應用培養(yǎng)組學分離鑒定牛源芽孢桿菌及其系統(tǒng)發(fā)育性分析

王浩先，陳宇，馬寧，黃培鑫，張曉軒，倪宏波

（1.黑龍江八一農墾大學動物科技學院，大慶 163319；2.吉林農業(yè)大學動物科學技術學院；3.青島農業(yè)大學）

消化道作為奶牛等動物重要的組織系統(tǒng)，由口腔、咽、食道、胃、小腸、大腸等部組成。其中腸道作為動物最終的營養(yǎng)物質吸收代謝轉化的場所，其內部生存著數(shù)量龐大、種類組成多樣的各類微生物，其主要由細菌、原蟲、真菌等三大類微生物構成，并形成一個相對穩(wěn)定的微態(tài)系統(tǒng)[1-2]。胃腸道微生物的多種多樣性是其主要消化功能實現(xiàn)的現(xiàn)實基礎，其發(fā)揮重要作用主要針對宿主的免疫、生理和營養(yǎng)功能等方面。胃腸道微生物的總量是數(shù)10 倍于其本源動物本身細胞數(shù)，正常的情形下有多種多樣的菌群數(shù)量1010～1011存在于每毫升的瘤胃（液）內容物中。瘤胃中還包含著105～106個的原蟲、少數(shù)噬菌體和厭氧真菌或其產生的游離孢子數(shù)為103～105[3]。草食類反芻動物以奶牛為代表同時與我們生活密不可分，其自身將植物纖維通過瘤胃等胃腸道的營養(yǎng)吸收轉化等作用將其轉化為易于人類吸收的牛奶[4]。研究表明，奶牛胃腸微生物的研究已成為生物學研究的一個重要課題。近年來，依靠16S rRNA/18S rRNA /ITS 測序技術發(fā)現(xiàn)了一些傳統(tǒng)培養(yǎng)法研究未發(fā)現(xiàn)的新種類，促進了對復雜微生態(tài)系統(tǒng)的認識。目前牛瘤胃中已鑒定出410 余種細菌，真菌方面，目前已從牛瘤胃中鑒定出來6 個屬16 個種類；但對奶牛腸道細菌研究較少，尤其是具有潛在功能作用的芽孢桿菌[5]。

就目前社會經濟的高速發(fā)展以及實驗技術不斷的進步，結合高通量測序技術與傳統(tǒng)培養(yǎng)技術手段對養(yǎng)殖經濟動物（如：豬、肉牛、奶牛、山羊、禽等）的消化道內微生物群落構成的多樣性研究、優(yōu)勢菌群的了解、功能菌群的分離和其內功能基因的挖掘等一系列研究已成為一種新的趨勢，并在該方向取得了一定進展[6]。消化道微生物群落生存在宿主的消化道生態(tài)內環(huán)境中，同時幫助宿主實現(xiàn)多種消化道內的生理生化功能，它們與宿主機體相互作用，互利共生，形成了一個緊密聯(lián)系的整體，共同抵御外界不良環(huán)境[7]。腸道菌群不只承擔著對食物消化吸收的作用，還在很多方面影響動物機體的健康。大量的研究數(shù)據(jù)積累表明，腸道菌群對動物機體的免疫有著重要的調控作用。在近期的一項研究中，Steed 等[8-9]又有了一項驚人發(fā)現(xiàn)，即腸道微生物能夠將食物中的黃酮類化合物代謝成脫氨基酪氨酸（DAT），借此來加強I 型干擾素（IFN）信號并減輕肺部病變，除此之外DAT 能夠引發(fā)I 型IFN 的信號通路，刺激一系列下游基因表達，以此來加強和調節(jié)免疫細胞的功能，防治流感。另外，腸道微生物在中樞神經和腦功能以及營養(yǎng)和代謝中都起著重要的調控作用。

