靈芝多糖和三萜減輕小鼠急性肺損傷作用的比較研究

施青青, 王超群, 張玉英, 李強(qiáng)明, 楊思林, 羅建平

(1.合肥工業(yè)大學(xué) 食品與生物工程學(xué)院,安徽 合肥 230601; 2.安徽省華信生物藥業(yè)股份有限公司,安徽 界首 236500)

靈芝(Ganodermalucidum),又名萬年茸、神芝、瑞草等。2000年版《中國藥典》首次承認(rèn)靈芝的藥用價(jià)值,并逐漸建立起靈芝質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的指紋圖譜[1]。靈芝作為我國具有2 000多年悠久歷史的藥食兼用真菌,素有“久食,輕身不老,延年神仙”的美譽(yù)[2]。多糖和三萜是靈芝的主要活性成分[3-4],大量工作表明兩者都具有保肝[5]、降糖[6]、抗HIV[7]、抗炎[8]、抗癌[9]等多種生物活性,但采用相同來源的原料,運(yùn)用相同的藥理模型、給藥途徑以及相同生藥量的給藥劑量對靈芝多糖(Ganodermalucidumpolysaccharides,GLP)和靈芝三萜(Ganodermalucidumtriterpenoids,GLT)的活性進(jìn)行比較的研究還很少。

急性肺損傷是一種以中性粒細(xì)胞浸潤、肺水腫和炎癥為特征的嚴(yán)重呼吸道疾病[10],可誘發(fā)急性呼吸窘迫綜合征,具有極高的發(fā)病率和死亡率[11]。文獻(xiàn)[12]中記載靈芝具有“補(bǔ)氣安神、止咳平喘”的功效?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明靈芝可通過激活一氧化氮合酶(NOS)活性增加一氧化氮(NO)的釋放、減少多形核中性粒細(xì)胞(polymorphonuclear neutrophil,PMN)在肺部的積聚以及炎性細(xì)胞在肺組織中的浸潤,對肺損傷起到保護(hù)作用[13-14]。為了在同一個(gè)病理模型下比較GLP和GLT生物活性的差異,本文以脂多糖(LPS)誘導(dǎo)的急性肺損傷模型為代表,對原料來源、給藥途徑、給藥生藥量相同的GLP和GLT的護(hù)肺功效進(jìn)行比較,以期對靈芝不同成分功效的合理評價(jià)和利用提供指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料與動(dòng)物

SPF級BALB/C雄性小鼠(5～6周齡,(18±2) g)購于常州卡文斯實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司,實(shí)驗(yàn)動(dòng)物許可證號SCXK(蘇)2016-0010;靈芝子實(shí)體(安徽利民生物科技股份有限公司)經(jīng)合肥工業(yè)大學(xué)食品與生物工程學(xué)院羅建平教授鑒定。

1.2 試劑與儀器

脂多糖(LPS)(Biosharp公司);髓過氧化物酶(MPO)試劑盒(南京建成生物工程研究所);腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、白介素-1β(IL-1β)ELISA試劑盒(上海源葉生物科技有限公司);CD68、羊抗兔IgG抗體(博士德生物工程有限公司);化學(xué)發(fā)光法電泳遷移率變動(dòng)分析(electrophoretic mobility shift assay,EMSA)試劑盒、生物素標(biāo)記EMSA探針-激活蛋白-1(activator protein-1,AP-1)、EMSA探針-AP1、生物素標(biāo)記EMSA探針-核因子(nuclear factor-kappa B,NF-κB)、EMSA探針-NF-κB(碧云天生物技術(shù)有限公司);Hei-VAP Advantage旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(德國Heidolph公司);Varioskan Flash全波長酶標(biāo)儀(美國ThermoFisher公司);DS-U2熒光顯微鏡(日本Nikon公司);Mini-PROTEAN Tetra電泳槽(美國Bio-Rad公司);LAS4000Mini化學(xué)發(fā)光成像儀(美國GE公司)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 GLP和GLT的提取與理化性質(zhì)分析

