亞胺還原酶的改造及其催化合成1-苯基-1,2,3,4-四氫異喹啉的性能

曹文斌， 李 昊， 陳飛飛， 潘 江， 鄭高偉， 許建和

（華東理工大學(xué)生物工程學(xué)院，省部共建上海生物制造產(chǎn)業(yè)協(xié)同創(chuàng)新中心，上海 200237）

四氫異喹啉(THIQs)作為具有生物活性的分子骨架在天然產(chǎn)物與藥物中存在非常普遍[1-2]，常作為受體拮抗劑[3]、受體激動(dòng)劑[4]、酶抑制劑[5-6]等。其中1-苯基-1,2,3,4-四氫異喹啉(1-Ph-THIQ)由于對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)具有獨(dú)特的抑制作用引起制藥領(lǐng)域的廣泛關(guān)注[7]，而（S）-1-苯基-1,2,3,4-四氫異喹啉（（S）-1-Ph-THIQ）是膀胱過(guò)度活動(dòng)癥治療藥物索利那新(Solifenacin)的關(guān)鍵結(jié)構(gòu)砌塊[8]。近年來(lái)，亞胺還原酶（IRED）催化環(huán)形亞胺不對(duì)稱氫化的反應(yīng)路線具有反應(yīng)條件溫和、立體選擇性高的優(yōu)點(diǎn)，被越來(lái)越多地用于不同結(jié)構(gòu)手性胺的不對(duì)稱合成[9-10]。然而，由于亞胺底物1-苯基-四氫異喹啉（1-Ph-DHIQ）中苯基的巨大位阻和苯基對(duì)鄰近官能團(tuán)的共軛效應(yīng)，使其酶法合成具有較大挑戰(zhàn)性。

迄今為止，對(duì)1-Ph-DHIQ 具有S對(duì)映體選擇性的亞胺還原酶報(bào)道僅有2 例[11-12]，一是亞胺還原酶SnIR[11]，比活力只有13 mU/mg，對(duì)映體選擇性（ee值）為51%；而改造所得的突變體T123I/G228T的比活力增加到56 mU/mg，ee值達(dá)91% ；二是武漢大學(xué)瞿旭東課題組報(bào)道的亞胺還原酶IR45[12]，其對(duì)映體選擇性具有較高ee值（99%），且對(duì)底物1-Ph-DHIQ 具有較好的催化性能，但存在明顯的底物抑制。

為獲得高效催化合成(S)-1-Ph-THIQ 的亞胺還原酶，本文首先對(duì)前期篩選獲得的亞胺還原酶(IRED)進(jìn)行反應(yīng)性能比較，然后對(duì)性能較好的候選酶AdIR1 進(jìn)行分子改造，并對(duì)所得的酶突變體進(jìn)行動(dòng)力學(xué)與熱穩(wěn)定性表征，最后嘗試?yán)脙?yōu)質(zhì)突變酶進(jìn)行(S)-1-Ph-THIQ 克級(jí)制備實(shí)驗(yàn)。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 原料和試劑

瓊脂糖凝膠DNA 回收試劑盒，質(zhì)粒小量提取試劑盒和PCR 產(chǎn)物回收試劑盒購(gòu)自上海艾德萊生物有限公司；DNA marker、蛋白質(zhì)marker、2×Taq PCR Mix購(gòu)自上海康為有限公司；引物由上海生工生物工程技術(shù)有限公司代合成；Ni 柱吸附親和層析柱購(gòu)自GE Healthcare 公司；蛋白胨和酵母膏購(gòu)自O(shè)xoid 公司；限制性內(nèi)切酶購(gòu)自New England Biolabs有限公司；PrimeSTAR 高保真酶和T4 DNA 連接酶購(gòu)自Takara有限公司；其余化學(xué)試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

