藥用膠塞中抗氧化劑的測定及其向藥品中的遷移研究

張錫云，王愛秀，許 艷，路青云，崔毓城，陳蘇玲，張慧云，楊 寧，田 園，李小娟，朱衍志△

(1.蘭州生物技術(shù)開發(fā)有限公司，甘肅 蘭州 730046；2.甘肅省食品藥品檢定研究院，甘肅 蘭州 730070)

高效液相色譜法(HPLC)是采用高壓輸液泵將規(guī)定的流動相泵入裝有填充劑的色譜柱，對供試品進(jìn)行分離測定的色譜方法。注入的供試品由流動相帶入色譜柱內(nèi)，各組分在柱內(nèi)被分離，并進(jìn)入檢測器檢測，由積分儀或數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)記錄和處理色譜信號。HPLC儀器由高壓輸液泵、進(jìn)樣器、色譜柱、檢測器、積分儀或數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)組成[1]。目前，HPLC廣泛應(yīng)用于生命科學(xué)、食品科學(xué)、藥物研究及環(huán)境研究中。

藥用丁基橡膠塞作為常見的內(nèi)包材之一，廣泛應(yīng)用于各類注射劑產(chǎn)品中[2-3]。橡膠中含有不飽和的雙鍵,在使用過程中易被氧化，所以在生產(chǎn)過程中通常加入抗氧劑，常見的抗氧劑有抗氧劑1010、抗氧劑330、抗氧劑1076、抗氧劑168和抗氧劑BHT等。根據(jù)《化學(xué)藥品注射劑與塑料包裝材料相容性研究技術(shù)指導(dǎo)原則(試行)》[4]中塑料包裝材料添加劑及限度要求，其中抗氧劑BHT添加量應(yīng)不超過0.125%，其他抗氧劑添加量均應(yīng)不得超過0.3%；每種包裝材料中添加抗氧劑的種類不能超過3種，且總量不得超過0.3%。因此，本研究嘗試建立了可同時測定這5種抗氧化劑的HPLC法，并采用該方法測定了膠塞中抗氧化劑向注射用A型肉毒毒素(BTXA)中的遷移情況。

1 材料與方法

1.1材料 抗氧劑1010(批號:5692-01)、抗氧劑330(批號：5691-01)、抗氧劑1076(批號：5691-01)、抗氧劑168(批號：5690-01)均購自美國AccuStandard公司；抗氧劑BHT(2,6-Di-ter-butyl-4-methylpheno)購自德國Dr.Ehrenstorfer GmbH公司，含量99.5%。BTXA(批號：試20191206-1、試20191206-2、試20191206-3)由蘭州生物技術(shù)開發(fā)有限公司提供。

1.2儀器與試劑 Thermo高效液相色譜儀(型號：UItiMate 3000)、DAD檢測器、電子天平(型號：MS 205DU)。甲醇、無水乙醇、乙腈、四氫呋喃和二氯甲烷為色譜純，試驗(yàn)用水為純化水。

1.3方法

1.3.1色譜條件 色譜柱為島津Inertsil ODS-3 C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)，流動相為乙腈-四氫呋喃-水(62∶30∶8)[5]，流速1.5 mL/min，柱溫35 ℃，檢測波長278 nm，進(jìn)樣體積20.0 μL。

1.3.2系統(tǒng)適用性 分別精密稱取抗氧劑1010、抗氧劑1076、抗氧劑168、抗氧劑330和抗氧劑BHT 10.0 mg，置于同一100 mL容量瓶中，加入甲醇-二氯甲烷溶液(5∶2)[6]溶解并稀釋至刻度并搖勻，作為系統(tǒng)適用性溶液。將系統(tǒng)適用性溶液連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄色譜峰的響應(yīng)值、理論塔板數(shù)和分離度。

1.3.3線性范圍

1.3.3.1對照品儲備液配制 分別精密稱取抗氧劑1010、抗氧劑1076、抗氧劑168、抗氧劑330 20.0 mg和抗氧劑BHT 15.0 mg，置于同一50.0 mL容量瓶中，加入甲醇-二氯甲烷溶液溶解并稀釋至刻度并搖勻，作為對照品儲備液。

1.3.3.2線性范圍測試 分別精密量取對照品儲備液1.0、1.0、5.0、1.0、1.0 mL，分別置5.0、10.0、100.0、25.0、50.0 mL容量瓶中，用甲醇-二氯甲烷溶液稀釋至刻度并搖勻，作為建立標(biāo)準(zhǔn)曲線的對照品溶液(分別記為A～E組)，具體相關(guān)濃度見表1。將上述對照品溶液按1.3.1的色譜條件分別進(jìn)樣分析，每個質(zhì)量濃度重復(fù)測定3次，以待測物質(zhì)濃度為橫坐標(biāo)，峰面積平均值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

表1 抗氧劑線性濃度(μg/mL)

1.3.4準(zhǔn)確度

1.3.4.1BTXA回收率實(shí)驗(yàn) 加標(biāo)供試品溶液制備：取2支BTXA，精密稱取內(nèi)容物約20.0 mg，置于5.0 mL容量瓶中，加適量甲醇-二氯甲烷溶液，再分別加入對照品儲備液100.0、150.0、200.0 μL(分別標(biāo)記為F～H組)超聲10 min，冷卻后用甲醇-二氯甲烷溶液稀釋至刻度，搖勻，過濾，取濾液。同法制備空白溶液。每種加標(biāo)樣品溶液平行制備3份，分別進(jìn)行測定。

