米曲霉產(chǎn)米黑根毛霉脂肪酶高通量篩選方法的建立

熊志岳， 許 逗， 郭元昕， 田錫煒， 儲 炬

（華東理工大學(xué)生物反應(yīng)器工程國家重點實驗室，上海 200237）

米黑根毛霉脂肪酶（RML）是一種α/β型脂肪酶，具有Ser-Asp-His 催化三聯(lián)體結(jié)構(gòu)[1]，不僅可以催化酯類底物水解，還能催化酯合成、酯交換等反應(yīng)，如合成“結(jié)構(gòu)脂”[2]、丁酸丁酯[3]等。RML 在化妝品、洗滌劑、污染治理、生物柴油、表面活性劑等行業(yè)有著廣泛應(yīng)用[4-7]。由于天然米黑根毛霉的RML 分泌量很低，難以滿足工業(yè)應(yīng)用需求，而且RML 的外源表達系統(tǒng)多采用巴斯德畢赤酵母（Pichia pastoris），因而無法應(yīng)用于食品工業(yè)。米曲霉（Aspergilus oryzae，簡稱A. oryzae）因其強大的蛋白分泌和翻譯后修飾能力，被廣泛用于外源蛋白的表達[8]，并且米曲霉是美國食品藥品監(jiān)督管理局（FDA）認證的GRAS 安全菌株，利用米曲霉表達RML 具有巨大的應(yīng)用潛力。

高產(chǎn)菌株是實現(xiàn)高效生產(chǎn)的基礎(chǔ)。高通量篩選技術(shù)已經(jīng)廣泛用于工業(yè)高性能菌株的選育過程中，能夠大大提高菌株的篩選效率[9-10]。高通量培養(yǎng)方法以及產(chǎn)物高通量檢測方法是菌種高通量篩選模型中最為關(guān)鍵的兩個部分。微孔板（MTP）因其較小的裝液量和高平行通量，成為菌種高通量培養(yǎng)的優(yōu)良平臺[11]。微孔板形狀可分為圓底和方底，并且有96 孔、48 孔和24 孔等規(guī)格，可以根據(jù)培養(yǎng)菌種的代謝特性，比如氧氣需求、菌體形態(tài)、耐剪切水平等進行相應(yīng)的選擇。

對于米曲霉的培養(yǎng)來說，由于米曲霉高耗氧的代謝特點，一般選擇24-MTPs 作為高通量的培養(yǎng)裝置。另一方面，高通量的檢測方法常通過顏色反應(yīng)、熒光檢測等來實現(xiàn)。常用的脂肪酶活力定量測定方法主要有堿滴定法、皂銅法以及對硝基苯酚法。其中堿滴定法需要使用高壓勻漿機對底物三酰甘油乳化后才能進行滴定，整個過程操作要求高、時間長，因此難以應(yīng)用于脂肪酶的高通量測定[12～13]。皂銅法雖然是通過顯色反應(yīng)來進行脂肪酶酶活的測定，但是在操作過程中會把大量有機溶劑苯用于萃取劑[14]，效率不高并且存在安全隱患，因此不適用于高通量快速檢測[15]。對硝基苯酚法也是通過顯色反應(yīng)來實現(xiàn)脂肪酶酶活的檢測，而且測定環(huán)節(jié)相對簡單、快速、靈敏，是應(yīng)用較多的一種方法。此外，Wang 等[16]提出一種雙指示劑法，以橄欖油為底物，經(jīng)脂肪酶水解后生成游離的脂肪酸，脂肪酸與CaCl2反應(yīng)生成鈣鹽沉淀（皂化反應(yīng)）和鹽酸，然后通過溴麝香草酚藍和苯酚紅兩種pH 指示劑進行顯色，并在630 nm 處有最大的吸收峰。此方法原理簡單、可操作性強，能夠較好地應(yīng)用于高通量測定。

本文通過優(yōu)化基于雙指示劑法的RML 高通量檢測方法，并且開發(fā)24-MTPs 米曲霉高通量培養(yǎng)方法，建立基于孔板培養(yǎng)的米曲霉產(chǎn)RML 高通量篩選模型。最后，采用常壓常溫等離子體誘變技術(shù)（ARTP）對現(xiàn)有生產(chǎn)RML 的米曲霉菌株進行誘變，經(jīng)過高通量篩選后獲得高產(chǎn)菌株。