PCR 儀、電泳儀、凝膠成像儀、紫外切膠儀、蛋白電泳儀、酶標(biāo)儀，美國(guó)Bio-Rad 公司；超微分光光度計(jì)，Nanodrop 2000c 型，美國(guó)Thermo Fisher 公司；全自動(dòng)高壓滅菌鍋，日本TOMY 公司；高速離心機(jī)，日本HITACHI 公司；紫外-可見分光光度計(jì)，日本SHIMADZU 公司；超凈工作臺(tái)，蘇州凈化設(shè)備有限公司；恒溫培養(yǎng)箱，上海一恒科技有限公司；恒溫震蕩搖床、深孔板搖床，上海智誠(chéng)科技有限公司；超聲破碎儀，寧波新芝生物科技有限公司。

1.2 目的基因克隆

本文使用表1 中所示引物通過(guò)PCR 分別從菌株Saccharothrix espanaensisDSM 44229 和Amycolatopsis decaplaninaDSM 44594 的基因組中擴(kuò)增獲得亞胺還原酶目的基因AdIR1和SeIR2。

PCR 體系(20 μL)：基因組模板1 μL (0.2 μg)，上下游引物分別加入1 μL(0.5 μmol/L)，2 × Taq Mix 10 μL，和ddH2O 7 μL。PCR 擴(kuò)增步驟：(1) 95 ℃，預(yù)變性3 min；(2) 95 ℃，變性10 s；(3) 55 ℃，退火5 s；(4) 72 ℃，延伸1 min，然后步驟(2)～(4)循環(huán)30 次；(5) 72 ℃延伸，延伸10 min，冷卻至4 ℃保存。

使用φ=1%的瓊脂糖凝膠對(duì)PCR 產(chǎn)物進(jìn)行電泳分析，采用瓊脂糖凝膠DNA 回收試劑盒回收目的基因片段。目的基因和pET-28a(+)質(zhì)粒經(jīng)限制性內(nèi)切酶NdeI 和EcoR I 雙酶切、T4 DNA 連接酶連接構(gòu)建重組質(zhì)粒，并轉(zhuǎn)化至Escherichia. coli(E.coli) BL21 (DE3)感受態(tài)細(xì)胞。

表1 目的基因克隆所用的引物Table 1 Primers used in target gene cloning

1.3 重組菌誘導(dǎo)與表達(dá)

從重組菌E. coliBL21 (DE3)甘油保藏管中取樣10 μL 接種至4 mL 的Lysogeny Broth （LB）培養(yǎng)基中(含50 μg/mL卡那霉素)，于37 ℃、200 r/min 條件下培養(yǎng)過(guò)夜。從菌液試管中轉(zhuǎn)接1 mL 菌液至含100 mL LB 培養(yǎng)基(含50 μg/mL 卡那霉素)的搖瓶中放大培養(yǎng)，當(dāng)搖床(37 ℃，220 r/min)培養(yǎng)至吸光度OD 值(OD600)為0.6～0.8 時(shí)，加入異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG，終濃度為0.2 mmol/L)于16 ℃、200 r/min條件下誘導(dǎo)表達(dá)24 h。最后在4 ℃、7 000g下離心收集菌體，對(duì)收集的菌體進(jìn)行超聲破碎獲得細(xì)胞破碎液。

1.4 1-苯基-3,4-二氫異喹啉的不對(duì)稱還原反應(yīng)

1 mL 反應(yīng)體系包含1 mmol/L 1-苯基-3,4-二氫異喹啉、0.1 mmol/L 還原型輔酶Ⅱ（NADPH）、5 mmol/L葡萄糖、1 mg/mL葡萄糖脫氫酶BmGDH 凍干酶粉[13]、100 mmol/L KPB 緩沖液(pH 7.0)和200 μL 新鮮細(xì)胞破碎上清(上清液按1 g 細(xì)胞配比10 mL 緩沖液制備)。不對(duì)稱還原反應(yīng)如圖1 所示，其中煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADP+)是還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)的氧化形式，GDH 為葡萄糖脫氫酶。