隨著對消化道微生物群落研究角度的加深，對犢牛和后備牛消化道微生物區(qū)系的研究至關重要，這不但會對犢牛的監(jiān)管與營養(yǎng)配比提供數(shù)據(jù)支持，也會為后備牛的快速成長提供合理的幫助。為此，分子生物學技術的快速發(fā)展和合理應用可為其提供技術上的支持與保障[10]。傳統(tǒng)的消化道生態(tài)系統(tǒng)中微生物群落多樣性及結構分析主要通過分離培養(yǎng)、計數(shù)和分類鑒定，然后通過一般的生物化學性狀或者特定的表現(xiàn)型來分析。微生物的分離培養(yǎng)可以充實胃腸道微生物菌種資源，用于研究微生物生理功能與代謝，尤其參與日糧營養(yǎng)物質降解代謝。相關菌種（如：乳酸桿菌、芽孢桿菌等）可能應用于奶牛等傳統(tǒng)飼養(yǎng)動物的微生態(tài)制劑領域研究開發(fā)；奶牛機體疾病的防控調節(jié)和胃腸道疾病的生物防控領域以及奶牛的免疫機制調節(jié)方向。并為畜牧業(yè)的發(fā)展帶來一片新的藍海，具有廣闊的應用前景[11]。

實驗基于培養(yǎng)組學手段，使用選擇培養(yǎng)篩菌、純化、特異性引物PCR 檢測、生物信息同源性比對等實驗手段對奶牛腸道芽孢桿菌屬菌種進行分離與鑒定，最終成功分離鑒定出：蠟樣芽孢桿菌、沙福芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、短小芽孢桿菌、海洋沉積物芽孢桿菌和高山芽孢桿菌在內的共計6 種14 株芽孢桿菌屬菌株，為日后對奶牛胃腸道功能菌的鑒別分析及日后的研究提供實驗基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品采集

樣品采集于2020 年7 月中旬，采集地點黑龍江省綏化市青岡縣某規(guī)?；膛ｐB(yǎng)殖場。實驗選取了6 只健康荷斯坦奶牛（平均產奶量在56.5 kg·d-1左右），該場均采用相同的規(guī)?；曫B(yǎng)管理，采用全混合日糧飼喂，定點飼喂（每日的6 時和17 時進行等量飼喂），飼料剩余比例5%左右，栓式飼喂，自由飲水。

1.1.2 部分儀器

表1 部分儀器設備Table 1 Part of the equipment

1.1.3 主要試劑及引物序列

選擇性培養(yǎng)基（青島海博生物公司），血液細菌培養(yǎng)瓶（山東鑫科生物科技有限公司），無菌脫纖維綿羊血，刃天青鈉，牛黃膽鹽，無機鹽，碳源、氮源，VK1，氯化血紅，50×TAE，EB 顯色液，革蘭氏染色液等均購自于（北京索萊寶生物有限公司）；RR902AEx Taq Master Mix，Marker 等均購自于（Takara 寶日生物公司）。

引物合成由上海生工生物公司完成，引物序列如下：

上游引物1510 R：5'-ACTGGATCCCACTTGGATTGCAAACCTGAATTCTCG-3'；下游引物7 F：5'-ATCGAAGCTTCCCTAAGGCCTTCTGTTCTGATAGAC-3'。

1.2 方法

1.2.1 樣品的采集

采集過程中首先將雙手帶好無菌直腸檢測手套，伸入6 只健康荷斯坦奶牛直腸采集新鮮糞便，將采集糞便灌注于無菌采樣袋，并立即封閉采樣袋，裝入無菌厭氧袋中，編號整理，整個樣品采集過程均為無菌操作。樣品于低溫采樣箱運輸回實驗室進行樣品稀釋等預處理操作并進行細菌的分離培養(yǎng)。

1.2.2 樣品的處理及培養(yǎng)基的配置

準備工作：實驗開始前，將所有需要的器材進行高壓滅菌操作，實驗室進行紫外照射殺菌，試驗儀器（生物安全柜、厭氧工作站等）在用擦拭干凈后，開啟紫外燈照射。因芽孢桿菌產生芽孢，為避免交傳染，故需要單獨場地。同時提前配置好所需培養(yǎng)基，添加0.1%牛黃膽鹽，滅菌后，50 ℃，青島培養(yǎng)基平板，待室溫凝固后，倒放至37 ℃電熱恒溫箱，質控，防止環(huán)境中雜菌污染，影響后續(xù)實驗操作。（注：營養(yǎng)液為經過無菌0.22 μm 的針頭濾器過濾的無菌瘤胃液，待到傾倒平板時緩慢滴入，滴入量為5%）。