1 材料和方法

1.1 菌株和試劑

1.1.1 菌株 米曲霉，由國家生化工程技術(shù)研究中心（上海）保藏。

1.1.2 試劑的配制 5 mmol/L Tris-HCl 緩沖液（pH=8.5）：稱取0.605 g Tris 溶于1 L 純凈水中，用3 mol/L濃鹽酸調(diào)節(jié)pH 至8.5；雙指示劑溶液：分別稱取0.025 g溴麝香草酚藍和酚紅溶解于50 mL、5 mmol/L、pH8.5的Tris-HCl 緩沖液；100 mmol/L 氯化鈣溶液：稱取1.11 g氯化鈣溶解于100 mL、5 mmol/L、pH8.5 的Tris-HCl緩沖液；底物：將橄欖油與二甲基甲酰胺按照體積比為1∶6 配制（現(xiàn)配現(xiàn)用）。

1.1.3 培養(yǎng)基 孔板初篩培養(yǎng)基與搖瓶復(fù)篩培養(yǎng)基（g/L）：玉米糊精20，玉米漿干粉10，酵母粉10，泡敵粉1， KH2PO41.244， MgSO4·7H2O 0.249， Na2HPO4·12H2O 6?？装骞虘B(tài)斜面培養(yǎng)基（PDA 培養(yǎng)基，g/L）：馬鈴薯200，葡萄糖20，瓊脂15。搖瓶驗證培養(yǎng)基（g/L）：玉米糊精50，大豆蛋白胨30，酵母粉4，泡 敵 粉1，KH2PO41.12，MgSO4·7H2O 0.227，Na2HPO4·12H2O 5.33。

1.1.4 主要儀器與器材 恒溫培養(yǎng)振蕩器（上海智城分析儀器有限公司，ZWY-2102C 型）、酶標(biāo)儀（Thermo 公司，MultiSKAN MK3 型）、常壓常溫等離子體誘變儀（北京思清源生物技術(shù)公司，ARTP-II S 型）、24-MTPs（上海甘薇生物科技有限公司，P2410 型）。

1.2 實驗方法

1.2.1 米曲霉孢子懸浮液制備 取活化好的成熟單菌落平板（培養(yǎng)約7 d），用孢子鏟刮下菌絲，每個平板用10 mL 無菌水洗下孢子，用玻璃珠打散后過濾得到孢子懸浮液，用血球計數(shù)板計數(shù)。

1.2.2 ARTP 誘變時間的確定 采用氦氣為工作氣體，功率為120 W，氣流量為10 L/min，將孢子懸液稀釋至合適濃度后（保證0 s 時培養(yǎng)皿生長約50 個菌落），選擇不同的處理時間（0，30，60，70，80，85，90，95，100，110 s）對孢子進行ARTP 誘變，每個時間梯度分別取100 μL 涂布于固體平板，培養(yǎng)到肉眼可見的菌落后計數(shù)并計算致死率（RLethality）。致死率計算公式如下：

其中：n0表示初始菌落數(shù)；nt表示誘變ts 時的菌落數(shù)。

1.2.3 高通量孔板初篩方法的建立 采用24-MTPs對米曲霉進行初篩，并對培養(yǎng)條件進行如下優(yōu)化：通過添加1、2、3 顆直徑5 mm 玻璃珠來形成不同的剪切環(huán)境；發(fā)酵初始pH分別為3、4、5、6，裝液量（mL）分別為1.2、1.4、1.6、1.8、2.0，培養(yǎng)基質(zhì)量分數(shù)分別為30%、50%、70%。

確定米曲霉生長條件后，經(jīng)由ARTP 誘變，將誘變完的孢子懸液直接接入滅菌的24-MTPs，每孔20 μL，（保證每孔含有約30～40 個孢子），裝液量為2.0 mL，并在28 ℃，150 r/min 條件下培養(yǎng)4 d。

1.2.4 RML 酶活的高通量檢測 初篩培養(yǎng)4 d 后，孔板中每孔吸取50 μL 的上清液，稀釋適當(dāng)?shù)谋稊?shù)，剩余樣品放入4 ℃冰箱中保存?zhèn)溆?。?0 μL 雙指示劑，80 μL CaCl2溶液加入96 孔酶標(biāo)板后，再加入現(xiàn)場配好的橄欖油底物。放入孔板振蕩培養(yǎng)箱中37 ℃預(yù)熱5 min，再迅速加入稀釋好的酶液20 μL，反應(yīng)15 min，迅速放入酶標(biāo)儀中，在630 nm 處測量吸光度。標(biāo)準(zhǔn)曲線測量方法與之相同。利用不同稀釋濃度的RML繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，并計算得出樣品的相對酶活。