反應(yīng)條件為30 ℃、200 r/min，每組反應(yīng)至少重復(fù)2 次。采用2 mol/L NaOH 淬滅反應(yīng)并調(diào)節(jié)pH 至13，隨后立即用乙酸乙酯進(jìn)行萃取，并用高效液相色譜分析反應(yīng)轉(zhuǎn)化率和產(chǎn)物ee值。1-苯基-1,2,3,4-四氫異喹啉經(jīng)柱前乙?；蟮母咝б合嗌V法(HPLC)分析，分析條件為：OD-H 柱(250 mm × 4.6 mm, 5 μm)，正己烷和異丙醇體積比為95∶5，流速0.8 mL/min，波長(zhǎng)220 nm，溫度30 ℃。（R）-產(chǎn)物出峰時(shí)間為20～21 min；（S）-產(chǎn)物出峰時(shí)間為22～23 min。

1.5 亞胺還原酶的序列與結(jié)構(gòu)比對(duì)

通過(guò)CLUSTAL X 程序進(jìn)行序列比對(duì)。通過(guò)Swiss-model 在線同源建模[14](以PDB: 4OQY 的蛋白結(jié)構(gòu)作為模板)分別構(gòu)建得到SnIR 與AdIR1 (與4OQY 的序列一致性分別為43%和46%)的結(jié)構(gòu)模型，再利用Pymol 軟件對(duì)SnIR 與AdIR1 進(jìn)行空間結(jié)構(gòu)比對(duì)。

圖1 亞胺還原酶催化的不對(duì)稱還原反應(yīng)Fig. 1 Asymmetric reduction reaction catalyzed by IRED

1.6 AdIR1 酶突變庫(kù)的構(gòu)建與初篩

以母本AdIR1 重組pET-28a(+)質(zhì)粒為模板，使用PrimeSTAR 高保真聚合酶和表2 所示的目的基因定點(diǎn)突變所用PCR 引物進(jìn)行PCR 構(gòu)建單點(diǎn)飽和突變庫(kù)。PCR 產(chǎn)物經(jīng)DpnI 酶消化(37 ℃、2 h)后轉(zhuǎn)化至E. coliBL21 感受態(tài)細(xì)胞，并涂布LB 平板(含50 μg/mL 卡那霉素)，于37 ℃培養(yǎng)箱過(guò)夜培養(yǎng)。

突變體庫(kù)篩選步驟如下：

(1) 用牙簽將平板上的突變體轉(zhuǎn)化子轉(zhuǎn)移至一級(jí)板(單孔有300 μL LB 培養(yǎng)基，含50 μg/mL 卡那霉素)中，于37 ℃、220 r/min 下振蕩過(guò)夜培養(yǎng)，每塊板中含有3 個(gè)母本和34 個(gè)轉(zhuǎn)化子。

(2) 取50 μL 一級(jí)種子液轉(zhuǎn)接至二級(jí)板(單孔有600 μL LB 培養(yǎng)基，含50 μg/mL 卡那霉素)中培養(yǎng)，37 ℃下培養(yǎng)3 h，加入異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG，終濃度0.2 mmol/L)，并于16 ℃下繼續(xù)培養(yǎng)24 h 誘導(dǎo)突變體表達(dá)。

(3) 在3 500 r/min 條件下離心10 min 以收集菌體。

(4) 每孔加入200 μL 裂解液(100 mmol/L KPB 緩沖液，pH 7.0，含750 mg/L 溶菌酶和10 mg/L DNase酶)，振蕩使細(xì)胞懸浮均勻，然后于37 ℃、200 r/min條件下保溫2 h 破碎細(xì)胞。

(5) 在4 ℃條件下，3 500 r/min 離心30 min 后取上清用酶標(biāo)儀在酶標(biāo)板中測(cè)定活力。

篩選反應(yīng)條件(200 μL)：篩選反應(yīng)液150 μL (含NADPH 0.27 mmol/L，底物1-Ph-DHIQ 0.13 mmol/L，100 mmol/L KPB 緩 沖 液，pH 7.0)，離 心 破 碎 液 上清50 μL。