（1）提前72 h 將所需的無菌瘤胃液過濾完成，與采集的脫纖維綿羊血一并進行前期質控，防止污染，影響后期實驗。如出現(xiàn)污染情況，應立即更換原試劑，并及時消毒殺菌。重新采集脫纖維綿羊血，重新過濾得到無菌瘤胃液，并再次進行平板劃線檢驗，并對所處環(huán)境，所使用設備及時消毒滅菌清理，防止污染。

（2）實驗所需培養(yǎng)基共六種（分別為：AB+E、CB+E、CBB+E、LBB+E、YC+E、BS+E 培養(yǎng)基），+E 為0.1%的牛黃膽鹽，瓊脂粉添加量為1.5%。

（3）樣品洗脫用品：酒精棉，鑷子，玻璃棒，70%酒精，一次性培養(yǎng)皿，2.0 mL 離心管，三種量程的移液槍及槍頭，高壓滅菌后的500 mL 生理鹽水，玻璃涂板器，剪刀，50 mL 離心管及管架。（以上物品務必消毒后使用）。

（4）用鑷子夾取部分樣品分到兩個滅菌后的培養(yǎng)皿中，（同時需要將原始的糞便樣品標號后分裝入凍存管進行-80 ℃保存。）一個加入70%酒精進行洗脫，標上E（加入酒精是為了殺死細菌菌體，留下芽孢），另一個加入?yún)捬跻后w培養(yǎng)基標（AB）。都進行攪拌混勻。E 放置4 h 后進行處理。

1.2.3 菌種/基因型的鑒定

對應試管在3 個1.5 mL EP 管標號，（兩個寫在側面。1 個寫在蓋上，以防后期煮沸時字體脫落）。搖晃試管，使菌體與培養(yǎng)液混勻。（以下環(huán)節(jié)務必注意滅菌操作）PCR 檢測及測序：吸取菌液500 μL（盡量吸取菌絲）注入到一個EP 管中（標號在蓋上的），12 000 r，10 min，棄上清，加入1 mL 無菌水，用封口膜封上（以防煮沸時蓋子打開）。電磁爐100 ℃水域煮6 min。取0.3～0.5 μL 進行PCR。

（1）PCR 溫度設置：98 ℃，5 min。98 ℃，30 s；53 ℃，30 s；72 ℃，1 min 40 s；35 個擴增循環(huán)。72 ℃，10 min。4 ℃保存。PCR 反應前，先將PCR 管內溶液混勻，在瞬離機上瞬離，然后置于PCR 儀上，按16S rRNA 基因擴增PCR 反應程序（表2）進行反應。

表2 16S rRNA 基因擴增PCR 反應程序Table 2 16S rRNA gene amplification PCR reaction procedure

（2）PCR 擴增體系為50 μL，體系樣品組成如下：Ex Taq Max25 μL，模板0.5 μL，上游引物1 μL，下游引物1 μL，水22.5 μL，陰性對照中，將模板替換為無菌水。（每次務必有陰性對照）

（3）對PCR 產物進行1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。1/4/板，11 孔，0.2 g 瓊脂糖+20 mL 1×TAE，加熱溶解后室溫放置至60 ℃左右，加入1 μL EB，混勻后對光檢查液體內EB 是否全部溶解，倒入模具。待瓊脂糖凝膠凝固成型后膠孔加注樣品；1/2 板，25 孔，0.4 g瓊脂糖+40 mL 1×TAE，加入2 μL EB，待瓊脂糖凝膠凝固成型后膠孔加注樣品。

（4）將第一次為顯示為陰性的樣本重復第一遍操作進行PCR 擴增體系混樣處理，此時樣品的模板量增加到3 μL。

（5）對電泳檢測條帶正確的PCR 產物送測序。

1.2.4 菌種的形態(tài)學鑒定

應用革蘭氏染色技術，挑取純化后的細菌菌液于在載玻片上，涂勻，火焰固定，參照說明書滴加革蘭氏染色試劑，待染色完畢后風干，滴加香柏油，調節(jié)光學顯微鏡相應合適視野，觀察菌體及芽孢形態(tài)，通過對細菌的形態(tài)學觀察，初步判斷其是否為芽孢桿菌，是否有雜菌污染。