1.2.5 孔板固態(tài)培養(yǎng) 孔板固態(tài)斜面培養(yǎng)基制作方法：將配制好的液態(tài)PDA 培養(yǎng)基（含1.8%（g/mL）瓊脂）加入24 孔孔板中，每孔2 mL,包好后放入滅菌鍋滅菌，滅菌結(jié)束后立即取出，傾斜放置，冷卻后即為固態(tài)斜面。將初篩中高于對照菌株20%以上的菌株從孔中取出約50 μL，涂布于PDA 培養(yǎng)基上，28 ℃培養(yǎng)24 h，挑選長勢良好的單菌落6 株，點種于24-MTPs固態(tài)培養(yǎng)基上，繼續(xù)培養(yǎng)3～4 d 長出孢子后，用孢子鏟刮下菌絲放入3 mL 體積分數(shù)為20%的甘油中保存。

1.2.6 搖瓶復(fù)篩培養(yǎng) 將初篩得到的高產(chǎn)誘變菌株的孢子進行搖瓶培養(yǎng)。采用250 mL 搖瓶，裝液量50 mL，接種孢子懸液400 μL，放入搖床于28 ℃、150 r/min條件下培養(yǎng)4 d，發(fā)酵液過濾后稀釋，然后用堿性磷酸酶檢測試劑（p-NPP）法測量酶活。

1.2.7 搖瓶驗證培養(yǎng) 將復(fù)篩得到的誘變菌株活化制備孢子懸液，然后將300 μL 孢子懸液接入搖瓶復(fù)篩培養(yǎng)基中，于28 ℃、150 r/min 條件下培養(yǎng)約28 h，采用250 mL搖瓶，裝液量50 mL；然后以10%的接種量接入搖瓶驗證培養(yǎng)基中于28 ℃、200 r/min 條件下培養(yǎng)5 d，過濾取上清，稀釋適當(dāng)?shù)谋稊?shù)，利用p-NPP法測量酶活。

2 結(jié)果與討論

2.1 RML 高通量檢測方法建立

雙指示劑法是利用氯化鈣將三酰甘油水解產(chǎn)生的脂肪酸轉(zhuǎn)化為易于釋放的鹽酸，經(jīng)由pH 指示劑顯色后，使用酶標(biāo)儀在630 nm 處檢測吸光度。但是在實際應(yīng)用中受到不同發(fā)酵體系、檢測環(huán)境、數(shù)據(jù)處理方法等影響，因此需要對操作條件進行優(yōu)化。

相同樣品多次測量時會有不同的吸光度，這可能是由于HCl-Tris 緩沖液的溫度效應(yīng)引起的，4 ℃時緩沖液的pH 為8.4，而37 ℃時pH 為7.4，從而造成測量的誤差，因此檢測過程中應(yīng)該嚴格控制溫度。此外，在反應(yīng)體系配制完全，放入振蕩儀中37 ℃預(yù)熱時發(fā)現(xiàn)，在不添加脂肪酶的條件下，預(yù)熱時間對樣品吸光度也有很大的影響（圖1）。

圖1 孔板中不同孔的吸光度隨預(yù)熱時間的變化Fig. 1 Variation of absorbance of different wells in the plate with preheating time

由圖1 可以看出，在未添加脂肪酶的情況下，隨著預(yù)熱時間的增加，酶標(biāo)板中孔1、2、3 的吸光度均有所降低。因此在反應(yīng)過程中，必須對反應(yīng)體系預(yù)熱后再加入RML 進行反應(yīng)，并且反應(yīng)時間需嚴格把控。

脂肪酶反應(yīng)中最核心的問題是底物為油脂，不溶于水，需要將油脂底物用乳化劑乳化形成均一、分散的體系后才能進行反應(yīng)。雙指示劑法采用二甲基甲酰胺乳化劑，在橄欖油與二甲基甲酰胺混合后，用旋渦振蕩儀將其混勻。但是靜置20～30 min 后混合液會逐漸分層，因此反應(yīng)必須在振蕩條件下進行，預(yù)熱和反應(yīng)時間需要控制在20 min 以內(nèi)?？紤]到顯色范圍和底物穩(wěn)定性，后續(xù)實驗中將預(yù)熱時間和反應(yīng)時間分別設(shè)置為5 min 和15 min。

