠FINS和HOMA-IR值（±s）Tab.2 FINS and HOMA-IR values of mice in each group（±s）mU/L

表2 各組小鼠FINS和HOMA-IR值（±s）Tab.2 FINS and HOMA-IR values of mice in each group（±s）mU/L

注：與健康對照組比較，*P＜0.05；與模型組比較，#P＜0.05。

組別 動物數(shù) FINS HOMA-IR健康對照組 10 22.81±2.83 7.13±0.66模型組 10 55.61±3.16* 62.38±2.93*青蒿琥酯組 10 28.82±2.11*# 32.41±1.93*#胰島素組 10 25.91±2.97*# 20.18±2.17*#

2.3 青蒿琥酯對糖尿病小鼠胰島病理學的影響 健康對照組小鼠胰島形態(tài)規(guī)則，呈圓形細胞團，邊界清晰，胰島數(shù)和胰島內(nèi)細胞數(shù)量多且致密，細胞胞體飽滿、大小一致，核染清晰；模型組小鼠胰島明顯萎縮，輪廓變形、扭曲，邊界模糊，胰島數(shù)與胰島內(nèi)細胞數(shù)量減少，排列紊亂，分布稀疏，細胞核固縮、分裂甚至缺失，胰島周圍可見炎癥細胞浸潤；與模型組比較，青蒿琥酯組和胰島素組小鼠胰島形態(tài)、細胞體以及胰島數(shù)等病理明顯減輕，尤其是胰島素組病理學，更接近健康對照組。見圖1。

圖1 糖尿病小鼠胰島病理學（HE染色，×400）Fig.1 Pathology of pancreatic islets in diabetic mice(HE staining，×400)

2.4 青蒿琥酯對糖尿病小鼠TG、MDA和FFA的影響 與健康對照組比較，模型組的TG、MDA和FFA含量顯著增加（P＜0.05）。與模型組比較，青蒿琥酯組、胰島素組TG、MDA和FFA含量顯著降低（P＜0.05）。與青蒿琥酯組比較，胰島素組TG、MDA和FFA含量顯著降低（P<0.05）。見表3。

表3 各組小鼠TG、MDA和FFA值（±s）Tab.3 TG，MDA and FFA values of mice in each group（±s）mU/L

表3 各組小鼠TG、MDA和FFA值（±s）Tab.3 TG，MDA and FFA values of mice in each group（±s）mU/L

注：與健康對照組比較，*P＜0.05；與模型組比較，#P＜0.05。

組別 動物數(shù) TG MDA FFA健康對照組 10 22.81±2.83 7.13±0.66 41.31±3.85模型組 10 55.61±3.16* 62.38±2.93* 311.83±6.54*青蒿琥酯組 10 28.82±2.11*# 32.41±1.93*#122.62±2.98*#胰島素組 10 26.69±2.48*# 19.58±2.48*# 80.59±3.67*#

2.5 青蒿琥酯對糖尿病小鼠肝組織中PI3K/GSK3β信號通路的影響 與健康對照組比較，模型組小鼠肝組織中p-PI3K/PI3K和p-Akt/Akt蛋白表達量比值顯著降低（P＜0.05），p-GSK3β/GSK3β 蛋白表達量比值顯著增加（P＜0.05），GS蛋白表達量顯著減低（P＜0.05）。與模型組比較，青蒿琥酯組和胰島素組小鼠肝組織中p-PI3K/PI3K和p-Akt/Akt蛋白表達量比值顯著增加（P＜0.05），p-GSK3β/GSK3β 蛋白表達量比值顯著降低（P＜0.05），GS蛋白表達量顯著增加（P＜0.05）。與青蒿琥酯組比較，胰島素組小鼠肝組織中p-PI3K/PI3K和p-AKT/AKT蛋白表達量比值顯著增加（P<0.05），p-GSK3β/GSK3β 蛋白表達量比值顯著降低（P<0.05），GS蛋白表達量顯著增加（P<0.05）。見圖 2、表 4。

表4 各組小鼠肝組織PI3K、Akt、GSK3β和GS蛋白與磷酸化水平比值的比較（±s）Tab.4 Comparison of the ratio of PI3K，Akt，GSK3β and GS protein to phosphorylation level in liver tissues of mice（±s）