GLP根據(jù)文獻(xiàn)[15]方法提取獲得(提取率為1.43%)。GLT根據(jù)文獻(xiàn)[16]的方法提取獲得(提取率為0.219%)。根據(jù)文獻(xiàn)[17],采用傅里葉變換紅外光譜(Fouier transform infrared spectroscopy,FTIR)、甲基化分析、氣-質(zhì)聯(lián)用(gas chromatography-mass spectrometry,GC-MS)方法對GLP的結(jié)構(gòu)特性進(jìn)行分析。根據(jù)文獻(xiàn)[18],采用液質(zhì)聯(lián)用(liquid chromatography-mass spectrometry,LC-MS)對GLT的組成成分進(jìn)行分析。

1.3.2 小鼠急性肺損傷模型的建立與處理

BALB/C小鼠適應(yīng)性培養(yǎng)3～5 d后,隨機(jī)分為9組(每組10只),包括空白對照組(N)、模型組(M)、陽性藥物對照組(P)、GLP低劑量組(GLP-L)、GLP中劑量組(GLP-M)、 GLP高劑量組(GLP-H)、GLT低劑量組(GLT-L)、GLT中劑量組(GLT-M)、GLT高劑量組(GLT-H)。GLP的低、中、高劑量分別為100、200、400 mg/(kg·d)。為了將GLP和GLT在相同藥材使用量下進(jìn)行活性比較,依據(jù)GLP和GLT各自的提取率,設(shè)計(jì)GLT的低、中、高劑量分別為15.3、30.6、61.2 mg/(kg·d)。GLP和GLT均溶解于含0.1% DMSO的生理鹽水中,空白對照組、模型組和陽性藥物對照組灌胃給予相同體積的含0.1% DMSO的生理鹽水,連續(xù)28 d。第28天時(shí)陽性藥物對照組小鼠腹腔注射給予地塞米松(DEX)1 mg/kg。末次給藥0.5 h后,除空白對照組外,其他組通過腹腔注射給予脂多糖(LPS)5 mg/kg以建立急性肺損傷模型[14]。24 h后CO2窒息處死所有小鼠,收集支氣管肺泡灌洗液(broncho alveolar lavage fluid,BALF)、血清、肺組織等備用。

1.3.3 肺組織濕/干質(zhì)量比分析

收集小鼠肺組織后稱重,記錄為濕質(zhì)量,隨后將肺組織置于烘箱80 ℃烘烤48 h至恒,進(jìn)行稱重并記錄為干質(zhì)量,計(jì)算肺組織濕/干質(zhì)量比值。

1.3.4 MPO活性檢測

小鼠肺組織置于預(yù)冷的生理鹽水中進(jìn)行勻漿,離心(4 ℃,3 000 r/min,10 min)取上清,根據(jù)MPO檢測試劑盒說明書進(jìn)行檢測。

1.3.5 ELISA檢測

血清、BALF和肺組織中的炎癥因子TNF-α和IL-1β表達(dá)水平通過ELISA法檢測,操作方法根據(jù)ELISA試劑盒說明書進(jìn)行。

1.3.6 組織病理學(xué)分析

按文獻(xiàn)[19]方法,肺組織經(jīng)4%多聚甲醛固定、石蠟包埋、切片,隨后進(jìn)行H&E染色,光學(xué)顯微鏡觀察并拍照分析。

1.3.7 免疫組化分析

按文獻(xiàn)[19]方法,肺組織石蠟切片分別與一抗(CD68)、二抗(IgG)和二氨基聯(lián)苯二胺鹽(DAB)顯色劑孵育,光學(xué)顯微鏡觀察并拍照分析。

1.3.8 EMSA分析

按文獻(xiàn)[19]方法,采用EMSA法檢測肺組織中NF-κB和AP-1的DNA結(jié)合活性,所使用的生物素標(biāo)記的DNA探針序列如下:

NF-κB:5’-AGTTGAGGGGACTTTCCCAGGC-3’,

3’-TCAACTCCCCTGAAAGGGTCCG-5’;

AP-1:5’-CGCTTGATGACTCAGCCGGAA-3’,

3′-GCGAACTACTGAGTCGGCCTT-5′。

1.3.9 數(shù)據(jù)分析

所有實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次,實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均用SPSS19.0軟件處理,數(shù)據(jù)以(均值±標(biāo)準(zhǔn)差)表示,不同組間比較采用單因素方差分析及最小顯著差異法(LSD)多重比較檢驗(yàn),與正常組相比,#P<0.01有顯著性差異;與模型組相比,*P<0.05有顯著性差異,**P<0.01有極顯著性差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 GLP和GLT的結(jié)構(gòu)特性分析