1.7 AdIR1 突變體的復(fù)篩

采用1.3 節(jié)所述方法對(duì)目標(biāo)突變體進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，使用鎳離子親和吸附柱(His Trap Ni-NTA FF column, 5 mL)對(duì)發(fā)酵表達(dá)的含有His-tag 的重組酶蛋白進(jìn)行純化[13]，并對(duì)純酶的比活力進(jìn)行測(cè)定。

1.8 純酶測(cè)活與蛋白濃度測(cè)定

亞胺還原酶的標(biāo)準(zhǔn)酶活測(cè)定體系(1 mL)：底物為1-苯基-3,4-二氫異喹啉的二甲基亞砜（DMSO）溶液(10 μL，底物終濃度為1 mmol/L)、NADPH (10 μL，終濃度為0.1 mmol/L)，一定濃度的酶液(10 μL)及970 μL KPB 緩沖液(100 mmol/L，pH 7.0)。在30 ℃條件下檢測(cè)340 nm 處吸光度的變化。

酶活力（U）單位的定義為：在上述條件下，每分鐘氧化1 μmol 輔酶所需的酶量，酶活計(jì)算公式如下所示：

其中：EW代表340 nm 處吸光度在1 min 內(nèi)的變化值；V代表反應(yīng)液體系的體積量(mL)；ε代表消光系數(shù)(L/(mol·cm))；l代表光程距離(cm)。

蛋白質(zhì)含量測(cè)定方法：使用Nanodrop 2000c 超微量分光光度計(jì)對(duì)純酶蛋白含量進(jìn)行測(cè)定，所得測(cè)量值除以蛋白的消光系數(shù)即得實(shí)際蛋白濃度。

1.9 突變體的酶學(xué)性質(zhì)表征

最適催化pH 研究條件：測(cè)定亞胺還原酶在pH 3.0～11.0 范圍內(nèi)不同緩沖液的酶活性，其中pH 3.0～6.0選用檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液(100 mmol/L)，pH 6.0～8.0 選用KPB 緩沖液(100 mmol/L)，pH 8.0～9.0 選用Tris-HCl 緩沖液(100 mmol/L)，pH 9.0～11.0 選用甘氨酸-氫氧化鈉緩沖液(100 mmol/L)。

熱穩(wěn)定性研究條件：對(duì)酶催化活力的半衰期(t1/2)考察，預(yù)先用KPB 緩沖液(100 mmol/L, pH 7.0)將AdIR1 突變體酶溶液稀釋至1 mg/mL 后，置于不同的溫度(30、40、50 ℃)下保溫，間隔取樣，按標(biāo)準(zhǔn)測(cè)活條件測(cè)定酶的殘余活力。以初始活力為基準(zhǔn)，將測(cè)定得到酶的殘余活力換算為相對(duì)活力，相對(duì)活力數(shù)據(jù)通過(guò)Excel 線性處理并擬合得到t1/2。

表2 目的基因定點(diǎn)突變所用PCR 引物Table 2 PCR primers used for site-directed mutations of target gene

催化動(dòng)力學(xué)研究條件：測(cè)定不同濃度底物(1-甲基-3,4-二氫異喹啉)、不同輔酶(NADPH)濃度下酶的比活力數(shù)據(jù)，并采用Origin 9.0 軟件根據(jù)米氏方程模型擬合獲得酶的動(dòng)力學(xué)參數(shù)，分為以下3 種：

(1)無(wú)底物抑制條件下的催化模型

其中：v為酶的比活(μmol/(min·mg))；cS為底物或者輔酶濃度(mmol/L)；Vmax為催化最大反應(yīng)速度(μmol/(min·mg))，是底物飽和時(shí)的反應(yīng)速度；Km為米氏常數(shù)(mmol/L)，是酶達(dá)到1/2Vmax時(shí)的底物濃度。