表4 各組小鼠肝組織PI3K、Akt、GSK3β和GS蛋白與磷酸化水平比值的比較（±s）Tab.4 Comparison of the ratio of PI3K，Akt，GSK3β and GS protein to phosphorylation level in liver tissues of mice（±s）

注：與健康對照組比較，*P＜0.05；與模型組比較，#P＜0.05。

組別 動物數(shù) p-PI3K/PI3K p-Akt/Aktp-GSK3β/GSK3β GS健康對照組 10 0.98±0.06 1.13±0.09 0.61±0.05 0.74±0.11模型組 10 0.18±0.03* 0.47±0.11* 1.83±0.14* 0.24±0.05*青蒿琥酯組 10 0.47±0.04*# 0.98±0.08*# 1.02±0.08*# 0.49±0.08*#胰島素組 10 0.74±0.03*# 1.06±0.07*# 0.88±0.06*# 0.61±0.05*#

圖2 各組小鼠肝組織PI3K、Akt、GSK3β和GS蛋白表達情況Fig.2 Expression of PI3K，Akt，GSK3β and GS protein in liver tissues of mice in each group

3 討論

糖尿病是由于致病因素引起的胰島素分泌缺乏或胰島素抵抗，從而引發(fā)糖代謝紊亂的疾病[11]。其中1型糖尿病是胰腺β細胞被破壞，致使胰島素分泌不足，導致機體多個器官處于高血糖環(huán)境，繼而誘發(fā)嚴重的并發(fā)癥[12]。本實驗采用STZ損傷胰島β細胞，制備1型糖尿病動物模型成功。

目前1型糖尿病主要治療手段是胰島素注射，但長期使用會增加感染、低血糖以及視網(wǎng)膜、神經(jīng)、心血管等疾病的風險[13-14]。因此，尋找有效且不良反應少的藥物非常重要。青蒿琥酯是具有過氧橋結(jié)構(gòu)的半倍萜內(nèi)酯類化合物，主要具有抗瘧疾作用，在自身免疫性疾病、過敏性炎癥疾病以及感染性疾病中發(fā)揮抗炎作用[15]。研究表明，青蒿琥酯可降低糖尿病大鼠中的血糖，從而抑制糖尿病的并發(fā)癥[16-17]發(fā)生。本研究結(jié)果顯示，青蒿琥酯可降低小鼠血糖濃度，改善小鼠胰島病理表現(xiàn)，并且對空腹胰島素抵抗具有抑制作用。青蒿琥酯還可減少1型糖尿病小鼠血清中TG、MDA和FFA含量，說明青蒿琥酯對降低1型糖尿病小鼠的血糖、減輕胰島素抵抗和改善胰島病理學具有一定的效果。

肝糖原含量對機體血糖水平的穩(wěn)定非常重要，PI3K/GSK3β是胰島素促進葡萄糖合成肝糖原的重要信號通路[18]。PI3K和AKT是GSK3β上游重要因子，PI3K磷酸化后活性增強，進一步激活AKT，然后直接磷酸化GSK3β絲氨酸位點，使其失去活性[19]。GSK3β可抑制GS的活性，導致糖原合成減少[21]。GSK3β與1型糖尿病的病理相關(guān)，GSK3β過表達或激活異常均可導致1型糖尿病[21]。本研究結(jié)果顯示，青蒿琥酯干預1型糖尿病小鼠4周后，小鼠胰腺中p-PI3K/PI3K和p-AKT/AKT蛋白表達量比值降低，GSK3β蛋白表達量增加，磷酸化水平減弱，且上述作用僅次于胰島素，表明青蒿琥酯可能通過激活1型糖尿病胰腺組織PI3K/GSK3β信號通路實現(xiàn)降糖、減輕胰島素抵抗和改善胰島病理學的目標。

綜上所述，青蒿琥酯具有降低血糖、減輕胰島素抵抗程度、增加肝糖原含量的作用，其機制與增強PI3K/GSK3β信號通路有關(guān)。這為探討糖尿病胰島素抵抗的發(fā)病機制和防治措施提供新的思路。然而，青蒿琥酯對糖尿病胰島素抵抗的改善作用，仍需更多動物模型進一步研究。