1.2.5 菌種的保存

（1）對比16S rRNA 序列完全測通序列與NCBI上利用BLAST 軟件與Gen Bank 中公布已知序列對比結果挑選需要保存的純化菌株，進凍干保存。

（2）凍干保護劑制備：脫脂奶粉20%+蔗糖10%+甘油1.5%+超純水68%攪拌混勻無結塊狀，置于高壓蒸汽滅菌鍋中115 ℃，15 min，滅菌備用。

（3）菌液與凍干保護劑1∶1 混合，攪拌均勻，無結塊。

（4）-20 ℃～-80 ℃預凍12 h，置于凍干機中進行復凍，完成菌種保存。

2 結果與分析

2.1 培養(yǎng)結果及染色鏡檢

將6 個樣品進行70%酒精預處理4 h，將處理后的樣品稀釋涂板，接種培養(yǎng)基平板均加入0.1% 膽鹽，37 ℃培養(yǎng)24～36 h。經篩選后采用劃線法純化培養(yǎng)，共得到膽鹽耐受菌株14 株，以供后續(xù)實驗操作。如圖1 所示，菌落上面出現(xiàn)菌膜，逐漸凹陷形成圓形小環(huán)，邊緣不整齊。如圖2 所示，在細菌不同生長時期染色結果，產生的芽孢形態(tài)為短小，兩端圓潤，在菌體中間或游離于菌體外，普通染色劑無法染色（2-A，部分分離純化芽孢桿菌產芽孢狀態(tài)；2-B，部分分離純化芽孢桿菌菌體狀態(tài)）。

圖1 部分芽孢桿菌培養(yǎng)照片F(xiàn)ig.1 Part of the photos of Bacillus culture

圖2 部分芽孢桿菌革蘭氏染色鏡檢影像Fig.2 Partial Gram stained microscopic images of Bacillus

2.2 PCR 鑒定結果

通過提取細菌DNA 為PCR 模板，陰性對照模板為無菌水，應用16S 通用引物1510R 和7F 進行PCR擴增得到目的片段約為1 700 bp，陰性對照無擴增目的條帶，其部分結果如圖3。

圖3 部分細菌擴增16S rRNA 結果Fig.3 Amplification of 16S rRNA by Bacteria

2.3 菌株同源性分析

將分離菌株經過1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測后得到檢測樣品的目的片段為1 700 bp 的條帶，符合16S rRNA 條帶長度，送往通用生物系統(tǒng)（安徽）有限公司進行菌株測序鑒定。使用BLAST 軟件將測序結果序列與NCBI 上Gen Bank 中公布的株芽孢桿菌參考株基因序列進行同源性對比分析，同源性為99.93%～100%。同時，為了更深入的了解并解釋14株菌株（L1-L14）的親源關系，基于MEGA-X 軟件采用最大似然法原理進行系統(tǒng)發(fā)育樹分析，在Gen Bank 中選取了蠟樣芽胞桿菌（Bacillus cereus）、海洋沉積物芽孢桿菌（Bacillus oceanisediminis）、地衣芽孢桿菌（Bacillus licheniformis）、高山芽孢桿菌?（Bacillus?altitudinis）、同溫層芽孢桿菌（Bacillus stratosphericus）、沙福芽孢桿菌（Bacillus safensis）以及短小芽孢桿菌（Bacillus pumilus）的基因序列進行比對，并建立系統(tǒng)進化樹（圖4），并對分離菌株與參考菌株序列繪制了同源性表格圖與同源性熱圖，更直觀的展示分離的14 株菌株（L1～L14）的親源關系（圖5，同源性表格圖；圖6，同源性熱圖）。最終確認L1、L2 為蠟樣芽胞桿菌；L3、L4 為沙福芽孢桿菌；L6，L7 為短小芽孢桿菌；L5 為海洋沉積物芽孢桿菌；L8、L9、L10、L11、L12 為地衣芽孢桿菌；L13 為高山芽孢桿菌；L14 為同溫層芽孢桿菌，且14 株分離菌株與參考菌株序列同源性均為99.9%～100%，因此可以確定實驗中分離菌株結果成立。

