綿馬貫眾及其偽品的紅外指紋圖譜鑒別

程友斌，王政，褚朝森，孫靜

綿馬貫眾為鱗毛蕨科植物粗莖鱗毛蕨帶葉柄殘基的干燥根莖，始載于《神農本草經》，列為下品，其味苦，性微寒，有小毒，具有清熱解毒和驅蟲等功效［1］，主產于黑龍江、吉林等地，臨床用于治療疫毒感冒，蟲積腹痛等疾患，現(xiàn)代藥理研究表明其有抗病毒、抗腫瘤和抗菌等作用，在國家《新型冠狀病毒肺炎診療方案》中有推薦使用。近幾版《中國藥典》均將綿馬貫眾予以單列，然而因綿馬貫眾藥源植物歷史構成較為混亂，曾用作貫眾的原植物有11科18屬58 種之多［2］，經過長期考證和市場規(guī)范，目前市場上仍有約5種以上植物的根莖被混充作綿馬貫眾使用，他們在外觀形態(tài)特征上與綿馬貫眾十分相似，非鑒別經驗豐富者不能準確感官鑒定，常規(guī)理化鑒別如紫外可見光譜法（UV）、聚合酶鏈式反應（PCR）、高效液相色譜法（HPLC）等質量控制方法［3-4］均存在樣品處理程序復雜、耗時費力、難以完全滿足生產一線對其快速鑒別的需要，而紅外光譜法可從整體上把握中藥體系成分，具有取樣量小、快速、準確，以及專屬性和特征性強等特點［5-9］，可較好填補綿馬貫眾的這一實際需求，目前國內關于綿馬貫眾的研究［10-11］中尚未見到應用紅外光譜法鑒別綿馬貫眾正偽藥材的報道，亦鮮見使用紅外光譜對5 種偽品藥材整體進行鑒定的報道。本實驗于2019 年10 月至2020 年11 月以9 個產地綿馬貫眾與5 種偽品為研究對象，建立綿馬貫眾的紅外指紋圖譜，并結合二階導數(shù)、相似度評價，聚類分析和主成分分析（PCA），為綿馬貫眾的鑒別和質量評價提供參考。

1 材料與方法

1.1 藥材藥材購于吉林敦化、和龍、蛟河、龍井、汪清、通化、延吉，黑龍江牡丹江和尚志，以及安徽亳州、河北安國、廣西玉林等地，經湖北中醫(yī)藥大學藥學院生藥鑒定教研室潘宏林教授鑒定為綿馬貫眾、峨嵋蕨貫眾、鱗毛蕨貫眾、單芽狗脊蕨貫眾、狗脊蕨貫眾和蘇鐵蕨貫眾。憑證標本存于江蘇省連云港中醫(yī)藥高等職業(yè)技術學校中醫(yī)藥博物館，基源鑒定結果見表1。

1.2 儀器與試劑傅里葉變換紅外光譜儀（日本SHIMADZU 公司，型號IRPrestige-21），DLATGS檢測器、XS105DU 十萬分之一電子分析天平（METTLER TOLEDO 公司），HY-12 粉末壓片機（天津天光光學儀器有限公司），電熱恒溫鼓風干燥箱（DHG-9240A上海精宏實驗設備有限公司），瑪瑙研缽（阜新縣偉成瑪瑙廠）；溴化鉀（光譜純，天津市福晨化學試劑廠）。

1.3 方法

1.3.1 供試品的制備 取9份不同產地綿馬貫眾樣品，以及峨眉蕨貫眾、鱗毛蕨貫眾、單芽狗脊蕨貫眾、狗脊蕨貫眾和蘇鐵蕨貫眾等5 種偽品各一份于60 ℃干燥4 h，粉碎后過200 目篩，得到飲片粉末備用。取樣品粉末2 mg 至瑪瑙研缽中，加入120 ℃干燥后溴化鉀粉末作為分散劑，樣品與溴化鉀混合比例為1∶200，研磨均勻，取適量研磨后的粉末平鋪于紅外壓片磨具中，以25 MPa 壓力壓制60 s，取出，對光檢視，以樣片均勻，半透明為合格，作為供試品［12］。

1.3.2 紅外光譜分析條件 將制備好的供試品壓片置于紅外光譜儀中測定，測定波數(shù)段為4 000～400 cm-1，掃描信號累加20 次，分辨率為4 cm-1，室內溫度與濕度分別控制在24 ℃和25%～35%，掃描室實時扣除水和二氧化碳的干擾。掃描完成后，使用OMNIC8.2扣除背景，并進行基線校正和自動平滑處理，計算各樣品的二階導數(shù)紅外光譜平滑點數(shù)為17點。

