VITEK 2 Compact 聯(lián)合MALDI-TOF MS、16S rDNA基因測序?qū)?株類志賀鄰單胞菌的對比鑒定報告

朱衛(wèi)平，鄧洪巖，劉君

湘潭市中心醫(yī)院微生物科，湖南 湘潭 411100

類志賀鄰單胞菌現(xiàn)屬于腸桿菌科，曾被歸為弧菌科，是人類條件致病菌。該菌不作為常規(guī)監(jiān)測，且其臨床癥狀與其他菌難以被區(qū)分，導(dǎo)致該菌引起的感染易被忽視[1-2]。國內(nèi)外僅有個例報道類志賀鄰單胞菌可引起敗血癥[3-4]，人類食用攜帶類志賀鄰單胞菌的食物(如黃鱔)后會出現(xiàn)腹瀉等癥狀[5]。該菌引起的腹瀉為輕微的腸炎或痢疾，霍亂樣病變少見，常有腹瀉伴腹痛，少有發(fā)熱、反胃和嘔吐?；魜y弧菌為國家法定甲類傳染病霍亂的病原菌，僅O1群和O139群產(chǎn)毒株會導(dǎo)致霍亂流行，引發(fā)烈性腸道傳染病，根據(jù)《中華人民共和國傳染病防治法》要求，發(fā)現(xiàn)后應(yīng)立即上報當(dāng)?shù)匦l(wèi)生行政部門；而O1和O139群的非產(chǎn)毒株及其他血清群只引起散發(fā)病例或小規(guī)模的暴發(fā)，可按一般感染性腹瀉處置。因此，病原菌的快速準(zhǔn)確鑒定很重要。

Vitek 2 Compact全自動細菌鑒定分析系統(tǒng)采用八進位制數(shù)碼鑒定原理，測試卡內(nèi)包含30項生化反應(yīng)。該系統(tǒng)的鑒定原理是表型鑒定，其生化鑒定結(jié)果易受到菌株生長狀態(tài)、培養(yǎng)基成分、傳代次數(shù)等多項因素的影響。

2020年7月15日湘潭市中心醫(yī)院收治1例無明顯誘因腹痛的患者，其血培養(yǎng)檢出1株革蘭陰性桿菌。初期經(jīng)VITEK 2 Compact系統(tǒng)檢測，鑒定為霍亂弧菌。為求結(jié)果的準(zhǔn)確性，又進行了質(zhì)譜鑒定和16S rDNA基因測序，最終確認(rèn)為類志賀鄰單胞菌?，F(xiàn)將該病例感染菌株的鑒定及分析過程報道如下。

1 臨床材料

1.1 病例資料

患者，男，45歲，自述2020年7月15日20時左右無明顯誘因出現(xiàn)腹痛，為中上腹持續(xù)性脹痛，大便為黃色水樣便，7～8次/日，伴嘔吐1次，嘔吐物為胃內(nèi)容物，嘔吐后自覺中上腹脹痛好轉(zhuǎn)，隨后感臍周及中下腹疼痛，性質(zhì)難以描述，伴咳嗽、咳痰，痰為黃色膿痰，伴氣促，偶有胸痛，無反酸、噯氣，無發(fā)熱，無胸悶，無頭暈、頭痛等不適。為求診治遂來湘潭市中心醫(yī)院就診，在就診時患者感畏寒、寒戰(zhàn)，急診收住消化內(nèi)科。患者起病以來，精神、睡眠、食欲欠佳，小便正常，體重改變不明顯。既往多次入住該科，末次入院為2020年6月20日—7月6日，診斷如下：1.不明原因肝硬化失代償期；2.左側(cè)化膿性中耳炎；3.左輸尿管上段結(jié)石并左腎輕度積水；4.腸系膜區(qū)及腹膜后多發(fā)小淋巴結(jié)；5.慢性膽囊炎；6.脾臟囊腫；7.肝右葉鈣化灶，右肝血管瘤可能；8.升結(jié)腸管壁增厚、水腫，結(jié)腸炎，結(jié)腸多發(fā)息肉，右膈下間位結(jié)腸；9.非萎縮性胃炎、胃體小息肉；10.糖尿病待分型；11.腰椎退行性變，L4/5、L5/S1椎間盤輕度變性膨出； 12.闌尾切除術(shù)后；13.副鼻竇炎(輕度)；14.左側(cè)中耳乳突炎；15.左腎細小鈣化或結(jié)石；16.中度貧血；17.凝血功能障礙；18.肝功能不全。目前，服用蘭索拉唑腸溶片 1次2片，1天1次；呋塞米片1次1片，1天1次；螺內(nèi)酯 1次3片，1天1次；利可君 1片，1天3次；水飛薊賓葡甲胺片 2片，1天3次；普萘洛爾 1次1片，1日3次；促肝細胞生長素腸溶膠囊2片，1天3次。7月14日感左耳仍有少許流膿，患者外出途中被狗咬傷，至本院急診予以局部消毒及接種狂犬疫苗。否認(rèn)高血壓病、冠心病病史，否認(rèn)肝炎、結(jié)核等傳染病史，有輸血史，否認(rèn)食物、藥物過敏史，預(yù)防接種史不詳。