圖4 分離的菌種H1-H14 進化樹同源性比對Fig.4 Homology comparison of evolutionary trees of isolated strains L1-L14

圖5 采用BLAST 軟件與Gen Bank 中公布的參考菌株進行同源性對比分析結果Fig.5 Homology comparison between BLAST software and reference strains published in Gen Bank

圖6 參考菌株與分離菌株同源性熱圖Fig.6 Homology heat map of reference strain and isolated strain

3 討論

作為益生菌/功能菌代表菌屬之一的芽孢桿菌，無論是畜牧行業(yè)或是醫(yī)療或食品行業(yè)都離不開他的身影。作為活菌制劑的代表之一，其無論是對動物或植物，效果都非常有效。一方面因其自身還生理功能的耐高溫、耐高壓、耐膽鹽、產芽孢等特殊的生理特性，使其能在作為耐受菌進入宿主消化道內不被分解的同時可以繼續(xù)繁衍定植，并分解生產營養(yǎng)物質，促進宿主代謝水平，產生有機酸，降低調節(jié)消化道PH 水平的同時也能消除抑制有害菌生長，即使進入極端環(huán)境，仍能以芽孢形態(tài)存活[12]；同時，它也因其自身性質幫助宿主提高自身機體免疫力，促進宿主腸道消化，使宿主能耗的吸收消化以蛋白質為代表的營養(yǎng)物質。此外，芽孢桿菌還能產生多種維生素，為動物提供豐富的營養(yǎng)物質。因此，芽孢桿菌添加到飼料中有助于動物的生長，也可以保證動物產生疾病的幾率極大減少。另外，芽孢桿菌分泌出的抗菌物質可以使動物體內的一些臟器長期穩(wěn)定的處于高海拔應激狀態(tài)，進而提高自身代謝水平增加宿主自身的免疫力。因此研究芽孢桿菌在動物營養(yǎng)與飼料中的應用前景十分廣闊[13]。

目前，奶牛等反芻動物瘤胃微生物多樣性研究主要利用宏基因組學新一代高通量測序技術（NGS）以特定環(huán)境下微生物群體基因組為研究對象，在分析微生物多樣性、種群結構、進化關系的基礎上，可進一步探究微生物群體功能特性、相互協(xié)作關系及與環(huán)境之間的關系，發(fā)掘潛在的生物學意義[14]。但是傳統(tǒng)純培養(yǎng)的方式也可進行胃腸道微生物中可培養(yǎng)的菌群物種，通過分析純菌株的生理生化特征，進行后續(xù)研究論證；隨著傳統(tǒng)純培養(yǎng)的方式發(fā)展，并利用培養(yǎng)技術分離純化菌株，為未來相關奶牛領域研究提供基礎。對于未來對奶牛疾病研究，奶牛免疫機制研究和奶牛微生態(tài)方向研究等相關領域開發(fā)都有重要的基礎理論支持和數(shù)據(jù)支撐，對于養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展意義重大[15]。

對于養(yǎng)殖動物而言，對其的消化道微生物的分離和培養(yǎng)具有重要意義，尤其是在對其腸道功能菌群的分離鑒定及其生物特性檢測上，這可以為日后加強對其腸道健康的研究及對其合理飼喂以及開發(fā)適應的微生態(tài)制劑產品做出巨大貢獻。因為它為深入的生理學研究提供了參考菌株，拓寬了在微生物基礎研究領域的視野，并為生產具有商業(yè)價值的代謝物提供了新的生物體[16-17]。此后的實驗中應及時總結調整，對前人所做實驗及實驗應取其精華去其糟粕，應結合16S rRNA 基因測序方法，調整培養(yǎng)基配方及實驗室條件，以此來達到增加可培養(yǎng)細菌數(shù)目的。并且應將生物信息技術與菌株培養(yǎng)合理的結合互補，使實驗高效準確的進行。SSU rRNA 基因（也稱為16S rRNA 基因）廣泛用于微生物生態(tài)學研究中作為“條形碼基因”來量化微生物群落結構和多樣性。它作為微生物條形碼基因的廣泛采用受到基因的幾個理想特性的驅動，包括它在細菌和古細菌中具有通用性的事實，它可以通過聚合酶一次性從多種分類群中輕易擴增。連鎖反應（PCR），它具有系統(tǒng)發(fā)育信息，可用于基于16S rRNA 序列的廣泛數(shù)據(jù)庫鑒定和種系型序列及相關的分類學和系統(tǒng)發(fā)育信息[18-19]。