1.3.3 方法學考察

1.3.3.1 精密度實驗 從14 份供試品中隨機取一份按“1.3.1”項下制備方法壓片，測定，連續(xù)掃描6次，以所得紅外光譜數(shù)據(jù)相似度為評價指標，評價儀器的精密度。結果6 次所測光譜相似度均在0.99以上，顯示紅外光譜儀精密度狀態(tài)良好。

1.3.3.2 重現(xiàn)性實驗 從14 份供試品中隨機取一份按“1.3.1”項下制備方法，平行壓片6 份，分別測定，以所得紅外光譜數(shù)據(jù)相似度為評價指標，評價實驗方法重現(xiàn)性。結果6份樣品光譜數(shù)據(jù)相似度均在0.98以上，表明本實驗方法重現(xiàn)性良好。

1.3.3.3 穩(wěn)定性實驗 從14 份供試品中隨機取一份按“1.3.1”項下制備方法壓片，供試品置于干燥器中，分別在0、1、2、3、4、5 h 時各測試1 次，匯總光譜圖，并以所得紅外光譜數(shù)據(jù)相似度為評價指標，評價實驗方法穩(wěn)定性。結果6個時段測定的光譜數(shù)據(jù)相似度均在0.98 以上，反映供試品在6 h 內穩(wěn)定性良好。

2 結果

2.1 共有峰確定與偽品原始光譜之間的比較分析將14 份供試品按照“1.3.1”項下制備方法分別壓片、測定，得到9 個產地綿馬貫眾光譜結果，通過對該9 批紅外光譜的分析和比較，確定了16 個共有峰，分別是530、577、610、705、766 、859、1 018、1 154、1 201、1 257、1 284、1 372、1 444、1 627、2 925、3 357 cm-1，數(shù)據(jù)見表2。

表1 9個產地綿馬貫眾（S1～S9）及5種偽品（W1～W5）來源及鑒定信息

將9批綿馬貫眾紅外光譜進行平均計算后作為共有模式，再與5種偽品原始光譜進行比較分析，結果顯示5 個偽品均存在一個吸收尖峰，而1 554～1 494 cm-1波段之間，共有模式為一個中等吸收肩峰，此外1 304～1 165 cm-1波段共有模式吸收強度小于偽品，其余波段吸收則均強于所有偽品。為進一步探索各樣品吸收峰之間的差別，本實驗又進行了二階導數(shù)分析。

2.2 二階導數(shù)光譜之間的比較分析綿馬貫眾共有模式與5種偽品二階導數(shù)圖譜比對見圖1，分析結果表明共有圖譜與5 種偽品在3 個不同波段上的吸收峰數(shù)目和強度均有不同，其中共有圖譜在4 000～3 500 cm-1波段為中等吸收，在1 748～1 604 cm-1波段吸收峰數(shù)目為4 個，5 種偽品與此不同。同時，對照原始光譜圖形，對1 554～1 494 cm-1波段之間光譜觀察，共有模式與5 個偽品在此區(qū)間均為峰谷。見表3。

表2 9個產地綿馬貫眾（S1～S9）及5種偽品（W1～W5）紅外圖譜相似度分析結果

圖1 綿馬貫眾共有模式與5種偽品（W1～W5）紅外二階導數(shù)光譜

表3 綿馬貫眾與5種偽品（W1～W5）的二階導數(shù)圖譜特征

2.3 相似度評價通過OMNIC 8.2 對所有供試品紅外光譜進行標峰，得到各吸收峰的波數(shù)與吸光度數(shù)值，以9 個產地綿馬貫眾供試品紅外光譜中共有峰吸光度的均值為參照，以夾角余弦和相關系數(shù)評價相似度，分別計算不同產地綿馬貫眾及5 種偽品的相似度。由表2可知，9個產地綿馬貫眾之間相似度很高，相關系數(shù)均在0.96以上，夾角余弦也在0.98以上，說明不同產地綿馬貫眾飲片質量基本穩(wěn)定，具有很好的一致性。同時與峨嵋蕨貫眾、鱗毛蕨貫眾、單芽狗脊蕨貫眾、狗脊蕨貫眾和蘇鐵蕨貫眾之間表現(xiàn)出較低的相似性，其中相關系數(shù)較高的是狗脊蕨貫眾（0.801），狗脊蕨貫眾（0.728），夾角余弦計算結果同樣反映綿馬貫眾與狗脊蕨貫眾和單芽狗脊蕨貫眾較為接近，分別為0.918 和0.905，同時5 種偽品之間相似度也存在差距，以蘇鐵蕨貫眾差別最大，此結果與正偽品性狀鑒定結果一致。