入院查體情況如下。體溫38.5 ℃，脈搏88次/min，呼吸頻率25次/min，血壓14.098/6.384 kpa。慢性肝病病容，精神尚可，貧血貌，皮膚鞏膜無黃染，淺表淋巴結(jié)不大，雙肺呼吸音清，未聞及明顯干濕性啰音。心率88次/min，律齊，無雜音。腹膨隆，腹部見陳舊性手術(shù)疤痕，未見胃腸型及蠕動波，腹平軟，全腹無壓痛及反跳痛，肝脾肋下未捫及、未觸及腫塊，肝腎區(qū)無叩痛，移動性濁音陽性，腸鳴音正常。雙下肢輕度水腫，右小腿下段外側(cè)可見一犬咬傷傷口，無活動受限。凝血功能+D-二聚體：活化部分凝血酶原時間(APTT) 57.0 s，凝血酶原時間比率 1.80，國際標(biāo)準(zhǔn)化比率(INR) 2.11，凝血酶原時間(PT-SEC) 23.20 s，凝血酶原時間活動度(PTA) 37.0%，纖維蛋白原(FIB) 1.30 g/L，APTT比率 1.54，D-二聚體 4.37 μg/mL。 腎功能常規(guī)檢查+血清γ-谷氨?；D(zhuǎn)移酶測定+淀粉酶+脂肪酶+血酮體測定+C反應(yīng)蛋白測定+血糖+肝功能常規(guī)檢查+堿性磷酸酶測定+心肌酶譜常規(guī)檢查+電解質(zhì)常規(guī)如下：球蛋白(GLB) 37.2 g/L，葡萄糖(GLU) 8.69 mmol/L，總膽紅素(TBIL) 37.7 μmol/L，脂肪酶(LIP) 150.8 U/L，肌紅蛋白(MYO) 250.40 μg/L，血清鈣(OCA) 2.10 mmol/L，堿性磷酸酶(ALP) 189.0 IU/L，總膽汁酸(OTBA) 68.80 μmol/L，白蛋白(ALB) 30.4 g/L，谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST) 55.1 IU/L，白蛋白和球蛋白比例(A/G) 0.82，直接膽紅素(DBILB) 21.3 μmol/L，肌酸激酶(CK) 215.0 IU/L，肌酐(CREA) 41.0 μmol/L，CK同工酶(CK-MB) 61.9 IU/L。 血氣分析：二氧化碳分壓(PCO2) 3.15 kPa，二氧化碳總量(TCO2) 14.6 mmol/L，標(biāo)準(zhǔn)碳酸氫根(SB) 16.4 mmol/L。血常規(guī)：血小板(PLT) 44.0×109/L，血紅蛋白(HGB) 80.0 g/L，紅細胞計數(shù)(RBC) 3.05×1012/L，嗜中性粒細胞(NE%) 84.5%，白細胞計數(shù)(WBC) 3.02×109/L，甲狀腺功能3項、肌鈣蛋白、降鈣素原正常。心電圖：竇性心律，逆鐘向轉(zhuǎn)位，頻譜心電圖FCG(-)。入院后大便培養(yǎng)未檢出沙門菌、志賀菌。