此外，在加入雙指示劑、氯化鈣溶液和底物之后，初始顏色并不一致。圖2 示出了孔板中不同孔初始吸光度的差異。如圖2 所示，不同孔之間的初始吸光度有所差別，最高差值可達到0.2。究其原因是因為橄欖油底物與二甲基甲酰胺懸濁液不太穩(wěn)定，加入反應(yīng)體系之后導(dǎo)致pH 不一致，使得顏色出現(xiàn)差異，進而使得反應(yīng)后測得的標(biāo)準(zhǔn)曲線精度不高，R2只能達到0.979 7（圖3(a)），因此需要消除不同孔間吸光度差異的影響。

在加入雙指示劑、氯化鈣溶液、底物并且預(yù)熱5 min 之后，迅速將酶標(biāo)板放入預(yù)熱好的酶標(biāo)儀中并讀數(shù)，得到初始吸光度，然后用8 孔道移液槍迅速添加20 μL 稀釋好的RML 樣品，反應(yīng)15 min 后再次迅速測量每孔吸光度，利用兩次吸光度的差值進行計算，消除空白差異，這樣得到的標(biāo)準(zhǔn)曲線不僅斜率為正，而且R2能提高到0.990 3，從而顯著提高方法的準(zhǔn)確性（圖3(b)）。

圖2 孔板中不同孔初始吸光度的差異Fig. 2 Difference of initial absorbance of different wells in the plate

為了保證測定的穩(wěn)定性與操作的簡便性，搖瓶實驗中所有的酶活均采用p-NPP 法進行測定，而24-MTPs 中采用雙指示劑法檢測RML 的酶活，故需比較這兩種方法的一致性。表1 所示為4 株突變株與原始菌株在24-MTPs 中培養(yǎng)4 d 后，分別用p-NPP 法和雙指示劑法測定的酶活值，表明突變菌株酶活均比原始菌株酶活高，而且酶活的高低趨勢基本一致，計算得Pearson 相關(guān)系數(shù)達到0.919 5，表明在高通量篩選中，優(yōu)化的雙指示劑法可以作為初篩的酶活檢測方法。

2.2 米曲霉24-MTPs 高通量初篩培養(yǎng)方法的建立

米曲霉因其高耗氧的代謝特性，因此采用方孔孔板能提供更高的氧傳遞效率。米曲霉菌絲生長特別旺盛，在利用24 孔方孔板、裝液量2 mL 進行培養(yǎng)時，孔板中會形成致密的菌絲體，而且發(fā)酵液體積減少嚴重（圖4），這樣的生長狀態(tài)不宜進行篩選。因此，考慮從控制生長和增大剪切兩個方面對其進行優(yōu)化。一方面，適當(dāng)?shù)亟档团囵B(yǎng)基濃度和初始pH 可以有效控制菌絲生長；另一方面，培養(yǎng)基裝液量會引起供氧水平的差異，從而影響產(chǎn)物合成。玻璃珠的添加可以增大剪切力，同時也能提高供氧水平。

由圖4 可以看到，當(dāng)pH 為5 時，米曲霉在孔板里會形成一個巨大的“菌球”，雖然生長狀態(tài)較優(yōu)化前有所改善，但是菌球內(nèi)部仍很難攝取到養(yǎng)分與氧氣。而當(dāng)裝液量為1.6 mL 和培養(yǎng)基濃度調(diào)整為初始濃度的一半時，可以看到生長情況改善明顯，但形成的“菌球”仍然較大。進一步添加玻璃珠從而增大剪切力，可以看到2 顆玻璃珠能顯著改善米曲霉的生長狀態(tài)，此時會形成均勻而細小的菌球，菌絲膜也明顯減少，這與搖瓶培養(yǎng)的米曲霉生長狀態(tài)類似，能夠很好地保證氧氣與營養(yǎng)的傳遞。因此，在后續(xù)的實驗中，裝液量和初始pH 仍選擇優(yōu)化前的2 mL 和6，并通過加入2 顆玻璃珠來進行米曲霉的高通量初篩培養(yǎng)。

在ARTP 誘變完成后，采用混合體培養(yǎng)[17]的方法來進行初篩。為了避免米曲霉菌絲生長不均勻?qū)е碌牟町?，采用一步法發(fā)酵，不僅操作簡化并且降低了染菌風(fēng)險。接種時保持每孔接種30～40 個孢子，從而避免了孢子數(shù)量過少會導(dǎo)致突變庫不足，而孢子數(shù)量過大會使混合體難以挑出真正的高產(chǎn)菌株的問題[17]。

表1 雙指示劑法與p-NPP 法測量一致性的比較Table 1 Comparison of double indicator method and p-NPP method on measuring consistency