2.4 綿馬貫眾與各偽品之間的聚類分析根據(jù)表2紅外光譜分析結果，以各峰位的吸光度為變量，采用組間連接方法，選取歐氏平方距離作為區(qū)間測度，通過SPSS 22.0作為統(tǒng)計分析軟件進行分層聚類分析。結果可知在歐氏距離平方和為5 時，可以分成5 大類，其中9 個產地綿馬貫眾歸為一類（S1～S9），單芽狗脊蕨貫眾與狗脊蕨貫眾歸為一類（W3，W4），顯示二者親緣關系較近，而蘇鐵蕨貫眾（W5）、鱗毛蕨貫眾（W2）和峨嵋蕨貫眾（W1）則獨立分開，分析結果與相似度分析相一致。見圖2。

2.5 綿馬貫眾與各偽品之間的PCAPCA 是將多個變量通過線性變換以選出較少重量變量的一種多元統(tǒng)計分析方法，運用PCA 方法可以在不降低光譜差異的前提下，減少數(shù)據(jù)維數(shù)，將每條光譜與其他光譜進行比較［13-14］。將全部14批樣品紅外圖譜所有吸收峰吸光度值作為變量（見表2），通過SPSS 22.0 進行PCA，結果見圖3。圖3 為14 批樣品的三維散點圖，所提取的3 個成分對分析結果的貢獻率分別是75.7%、14.4%和6.3%，累計貢獻率達到了96.4%，包含了原數(shù)據(jù)中大部分信息，可知分析結果反映了樣品的真實情況。圖3 表明除了S1 和S8 產地為吉林敦化和通化的兩個樣品點稍有離散，其余綿馬貫眾樣品點基本重合（S2～S7），但仍然都較好地歸集到了一個區(qū)域，而W1～W5 全部偽品樣品點則完全離散，其中單芽狗脊蕨貫眾（W3）和狗脊蕨貫眾（W4）與綿馬貫眾距離相對較近，此結果與相似度分析和聚類分析保持一致。

3 討論

圖2 9個產地綿馬貫眾（S1～S9）及5種偽品（W1～W5）紅外光譜聚類分析譜系圖

圖3 9個產地綿馬貫眾（S1～S9）及5種偽品（W1～W5）紅外主成分分析圖

本實驗選取9 個產地綿馬貫眾和5 種常見偽品作為研究對象，建立了綿馬貫眾紅外光譜共有模式，利用原始紅外光譜和二階導數(shù)光譜進行圖形特征識別分析，利用相似度、聚類分析和PCA 的化學計量法進行了數(shù)據(jù)分析。結果表明9個產地綿馬貫眾紅外光譜相似度較高，相似度均在0.960 以上，紅外光譜吸收曲線亦大致重疊，但部分波段吸光度有高低之分，顯示各地樣品的成分含量存在差異，此結果可能與樣品生長地理環(huán)境之間存在關聯(lián)。共有光譜與5個偽品的比較結果顯示相似度最高的是W4狗脊蕨貫眾，其夾角余弦達到0.918，相關系數(shù)在0.801，其余依次走低，此趨勢與市場實際鑒別差錯率情況相符。共有峰與偽品圖譜進一步對比發(fā)現(xiàn)波段之間，5 個偽品均存在一個吸收尖峰，而共有模式為一個中等吸收肩峰。真?zhèn)螛悠返亩A導數(shù)光譜在1 554～1 494 cm-1區(qū)域雖然均為峰谷，但是谷形略有差別，此與原始光譜中的吸收峰和肩峰在二階導數(shù)中均顯示為峰谷特性有關，而二階導數(shù)在4 000～3 500 cm-1、1 748～1 604 cm-1和1 110～990 cm-1三個區(qū)域中吸收峰數(shù)目明顯不同，可資區(qū)別。進一步采用聚類分析方法分析結果表明在平方歐氏距離為5時，即可將9個產地綿馬貫眾與5種偽品歸為4類，正品綿馬貫眾1類，5個偽品歸為3類。PCA 結果也再次驗證了正品與偽品之間的親緣遠近關系，其中W3 單芽狗脊蕨貫眾和W4 狗脊蕨貫眾與綿馬貫眾離散度雖小，但依然能夠清晰分開，W1 峨眉蕨貫眾、W2 鱗毛蕨貫眾和W5 蘇鐵蕨貫眾離散相對較大，總體離散特征與正偽品外觀形態(tài)相似度十分相符，說明聚類分析和PCA 此兩個化學模式識別方法分析綿馬貫眾正偽品的紅外數(shù)據(jù)特征較為準確。

相對于綿馬貫眾UPLC、HPLC 和PCR［15-19］等質量分析手段而言，本紅外光譜鑒別實驗研究方法取樣量小，制樣簡單，分析速度快，并從整體上反應綿馬貫眾的成分信息，采用化學模式識別分析結果準確，可對市場長期存在的綿馬貫眾易混淆品種問題進行快速甄別，為實際檢驗和生產質量的前期控制提供有效手段和科學依據(jù)。