本次入院診斷主要為腹痛查因，暫給予哌拉西林/他唑巴坦抗感染、抑酸護胃、護肝、升白細胞、利尿、降門脈壓、維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定等對癥支持治療。3日后藥敏結(jié)果為亞胺培南、頭孢吡肟、頭孢哌酮/舒巴坦、哌拉西林/他唑巴坦、替加環(huán)素、阿米卡星、左氟沙星、美羅培南、強力霉素敏感，復(fù)方新諾明、環(huán)丙沙星耐藥，頭孢他啶中介。根據(jù)藥敏結(jié)果未調(diào)整治療方案，繼續(xù)予以哌拉西林/他唑巴坦抗感染，住院14天后癥狀好轉(zhuǎn)出院。

1.2 材料和方法

1.2.1 儀器與試劑梅里埃VITEK 2 Compact 全自動細菌鑒定及藥敏分析系統(tǒng)及配套卡片購于梅里埃診斷產(chǎn)品(上海)有限公司；全自動細菌培養(yǎng)系統(tǒng)BD BACTEC FX200及配套血培養(yǎng)瓶購于碧迪醫(yī)療器械(上海)有限公司；血瓊脂平板、麥康凱、巧克力平板、四號瓊脂平板均購于廣州市迪景微生物科技有限公司；堿性蛋白胨水購于江門市凱林貿(mào)易有限公司；O1群、O139群霍亂弧菌診斷血清購自寧波天潤生物藥業(yè)有限公司。

1.2.2 實驗室檢測嚴(yán)格按照《全國臨床檢驗操作流程》(第4版)操作。首先，進行細菌培養(yǎng)，于2020年7月15日22:00采集病人血標(biāo)本注入血培養(yǎng)瓶(厭氧及需氧瓶均8～10 mL)后，按說明書采用BD BACTEC FX200系統(tǒng)進行培養(yǎng)。隨后，進行細菌鑒定， 7 h后需氧血培養(yǎng)瓶報陽性，轉(zhuǎn)種血平板、麥康凱、巧克力平板，直接涂片革蘭染色，鏡檢報告危急值。7月17日挑取血平板上細菌制成菌懸液，經(jīng)VITEK 2 Compact鑒定為霍亂弧菌后，補做O1群/O139群霍亂弧菌診斷血清凝集試驗、接種堿性蛋白胨水及4號瓊脂平板。

進一步進行質(zhì)譜鑒定，委托上級單位中南大學(xué)湘雅醫(yī)院采用基質(zhì)輔助激光解析電離飛行時間質(zhì)譜技術(shù)(MALDI-TOF MS)完成；基因測序由北京瑞博興科生物技術(shù)有限公司完成。靶向DNA測序鑒定采用16S rDNA片段引物參照既有方法合成[6]：P16F: 5’-AGAGTTTGATCATGGCTCAG-3’(20 bp)，P16R: 5’-GGTTACCTTGTTACGAC-TT-3’(19 bp)，擴增細菌16S rDNA基因片段。PCR體系：10×PCR緩沖液2 μL，10 mmol/L 脫氧核糖核苷三磷酸(deoxy-ribonucleoside triphosphate，dNTP)1 μL，2對10 μmmol/L 引物各 1 μL，5 U/μL Taq DNA聚合酶 0.5 μL，模板 1 μL，加 ddH2O 補充至 20 μL。優(yōu)化后的循環(huán)參數(shù)：95 ℃預(yù)變性 5 min(95 ℃ 1 min ，56 ℃ 1 min，72 ℃ 2 min 30 s)35個循環(huán)，72 ℃ 延伸7 min。

2 結(jié)果

2.1 鏡檢及菌落形態(tài)