(2)底物抑制條件下的催化模型

其中：Ki為抑制常數(shù)(mmol/L)，反映出抑制劑與蛋白質(zhì)的結(jié)合緊密程度。

(3)催化常數(shù)kcat計(jì)算方程

其中：kcat為催化速率(s-1)，是一個(gè)酶（或者一個(gè)活性部位）在底物飽和狀態(tài)下反應(yīng)快慢的參數(shù)；MVEnzyme為單位質(zhì)量酶的分子數(shù)量(mmol/mg)。

1.10 1-苯基-1,2,3,4-四氫異喹啉的克級(jí)制備

1.10.1 最適反應(yīng)溫度考察 1 mL 反應(yīng)體系包含5 mmol/L 1-苯基-3,4-二氫異喹啉、0.1 mmol/L NADPH、25 mmol/L 葡萄糖、1 mg/mL BmGDH 凍干酶粉、5 mg/mL 亞胺還原酶凍干酶粉、100 mmol/L KPB 緩沖液(pH 7.0)和 φ =1%的DMSO。反應(yīng)條件為轉(zhuǎn)速200 r/min，溫度分別為30、40 ℃。

1.10.2 最適助溶劑體積分?jǐn)?shù)考察 10 mL 反應(yīng)體系包含5 mmol/L 1-苯基-3,4-二氫異喹啉、0.1 mmol/L NADPH、25 mmol/L葡萄糖、1 mg/mL BmGDH 凍干酶粉、5 mg/mL 亞胺還原酶凍干酶粉、100 mmol/L KPB 緩沖液(pH 7.0)，反應(yīng)條件為轉(zhuǎn)速200 r/min，40 ℃，助溶劑體積分?jǐn)?shù)分別為1%、2%、5%及10% 。

1.10.3 克級(jí)制備反應(yīng) 在以上篩選得到的最適溫度以及最適助溶劑濃度條件下，以8 g/L 的突變體凍干酶粉為催化劑，其余反應(yīng)條件參照1.4 節(jié)按比例擴(kuò)大至2 L 反應(yīng)體系下進(jìn)行1-苯基-1,2,3,4-四氫異喹啉的克級(jí)制備反應(yīng)。反應(yīng)過(guò)程定期取樣檢測(cè)反應(yīng)進(jìn)程。反應(yīng)結(jié)束后進(jìn)行淬滅、萃取通過(guò)硅膠柱層析法(流動(dòng)相：乙酸乙酯和石油醚體積比為2∶1)對(duì)目標(biāo)產(chǎn)物進(jìn)行純化。

2 結(jié)果與討論

2.1 1-苯基-3,4-二氫異喹啉的不對(duì)稱酶促還原反應(yīng)

通過(guò)以上反應(yīng)條件，本文探索了AdIR1 和SeIR2分別對(duì)1-苯基-3,4-二氫異喹啉的不對(duì)稱還原反應(yīng)效果，結(jié)果如表3 所示?？梢钥闯?，AdIR1 是一個(gè)具有較優(yōu)催化效率的亞胺還原酶，經(jīng)過(guò)24 h 的反應(yīng)，實(shí)現(xiàn)了98%的轉(zhuǎn)化率（C），合成S構(gòu)型產(chǎn)物，ee值達(dá)98%，結(jié)果明顯優(yōu)于SeIR2。因此，后續(xù)以反應(yīng)效果更優(yōu)質(zhì)的AdIR1 作為分子改造的起始酶。

表3 亞胺還原酶不對(duì)稱還原1-苯基-3,4-二氫異喹啉的反應(yīng)Table 3 Asymmetric reduction of 1-phenyl-3,4-dihydroisoquinoline by IRED

2.2 AdIR1 與SnIR 的序列與結(jié)構(gòu)比對(duì)

在前期研究中發(fā)現(xiàn)，T123I、F178L、G228A 3 個(gè)位點(diǎn)的突變會(huì)顯著影響SnIR 酶催化1-芳基二氫異喹啉不對(duì)稱催化產(chǎn)物的ee值，同時(shí)也導(dǎo)致了活力的下降。因此，文中將SnIR 與AdIR1 進(jìn)行序列及結(jié)構(gòu)比對(duì)，以期找到與SnIR 的T123、F178 和G228 位點(diǎn)相對(duì)應(yīng)的AdIR1 關(guān)鍵殘基，結(jié)果如表4 以及圖2 所示。