動物腸道微生物組的研究目前以菌株為單位的培養(yǎng)性研究是基礎，同時其證明了在菌株層次水平的研究是一種必需方法對于動物微生物組方面，同時其也是一種必需方法從單純細菌擴繁純培養(yǎng)過渡到其他微生物的擴繁，是作為基礎應用于生物信息分析優(yōu)化[20]。菌株的分離純培養(yǎng)也是微生物組轉化的物質基礎，更為研究奶牛的功能菌群、活菌藥物庫、診斷標準物質以及指導新微生態(tài)制劑或合成制劑的開發(fā)提供了基礎數(shù)據(jù)。安全和效果是兩個最重要的方面對于研發(fā)活菌藥物，而培養(yǎng)及鑒定都與之密不可分[21-22]。

因為細菌種類繁多，由于其菌體內的代謝差異，對營養(yǎng)物質利用吸收及合成產物的不同方式，造成了用于鑒定細菌的種類可以應用不同的理化性質的生化試驗。其中鑒定的最重要的一種，是檢測菌的分解其吸收的營養(yǎng)物質方式的不同樣及其代謝所產生的產物的不同而對細菌進行鑒定，包括蛋白質分解試驗、氧化酶試驗、糖分解產物試驗等[23]?？梢酝ㄟ^不同的生化鑒定方式組合去初步驗證分離純化的菌株是否所需，并結合分子生物學技術、16S rRNA 基因測序方法等方法更準確鑒定出需要的菌株，大大提高了試驗準確性，排除分子生物學技術、16S rRNA 擴增子測序等方法的一些誤差。

芽孢桿菌可產生某些重要的活性物質，其可抑制作用于對致病菌或條件致病菌導致的內源性感染；在促進厭氧益生菌的生長發(fā)育時芽孢桿菌也有促進作用，同時導致致病菌間接生長抑制；其也可以促進機體的免疫功能能力，使群體免疫力上升。對于代謝功能差異性大的放線菌來說，生物活性物質是其主要的表現(xiàn)之一，同時也是其作為微生物資源原因之一[24]。

通過這些研究說明功能菌在動物體內發(fā)揮著毋庸置疑的作用，然而，功能菌在疾病治療中仍然存在一些問題需要解決，例如，是否可以在體內長期存在、是否占有固定的生態(tài)位、是否可以通過分離培養(yǎng)及鑒定的技術方法人為地將特定動物體內原有生態(tài)位上的功能菌進行大量繁殖，通過轉化提高動物產品，以此用作動物的日常保健及疾病的治療，這可能會成為未來科學化養(yǎng)殖的一個焦點[25-26]。

4 結論

在實驗中分離所得14 株芽孢桿菌菌株，經過16S rRNA 測序、生物信息技術分析檢測，結果顯示分離所得14 株芽孢桿菌菌株共為6 種：2 株沙福芽孢桿菌，5 株地衣芽孢桿菌，2 株短小芽孢桿菌，1 株海洋沉積物芽孢桿菌，2 株高山芽孢桿菌；與Gen Bank中公布的株芽孢桿菌參考株進行同源性對比分析，同源性為99.93%～100%。系統(tǒng)發(fā)育樹分析發(fā)現(xiàn)，分離菌株L1～L14 與8 株參考株親緣關系較近，同源性均為99.9%。其中地衣芽孢桿菌和短小芽孢桿菌芽孢桿菌均屬于可添加飼喂益生菌。這些分離得到的菌株會在后續(xù)開展的菌制劑等方面的研究中進行應用驗證。