用接種環(huán)取1環(huán)堿性蛋白胨水于玻片上涂開，鏡檢可見少量細菌快速定向運動。血瓊脂平板上可見直徑約1.5 mm、光滑、灰色、凸起、不透明、β溶血菌落(見圖1)，4號瓊脂平板可見半透明菌落，結(jié)果顯示為革蘭陰性桿菌。

圖1 血平板上菌落形態(tài)Fig.1 Colony morphology on blood plate

2.2 菌株鑒定

Vitek 2 Compact GN鑒定卡生化反應(yīng)結(jié)果顯示，β半乳糖苷酶、β-N-乙酰葡萄糖苷酶、D-葡萄糖、葡萄糖發(fā)酵、D-麥芽糖、L-脯氨酸芳胺酶、酪氨酸芳胺酶、蔗糖、D-海藻糖、琥珀酸鹽產(chǎn)堿、氨基乙酸芳胺酶、鳥氨酸脫酸酶、賴氨酸脫酸酶、COURMARATE、O/129耐受、ELLMAN均為陽性，其余均為陰性，鑒定結(jié)果為93%，確定為霍亂弧菌(V.cholerae)，生物編號為0425201150407211。O1群/O139群霍亂弧菌診斷血清凝集試驗，結(jié)果顯示不凝集，可以排除O1群及O139群霍亂弧菌。

MALDI-TOF MS質(zhì)譜鑒定結(jié)果為2.2分，確定為類志賀鄰單胞菌(Plesiomonasshigelloides)。

靶向DNA測序鑒定得到準(zhǔn)確的目的基因系列(1 504 bp)，如圖2所示。將擴增產(chǎn)物測序結(jié)果在GenBank上進行序列比對，與公布的類志賀鄰單胞菌(CP050969.1)同源性達到99.93%。

圖2 16S rDNA基因測序結(jié)果Fig.2 The gene sequencing results of 16S rDNA

3 討論

Vitek 2 Compact全自動細菌鑒定分析系統(tǒng)采用八進位制數(shù)碼鑒定原理，測試卡內(nèi)包含30項生化反應(yīng)，采用動力光電比色法，通過讀數(shù)器每小時對反應(yīng)孔底物讀數(shù)1次，并記錄反應(yīng)變化，可得1組10位數(shù)的數(shù)碼。當(dāng)生長對照孔透光度提示反應(yīng)到達終點時，系統(tǒng)將此刻記錄的數(shù)碼組值與數(shù)據(jù)庫相比較，獲得相似系統(tǒng)鑒定值。該系統(tǒng)的鑒定原理是表型鑒定，其生化鑒定結(jié)果易受到菌株生長狀態(tài)、培養(yǎng)基成分、傳代次數(shù)等多因素的影響。類志賀鄰單胞菌原歸于弧菌科，為革蘭陰性短或直桿菌，后通過16S rRNA分析顯示，鄰單胞菌屬與腸桿菌科具有更高的同源性，因而歸入腸桿菌科。該菌在血瓊脂平板上可形成直徑為1.0～2.0 mm光滑、灰色、凸起、不透明、不溶血、具有完整邊緣的菌落[7]，氧化酶、動力陽性?；魜y弧菌為革蘭陰性直的、微彎曲、彎曲或逗號狀小桿菌，氧化酶、動力陽性，在羊血瓊脂平板上可形成淺灰色、β溶血菌落，4號平板上菌落中心呈灰黑色，在液體培養(yǎng)基中孵育6～8 h后懸滴法觀察可見流星樣運動[8]。本病例檢出的革蘭陰性桿菌在血瓊脂平板上β溶血，堿性蛋白胨水懸滴可見少量細菌魚群樣穿梭運動，4號平板上菌落無色，與經(jīng)典的類志賀鄰單胞菌和霍亂弧菌培養(yǎng)特性均不匹配。由于VITEK 2 Compact的配套卡片GN中不包含生化鑒別霍亂弧菌與類志賀鄰單胞菌的關(guān)鍵試驗精氨酸雙水解酶、發(fā)酵肌醇(見表1)[7]，故VITEK 2 Compact不能準(zhǔn)確鑒定出此例類志賀鄰單胞菌。