表4 亞胺還原酶的關(guān)鍵位點(diǎn)比對(duì)結(jié)果Table 4 Alignment results of key residues of the imine reductases

圖2 SnIR 與AdIR1 的結(jié)構(gòu)比對(duì)結(jié)果Fig. 2 Results for structural alignment of AdIR1 with SnIR

以上比對(duì)結(jié)果表明，對(duì)于V118 與F172 位點(diǎn)，AdIR1 與SnIR 通過(guò)序列比對(duì)的定位結(jié)果與空間結(jié)構(gòu)比對(duì)的結(jié)果一致。由于這兩個(gè)位點(diǎn)都位于序列保守區(qū)域，故可信度比較高。而另一方面對(duì)于G228 位點(diǎn)，一級(jí)序列的比對(duì)結(jié)果呈現(xiàn)出與空間比對(duì)不一致的結(jié)果。由于酶分子的半理性改造在原理分析上通常偏好基于空間比對(duì)的結(jié)果，故最終選擇了G220 作為改造位點(diǎn)。

2.3 AdIR1 的分子改造結(jié)果

通過(guò)分子改造，雖然在G220 殘基的突變中并未發(fā)現(xiàn)酶活有效提升的突變體，但在V118 和F172 位點(diǎn)的單突變嘗試中篩選到幾個(gè)活力可能提升的突變體。通過(guò)對(duì)其宿主細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)、誘導(dǎo)表達(dá)以及親和純化，獲得純酶。隨后，在30 ℃條件下測(cè)定純化后的突變酶(M1～M4)對(duì)1-苯基-3,4-二氫異喹啉(底物濃度為0.1 mmol/L)活力，結(jié)果如表5 所示。

表5 AdIR1 突變體的測(cè)活結(jié)果Table 5 Activity assay results of AdIR1 mutants

通過(guò)測(cè)活發(fā)現(xiàn)，突變酶M1 與M3 并沒有有效地增加AdIR1 對(duì)底物的催化活力，甚至在M2 中，分子改造使得其活力下降。而M4 突變有效增加了酶活，提升了1.9 倍。因此，通過(guò)對(duì)F172 位點(diǎn)的改造，本文得到了使AdIR1 活力顯著提升的突變體。隨后通過(guò)基因測(cè)序發(fā)現(xiàn)該突變型為F172Y。

2.4 亞胺還原酶突變體的酶學(xué)性質(zhì)表征

2.4.1 pH 對(duì)酶活力的影響 通過(guò)使用不同的緩沖液，得到了在不同pH 條件下母本(WT)與突變體F172Y的催化活力特征曲線，結(jié)果如圖3 所示。與母本相似，突變體F172Y 對(duì)pH 呈現(xiàn)出典型的鐘形曲線，且最適pH 同樣為 7.0。

2.4.2 熱穩(wěn)定性表征結(jié)果 對(duì)母本和突變體F172Y稀釋酶液在30、40 ℃和50 ℃條件下保溫一定時(shí)間后取樣，用底物1-苯基-3,4-二氫異喹啉測(cè)定酶活，得到其在不同溫度下殘余活性的變化曲線，結(jié)果如圖4所示。半衰期結(jié)果由Excel 進(jìn)行曲線模擬所得，結(jié)果如表6 所示。

結(jié)果表明，突變體F172Y 雖然僅突變了一個(gè)位點(diǎn)，但是熱穩(wěn)定性有顯著提升，其在30 ℃和40 ℃條件下96 h 保溫后酶活力損失低于20%，并且擬合得到的t1/2在30、40 ℃以及50 ℃條件下分別是母本的4.6 倍、6.3 倍和3.9 倍。其中原母本在40 ℃條件下保溫12 h 殘留活性不足70%，而突變體F172Y 卻保持了91%的殘留活性，與30 ℃條件92%的殘余活性基本保持一致。因此后期的反應(yīng)進(jìn)程表征以及制備反應(yīng)將選用40 ℃作為反應(yīng)條件。