FTIR分析可用于判斷和鑒定多糖的有機(jī)官能團(tuán)。GLP與GLT的結(jié)構(gòu)特性如圖1a所示,從圖1a可看出,GLP具有典型的多糖吸收峰,其中3 352 cm-1為多糖 O—H 的伸縮振動(dòng)吸收峰,2 925 cm-1為多糖基團(tuán)上的C—H的伸縮振動(dòng)吸收峰,1 604 cm-1為多糖C=O的伸縮振動(dòng)吸收峰,1 418 cm-1為C—H 的變角振動(dòng)吸收峰,1 044 cm-1為吡喃糖環(huán)上 C—O—C的不對稱伸縮振動(dòng)峰,888 cm-1為吡喃糖環(huán)β-型糖苷鍵的 C—H 變角振動(dòng)峰[20]。這些特征峰表明GLP是β-型多糖。

多糖經(jīng)甲基化、水解、還原和乙?；幚砗?生成部分甲基化的糖醇乙酸酯衍生物的GC-MS分析如圖1b所示,從圖1b可以看出,GLP由葡萄糖、甘露糖和半乳糖組成,糖苷鍵類型主要有1-linked D-Glcp、1,3-linked D-Glcp、1,4-linked D-Glcp、1,6-linked D-Glcp、1,2,6-linked D-Glcp、1,6-linked D-Galp、1,2,6-linked D-Galp和1,3,6-linked D-Manp 8種,與文獻(xiàn)報(bào)道相符[21-22]。

LC-MS分析結(jié)果如圖1c所示,從圖1c可看出,GLT的組成成分與文獻(xiàn)[23-24]結(jié)果相符,主要為GLT類化合物,包含Ganoderic acid C、Ganoderic acid C6、Ganoderic acid D、Ganoderic acid B和Ganoderic acid E等成分。

2.2 對小鼠肺水腫和肺損傷的影響

小鼠肺水腫程度通過測定肺臟器指數(shù)和濕/干質(zhì)量比來衡量,結(jié)果如圖2a、圖2b所示。肺組織H&E染色的結(jié)果如圖2c所示。圖2中，1～9分別代表N、M、P、GLP-L、GLP-M、GLP-H、GLT-H、GLT-M、GLT-L。下同。

(c) H&E染色結(jié)果

從圖2a、圖2b可看出,與正常對照組小鼠相比,LPS刺激導(dǎo)致模型組小鼠的肺臟器指數(shù)和濕/干質(zhì)量比都顯著升高(P<0.01),說明LPS刺激可導(dǎo)致小鼠肺水腫。GLP各劑量組可顯著降低LPS升高的小鼠肺臟器指數(shù)和濕/干質(zhì)量比(P<0.01),緩解LPS誘導(dǎo)的小鼠肺水腫,并且呈一定的劑量依賴關(guān)系;GLT各劑量組也可有效降低LPS升高的小鼠肺臟器指數(shù)(P<0.01),但對LPS升高的小鼠肺濕/干質(zhì)量比的降低能力隨劑量的減少而減弱。與模型組小鼠相比,GLP各劑量組對LPS升高的小鼠肺臟器指數(shù)和濕/干質(zhì)量比的降低能力均顯著高于GLT各劑量組的能力(P<0.01)。由圖2c可知，正常小鼠肺泡組織完整,無明顯炎性細(xì)胞浸潤,肺泡間隔沒有增厚,LPS可導(dǎo)致模型組小鼠肺泡結(jié)構(gòu)嚴(yán)重破壞,而GLP和GLT可逆轉(zhuǎn)LPS誘導(dǎo)的肺損傷,GLP組小鼠肺泡結(jié)構(gòu)的恢復(fù)呈劑量效應(yīng),GLT組小鼠肺泡結(jié)構(gòu)的破壞在中、高劑量時(shí)出現(xiàn)一定緩解,但是效果比GLP組稍差。上述結(jié)果表明,GLP和GLT可不同程度地緩解LPS誘導(dǎo)的小鼠肺水腫和肺損傷,且GLP的效果強(qiáng)于GLT。