圖3 不同計算方式下標(biāo)準(zhǔn)曲線的差異：（a）利用反應(yīng)15 min 后的吸光度繪制；（b）利用預(yù)熱5 min 后與反應(yīng)15 min 后的吸光度差值繪制Fig. 3 Difference of standard curve under different calculation methods: (a) The standard curve drawn by absorbance after reaction for 15 min; (b) The standard curve drawn by absorbance difference between preheating 5 min and reaction 15 min

圖4 不同培養(yǎng)條件下米曲霉24 孔孔板生長情況對比Fig. 4 Comparison of the growth of 24-well plates of A. oryzae under different culture conditions

2.3 米曲霉產(chǎn)RML 高通量篩選

按1.2.2 節(jié)中所用方法進行誘變，致死率結(jié)果如圖5 所示。當(dāng)致死率在90%以上時菌株產(chǎn)生正突變的概率相對較高[18-20]，并且在此致死率下回復(fù)突變的概率更小。從圖5 可以看到，隨著誘變時間的增加致死率逐漸增高，在誘變時間為90 s 時，菌株致死率達到了95%，因此，選擇90 s 作為ARTP 的誘變時間。

初篩過程共篩選了1 200 孔，每孔30～40 個孢子，部分初篩結(jié)果如圖6 所示。發(fā)酵4 d 后利用雙指示劑法檢測，獲得比原始菌株酶活高出20%以上的孔，再吸取每孔約50 μL 發(fā)酵液涂布平板，挑出長勢良好的6 個單菌落接入固體孔板中培養(yǎng)，產(chǎn)孢后保種并進行復(fù)篩。

將每一輪得到的高產(chǎn)菌株孢子400 μL 接入250 mL搖瓶進行復(fù)篩，培養(yǎng)4 d 后利用p-NPP 法測量酶活。經(jīng)過第1 輪復(fù)篩，得到約14 株高產(chǎn)菌株，對這14 株菌進行了第2 輪復(fù)篩，結(jié)果如圖7 所示。

從圖7 可以看出，第2 輪復(fù)篩獲得4 株酶活顯著高于原始菌株的誘變菌株，分別命名為Ⅰ7-D6-7（96.72 U/mL），Ⅱ4-4B-5（117.86 U/mL），Ⅲ3-5C-1（107.59 U/mL），Ⅴ7-6C-3（99.96 U/mL），相較于出發(fā)菌株（80.47 U/mL），其酶活分別高出20.19%，46.46%，33.70%，24.22%。

圖5 米曲霉的ARTP 致死率曲線Fig. 5 Lethality rate curve of A. oryzae by ARTP

圖6 部分突變株初步篩選結(jié)果（紅線為出發(fā)菌株酶活）Fig. 6 Preliminary screening results of some mutant strains（Red line is the lipase activity of the original strain）

圖7 第2 輪復(fù)篩結(jié)果Fig. 7 Results of the second round of re-screening

圖8 突變株搖瓶驗證Fig. 8 Shaking flask verification of mutant strains

進一步將4 株高產(chǎn)突變菌與出發(fā)菌株接入搖瓶進行驗證，如圖8 所示，突變株Ⅰ7-D6-7、Ⅱ4-4B-5、Ⅲ3-5C-1、Ⅴ7-6C-3 的酶活分別達到了265.98、240.90、253.52、293.50 U/mL，比出發(fā)菌株（176.52 U/mL）分別提高了50.68%、36.47%、43.61%、66.27%。

3 結(jié)束語

本文通過雙指示劑法對檢測RML 酶活的高通量方法進行了系統(tǒng)優(yōu)化，從而有效提高了檢測的可靠性和精度。此外，以24-MTPs 作為載體，通過優(yōu)化培養(yǎng)條件，成功建立米曲霉高通量培養(yǎng)體系。在上述高通量培養(yǎng)和檢測的基礎(chǔ)上，對ARTP 誘變后的1 200孔（36 000～48 000 個孢子）進行高通量篩選，最終獲得4 株高產(chǎn)突變菌株，其中突變株Ⅴ7-6C-3 酶活達到293.50 U/mL，比出發(fā)菌株（176.52 U/mL）的酶活提高了66.27%。文獻報道中鮮有利用米曲霉表達RML 的研究，王斌等[21]在米曲霉中成功表達了RML，堿滴定法測得發(fā)酵上清液酶活為2.5 U/mL，遠低于本文所得到的RML 酶活。

本文建立了米曲霉產(chǎn)RML 高通量篩選體系，大大提高了菌株的篩選效率，同時篩選獲得的高產(chǎn)菌株能夠作為工業(yè)化應(yīng)用的儲備菌株。