圖3 pH 對(duì)母本(a)與F172Y(b)酶活的影響Fig. 3 Effect of pH on the enzyme activity of WT(a) and F172Y(b)

圖4 母本(a)與F172Y(b)的熱穩(wěn)定性Fig. 4 Thermostability of WT (a) and F172Y (b)

表6 F172Y 與母本的半衰期Table 6 Half-lives of WT and F172Y at different temperatures

2.4.3 動(dòng)力學(xué)表征結(jié)果 利用不同濃度的1-苯基-3,4-二氫異喹啉為底物，本文分別測(cè)定了母本與突變體F172Y 的底物動(dòng)力學(xué)特征曲線，結(jié)果如圖5 所示，并依據(jù)動(dòng)力學(xué)特征曲線擬合計(jì)算出動(dòng)力學(xué)參數(shù)，結(jié)果如表7 所示。

通過(guò)以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，WT 與F172Y 對(duì)底物1-苯基-3,4-二氫異喹啉皆不存在底物抑制，意味著其在未來(lái)的工業(yè)生產(chǎn)上具有非常優(yōu)質(zhì)的應(yīng)用前景。此前，通過(guò)F172Y 單點(diǎn)的突變，使該酶在Km保持不變的情況下，kcat有了3.4 倍的提升，即催化效率常數(shù)(kcat/Km)提升了3.4 倍。而溫度提高時(shí)催化效率常數(shù)提升不明顯，主要因?yàn)閗cat有顯著提升的同時(shí)Km亦有提升?；盍y(cè)定表明，在40 ℃且飽和的底物濃度條件下，比活可達(dá)46 mU/mg，這比30 ℃條件下的活力(15.3 mU/mg)提高了約3 倍。

圖5 母本與F172Y 的動(dòng)力學(xué)特征曲線Fig. 5 Kinetic characteristic curves of WT and F172Y

表7 母本與F172Y 的催化動(dòng)力學(xué)參數(shù)Table 7 Kinetic parameters of WT and F172Y

2.5 亞胺還原酶母本與突變體的反應(yīng)進(jìn)程對(duì)比

通過(guò)對(duì)母本與突變體F172Y 在30 ℃、1 mmol/L底物濃度條件下的反應(yīng)進(jìn)程表征，本文得到了兩者的反應(yīng)進(jìn)程曲線，結(jié)果如圖6 所示。

圖6 母本(黃色)與突變體F172Y(綠色)的反應(yīng)進(jìn)程曲線Fig. 6 Reaction process curves of WT (yellow) and F172Y(green) of AdIR1

以上結(jié)果表明，母本可以在6 h 實(shí)現(xiàn)94%的轉(zhuǎn)化率，產(chǎn)物ee值為98%。而突變體F172Y 并沒有因?yàn)辄c(diǎn)位突變而影響其對(duì)映體選擇性，其在前3 h 基本完成轉(zhuǎn)化，實(shí)現(xiàn)90%的轉(zhuǎn)化率和99%的ee值，后續(xù)過(guò)程中轉(zhuǎn)化率慢慢提升至92%，ee值始終保持在99%。

2.6 1-苯基-1,2,3,4-四氫異喹啉的克級(jí)制備反應(yīng)

2.6.1 制備反應(yīng)的最適溫度篩選 前期的酶學(xué)性質(zhì)表征結(jié)果表明突變體F172Y 催化合成1-苯基-1,2,3,4-四氫異喹啉的最適催化溫度為40 ℃。由于制備級(jí)反應(yīng)的底物濃度提升到了5 mmol/L，在此濃度下本文考察了突變體F172Y 不同溫度下催化合成1-苯基-1,2,3,4-四氫異喹啉的反應(yīng)效果，結(jié)果如表8 所示，在1 mL 反應(yīng)體系中，酶在40 ℃條件下的確表現(xiàn)出了比30 ℃更高的轉(zhuǎn)化率，其在40 ℃反應(yīng)6 h 的結(jié)果與30 ℃反應(yīng)12 h 的結(jié)果一致。因此，確定40 ℃為制備反應(yīng)的溫度條件。