2.2 對小鼠肺組織炎性細(xì)胞浸潤的影響

GLP、GLT對LPS誘導(dǎo)急性肺損傷小鼠肺組織炎性細(xì)胞浸潤的影響如圖3所示。

圖3 GLP、GLT對LPS誘導(dǎo)小鼠肺組織炎性細(xì)胞浸潤的影響

由圖3a、圖3b可知,與空白對照組相比,LPS刺激可導(dǎo)致模型組小鼠BALF中的總細(xì)胞數(shù)量顯著升高,而給予GLP和GLT可分別導(dǎo)致BALF中總細(xì)胞數(shù)量減少79.1%(GLP-L)、84.4%(GLP-M)、85.8%(GLP-H)、78.2%(GLT-L)、79.3%(GLT-M)和82.8%(GLT-H)。MPO的活性是肺組織炎癥反應(yīng)過程中反映中性粒細(xì)胞浸潤的常用指標(biāo)[25]。與空白對照組相比,LPS刺激可導(dǎo)致模型組小鼠肺組織的MPO活性顯著升高(P<0.01),表明中性粒細(xì)胞浸潤到肺部,肺組織產(chǎn)生了炎癥。與模型組相比,GLP和GLT各劑量組均可顯著降低LPS誘導(dǎo)的肺組織MPO活性的升高(P<0.01),且呈劑量依賴性,其中GLP各劑量組降低MPO活性的效果較GLT各劑量組明顯,具有顯著差異(P<0.01或P<0.05)。

肺組織的免疫組化分析如圖4所示。

從圖4可以看出,LPS刺激可導(dǎo)致模型組小鼠肺組織出現(xiàn)大量巨噬細(xì)胞浸潤(CD68陽性細(xì)胞),而GLP和GLT可不同程度地降低LPS所致的肺組織巨噬細(xì)胞浸潤,尤其是GLP-H組的小鼠,其肺組織與空白對照組小鼠的肺組織相比,無明顯差異。結(jié)果表明,GLP和GLT可以顯著降低LPS誘導(dǎo)的急性肺損傷小鼠的炎性細(xì)胞浸潤,且GLP在下調(diào)肺組織MPO活性方面的作用強(qiáng)于GLT。

圖4 肺組織的CD68免疫組化分析

2.3 對肺組織、BALF、IL-1β和TNF-α水平的影響

GLP和GLT對LPS致急性肺損傷小鼠肺組織、BALF及血清中IL-1β和TNF-α水平的影響如圖5所示。

圖5 GLP和GLT對小鼠的肺組織、BALF及血清中TNF-α和IL-1β表達(dá)的影響

由圖5可知,LPS可導(dǎo)致模型組小鼠肺組織、BALF及血清中的炎癥因子IL-1β和TNF-α表達(dá)水平都顯著升高(P<0.01),而這種升高現(xiàn)象可被GLP和GLT所逆轉(zhuǎn),且呈現(xiàn)一定的劑量依賴性。在GLP-H組小鼠中,肺組織、BALF及血清中的IL-1β表達(dá)水平可被分別降至模型組小鼠的55.8%、80.5%、77.5%,TNF-α表達(dá)水平可被分別降至模型組小鼠的57.6%、75.7%、67.8%;而在GLT-H組小鼠中,肺組織、BALF及血清中的IL-1β表達(dá)水平可被分別降至模型組小鼠的70.7%、88.4%、90.2%,TNF-α表達(dá)水平可被分別降至模型組小鼠的69.3%、83.4%、75.5%。對比GLP和GLT的效果可得出,在下調(diào)肺組織、BALF和血清中TNF-α水平方面及下調(diào)肺組織和血清中IL-1β水平方面,GLP各劑量組的改善效果均優(yōu)于GLT各劑量組,且改善效果具有顯著性差異(P<0.01或P<0.05)。結(jié)果表明,GLP和GLT均可以顯著降低LPS誘導(dǎo)的急性肺損傷小鼠的炎癥水平,GLP的總體作用強(qiáng)于GLT。