表1 鄰單胞菌和弧菌的鑒別Tab.1 Identification of Plesiomonas and Vibrio

MALDI-TOF MS是近年來發(fā)展迅速的一種用于鑒定多肽、蛋白質(zhì)的新型軟電離質(zhì)譜技術(shù)[9]，其基本原理是將分析物分散在基質(zhì)分子中形成晶體并用激光照射，基質(zhì)分子經(jīng)輻射吸收能量并迅速蓄積產(chǎn)熱，基質(zhì)晶體得到升華膨脹進入氣相[10]。產(chǎn)生的質(zhì)譜圖多為單電荷離子，因而質(zhì)譜圖中的離子與多肽和蛋白質(zhì)的質(zhì)量一一對應(yīng)。由于每種微生物都有自身獨特的蛋白質(zhì)組成，將質(zhì)譜儀檢測待測微生物獲得的蛋白質(zhì)指紋圖譜與數(shù)據(jù)庫中已知微生物的標(biāo)準(zhǔn)圖譜進行比對，從而完成對微生物的鑒定。與常規(guī)的細菌生化鑒定方法不同，MALDI-TOF MS主要檢測菌體所含的小分子蛋白或多肽，重復(fù)性好，幾乎不受培養(yǎng)時間、生長條件、培養(yǎng)基等因素的影響。

16S rDNA分子約1.5 kb，大小適中，不同菌屬之間具有一定的差異，測序技術(shù)可得到其序列，具有良好的進化時鐘性質(zhì)[11]，在結(jié)構(gòu)與功能上具有高度的保守性，號稱“細菌化石”。本實驗中利用細菌16S rDNA通用引物擴增菌株目的基因序列進行基因測序，得到準(zhǔn)確的基因序列，經(jīng)過序列比對，與數(shù)據(jù)庫中的類志賀鄰單胞菌16S rDNA序列的同源性均達到99%以上。

臨床上針對疑似霍亂的患者，一般取其排泄物、嘔吐物、剩余食物、肛拭等標(biāo)本直接涂片及培養(yǎng)，國內(nèi)偶見血培養(yǎng)分離出O1群[12]和非O1/非O139群霍亂弧菌的報道[13-15]。本例患者臨床未擬診為霍亂，故而大便標(biāo)本未直接做霍亂弧菌的堿性蛋白胨水培養(yǎng)?；颊哐囵B(yǎng)報陽后VITEK 2 Compact系統(tǒng)鑒定為霍亂弧菌，引起了實驗室工作人員的重視，O1群/O139群診斷血清凝集試驗顯示不凝集，可以排除O1群及O139群霍亂弧菌。因霍亂弧菌在本實驗室第1次檢出，為求結(jié)果的準(zhǔn)確性，進行了質(zhì)譜檢測及基因測序，結(jié)果確認(rèn)為類志賀鄰單胞菌。類志賀鄰單胞菌引起的腹瀉可表現(xiàn)為輕微的腸炎和痢疾，常有腹瀉伴腹痛，少有發(fā)熱、反胃和嘔吐，腸外感染主要為敗血癥，一般見于新生兒、血液病和肝病患者。本報告的患者既往有肝病史，但腹瀉同時有發(fā)熱嘔吐，與不典型霍亂弧菌感染難以區(qū)分，且Vitek 2 Compact鑒定結(jié)果為“非常好的鑒定”，儀器鑒定結(jié)果值高，增加了誤診風(fēng)險。

細菌經(jīng)Vitek-2 Compact系統(tǒng)鑒定為霍亂弧菌等臨床少見菌時，即使鑒定結(jié)果為“非常好的鑒定”，但仍須結(jié)合細菌菌落形態(tài)、輔助生化試驗，并結(jié)合患者的臨床情況進行綜合判斷，必要時可采用MALDI-TOF MS、基因測序等其他檢測手段復(fù)核。