表8 F172Y 在30 ℃與40 ℃下的反應(yīng)轉(zhuǎn)化結(jié)果Table 8 Reaction conversion results of F172Y at 30 ℃ and 40 ℃

2.6.2 最適助溶劑體積分?jǐn)?shù)篩選結(jié)果 除了最適溫度，本文還對(duì)最適助溶劑體積分?jǐn)?shù)進(jìn)行了考察。為了降低DMSO 加入量的誤差，反應(yīng)體系擴(kuò)大到了10 mL級(jí)別，結(jié)果如圖7 所示。結(jié)果表明， φ =2%的DMSO加入量的轉(zhuǎn)化效果略優(yōu)于1%與5%，且遠(yuǎn)優(yōu)于10%。因此將 φ =2%的DMSO 確定為最適助溶劑。另外，該反應(yīng)條件下4 h 便完成了92%的轉(zhuǎn)化，該結(jié)果高于最適溫度篩選中6 h 的轉(zhuǎn)化率，原因可能是10 mL 反應(yīng)器相對(duì)于振蕩反應(yīng)器具有更佳的傳質(zhì)、傳熱效果。

圖7 不同助溶劑濃度下的反應(yīng)曲線Fig. 7 Reaction curves with different cosolvent volume fractions

2.6.3 克級(jí)制備反應(yīng) 經(jīng)過(guò)以上的反應(yīng)條件優(yōu)化，本文將反應(yīng)體系擴(kuò)大到2 L，在5 L 發(fā)酵罐中開展反應(yīng)，底物1-苯基-3,4 二氫異喹啉的上載量為10 mmol(2.05 g)，反應(yīng)進(jìn)程曲線如圖8 所示。由圖8 可以看出，12 h 后反應(yīng)轉(zhuǎn)化率僅維持在85%，且基本不再變化；反應(yīng)24 h 后對(duì)反應(yīng)進(jìn)行淬滅，通過(guò)柱層析純化得到0.34 g 的（S）-1-苯基-1,2,3,4-四氫異喹啉產(chǎn)物(得率為16.4%)。

圖8 克級(jí)制備反應(yīng)的反應(yīng)進(jìn)程曲線Fig. 8 Reaction process curves of gram-scale preparative reaction

3 結(jié) 論

以反應(yīng)轉(zhuǎn)化率和對(duì)映體選擇性結(jié)果較優(yōu)的AdIR1 作為分子改造的起始酶，得到了突變體F172Y，其在30 ℃條件下酶活為15.3 mU/mg，相較于母本提升了1.9 倍，催化效率(kcat/Km)相較于母本有3.4 倍的提升。同時(shí)突變體F172Y 具有更優(yōu)的熱穩(wěn)定性，在30 ℃和40 ℃條件下的t1/2分別是母本4.6 倍和6.3倍。另外，母本與突變體都未發(fā)現(xiàn)底物抑制情況。在催化合成1-苯基-1,2,3,4-四氫異喹啉的反應(yīng)進(jìn)程中，突變體F172Y 具有更快的轉(zhuǎn)化效果，相較于母本需要6 h 基本完成反應(yīng)轉(zhuǎn)化，其僅需要3 h，且ee值維持在99%。在最適反應(yīng)條件(40 ℃, φ =2% DMSO)下，利用突變體F172Y 作為催化劑開展了S構(gòu)型1-苯基-1,2,3,4-四氫異喹啉的克級(jí)制備反應(yīng)，反應(yīng)12 h后可達(dá)85%的轉(zhuǎn)化率，通過(guò)柱層析分離得到了0.34 g產(chǎn)物，分離得率為16.4%，展示出所開發(fā)的突變酶F172Y 不對(duì)稱合成手性1-苯基-1,2,3,4-四氫異喹啉的實(shí)用性。