2.4 對NF-κB、AP-1結(jié)合DNA活性的影響

GLP和GLT對NF-κB、AP-1結(jié)合DNA活性的影響如圖6所示。

圖6中,Probe Ⅰ代表生物素標(biāo)記的探針;Probe Ⅱ代表先與未標(biāo)記的探針進(jìn)行孵育,再與生物素標(biāo)記探針孵育的核蛋白。

(d) AP-1的EMSA結(jié)果灰度值

從圖6可以看出,與正常對照組相比,LPS處理可導(dǎo)致小鼠肺組織NF-κB和AP-1的DNA結(jié)合活性明顯增強(qiáng),而GLP和GLT各劑量組可以顯著抑制NF-κB和AP-1結(jié)合DNA活性的升高,且抑制程度隨劑量的增加逐漸增強(qiáng);與模型組相比,GLP各劑量組對NF-κB和AP-1結(jié)合DNA活性的抑制效果顯著優(yōu)于相應(yīng)的GLT各劑量組(P<0.01)。NF-κB和AP-1分別屬于NF-κB信號通路和MAPKs信號通路中重要的轉(zhuǎn)錄因子,結(jié)果表明在LPS誘導(dǎo)的急性肺損傷小鼠中,肺組織激活的NF-κB和MAPKs炎性信號通路可被GLP和GLT抑制,且GLP的抑制效果優(yōu)于GLT。

3 討 論

以往的研究運(yùn)用百草枯中毒肺損傷大鼠模型[26]、家兔失血性休克再灌注的肺損傷模型[27]、博來霉素(BLM)誘導(dǎo)的肺纖維化大鼠模型[14]及LPS誘導(dǎo)的小鼠急性肺損傷模型[28],分別考察了靈芝孢子粉、GLP、GLT等化合物對肺損傷的保護(hù)作用,但因模型、原料來源和給藥劑量各異,無法對靈芝的不同部位或不同成分的藥理活性進(jìn)行比較。本研究采用相同的LPS誘導(dǎo)的急性肺損傷小鼠模型,在給藥原料來源、劑量相同的條件下對GLP和GLT的肺損傷保護(hù)作用進(jìn)行了比較研究,盡管兩者對LPS致急性肺損傷均有保護(hù)作用,但無論是在肺水腫、肺指數(shù)、肺部病理學(xué)變化、肺組織炎性細(xì)胞浸潤的改善方面,還是在肺組織、肺泡灌洗液和血液中TNF-α和IL-1β分泌水平的下降方面GLP的效果均優(yōu)于GLT(P<0.01或P<0.05)。

NF-κB和MAPK信號通路是經(jīng)典的2條炎癥通路,在LPS的刺激下,NF-κB通路經(jīng)IκBα 的磷酸化激活NF-κB,MAPK通路經(jīng)ERK、JNK和p38的磷酸化激活A(yù)P-1,激活的NF-κB和AP-1激發(fā)炎性相關(guān)細(xì)胞因子的表達(dá),參與LPS誘導(dǎo)的急性肺損傷[29-31]。GLT已被證明可以通過抑制LPS激活的IκBα磷酸化抑制NF-κB激活[26],減緩LPS誘導(dǎo)的急性肺損傷。本研究EMSA分析表明,GLP和GLT可以逆轉(zhuǎn)LPS升高的NF-κB和AP-1的DNA結(jié)合程度,說明GLP和GLT抑制了LPS激活的NF-κB信號通路和MAPK信號通路介導(dǎo)的肺損傷炎癥反應(yīng),而且GLP對LPS激活的炎性信號通路的抑制效果優(yōu)于GLT(P<0.01)。

4 結(jié) 論

綜上所述,GLP和GLT均能夠明顯緩解LPS誘導(dǎo)的小鼠急性肺損傷,在相同的動(dòng)物模型、原料來源、原料劑量、給藥方式下,GLP能比GLT更有效地抑制NF-κB和MAPK信號途徑的激活,減少炎性因子的表達(dá),進(jìn)而抑制肺組織的炎性進(jìn)程,降低肺水腫和肺組織結(jié)構(gòu)破壞,對LPS致小鼠急性肺損傷起到保護(hù)作用。結(jié)果表明,對靈芝不同化學(xué)成分的功效評價(jià)應(yīng)基于相同的評價(jià)條件,從而為靈芝的合理開發(fā)利用奠定基礎(chǔ)。