1.3.4.2膠塞回收率實(shí)驗(yàn) 加標(biāo)供試品溶液制備：精密稱取膠塞(剪碎)5.0 g，置燒瓶中，精密加入無水乙醇25.0 mL，再精密加入對照品儲備液200.0、300.0、400.0 μL(分別標(biāo)記為I～K組)，小于《化學(xué)藥品注射劑與塑料包裝材料相容性研究技術(shù)指導(dǎo)原則》[7]中抗氧劑最大添加量。稱定重量，置電熱爐上加熱回流4 h，放冷，用無水乙醇補(bǔ)足重量并搖勻，過濾，取濾液。同法制備空白溶液。每種加標(biāo)樣品溶液平行制備3份，分別進(jìn)行測定。

1.3.5重復(fù)性

1.3.5.1BTXA重復(fù)性實(shí)驗(yàn) 精密量取對照品儲備液1.0 mL，置于50.0 mL容量瓶中，用甲醇-二氯甲烷溶液稀釋至刻度并搖勻，作為對照品溶液。精密稱取BTXA內(nèi)容物20.0 mg(2支)，置于5.0 mL容量瓶中，加適量甲醇-二氯甲烷溶液，再加入對照品儲備液0.1 mL，超聲10 min，冷卻后用甲醇-二氯甲烷溶液稀釋至刻度并搖勻，過濾，取續(xù)濾液，作為供試品溶液。每種供試品溶液平行制備6份，采用外標(biāo)法分別進(jìn)行測定。

1.3.5.2膠塞重復(fù)性實(shí)驗(yàn) 精密量取系統(tǒng)適用性溶液3.0 mL，置于10.0 mL容量瓶中用無水乙醇稀釋至刻度并搖勻，即得對照品溶液。精密稱取膠塞(剪碎)5.0 g置于燒瓶中，加入25.0 mL精密量取的無水乙醇，稱定重量，置電熱爐上加熱回流4 h，冷卻后用無水乙醇補(bǔ)足重量并搖勻，過濾，取濾液。同法制備空白溶液。平行制備6份膠塞浸提液，采用外標(biāo)法分別進(jìn)行測定。

1.3.6檢出限和定量限 精密量取對照品儲備液1.0 mL，置于100.0 mL容量瓶中，用甲醇-二氯甲烷溶液稀釋至刻度并搖勻，作為定量限和檢出限溶液。精密量取不同體積(分別為1.0、1.5、4.0、11.0 μL)溶液注入液相色譜，記錄色譜峰的響應(yīng)值，計(jì)算信噪比，考察其檢出限及定量限的范圍。

1.3.7穩(wěn)定性 取系統(tǒng)適用性溶液20.0 μL進(jìn)樣，每2小時進(jìn)樣1次，連續(xù)進(jìn)樣24 h，記錄色譜峰的響應(yīng)值。

1.3.8抗氧劑在藥液中的遷移 取加速條件下的BTXA 3批，分別于1、2、3、6個月測定BTXA中的抗氧劑，具體操作方法如下：取BTXA 2支，精密稱取內(nèi)容物20.0 mg，置5.0 mL量瓶中，加適量甲醇-二氯甲烷溶液，超聲10 min，放至室溫，用甲醇-二氯甲烷溶液稀釋至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液。同法制備空白溶液，按外標(biāo)法計(jì)算含量。

2 結(jié) 果

2.1系統(tǒng)適用性 各抗氧劑重復(fù)性相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)均小于0.7%，分離度均大于1.5。典型色譜圖見圖1，色譜峰的理論塔板數(shù)和分離度見表2。

表2 抗氧劑系統(tǒng)適用性

1.抗氧劑BHT；2.抗氧劑1010；3.抗氧劑330；4.抗氧劑1076；5.抗氧劑168。

2.2線性范圍及相關(guān)系數(shù) 抗氧劑含量與峰面積平均值呈線性相關(guān)(P<0.000 1)。見表3。

表3 抗氧劑線性范圍及相關(guān)系數(shù)

2.3準(zhǔn)確度

2.3.1BTXA回收率實(shí)驗(yàn) BTXA中抗氧劑回收率為95%～105%，見表4。

表4 抗氧劑在BTXA中的回收率(%)

2.3.2膠塞回收率試驗(yàn) 膠塞中抗氧劑回收率為87%～109%，見表5。

表5 抗氧劑在膠塞中的回收率(%)

2.4重復(fù)性

2.4.1BTXA重復(fù)性實(shí)驗(yàn) 由于BTXA中未檢測到抗氧劑，因此采用加標(biāo)方法，作為重復(fù)性實(shí)驗(yàn)?？寡鮿〣HT、抗氧劑1010、抗氧劑330、抗氧劑1076、抗氧劑168的重復(fù)性RSD值分別為3.6%、3.4%、3.7%、4.3%、4.7%，見表6。

表6 BTXA中抗氧劑重復(fù)性實(shí)驗(yàn)結(jié)果(μg/mL)

2.4.2膠塞重復(fù)性試驗(yàn) 膠塞中僅檢出抗氧劑BHT，平均為0.014 2%，抗氧劑BHT的重復(fù)性RSD為1.9%，見表7。膠塞色譜圖見圖2。

表7 膠塞中抗氧劑重復(fù)性實(shí)驗(yàn)結(jié)果

圖2 膠塞色譜圖

2.5定量限和檢出限 不同抗氧劑檢出限范圍為3.1～16.5 ng，定量限范圍為4.6～45.5 ng。見表8。

表8 抗氧劑定量限和檢出限范圍(ng)

2.6穩(wěn)定性 抗氧劑BHT、抗氧劑1010、抗氧劑330、抗氧劑1076、抗氧劑168的峰面積RSD值分別為0.3%、0.5%、0.4%、0.6%、0.4%。

2.7抗氧劑在BTXA中的遷移情況 BTXA中均未檢出抗氧化劑。見表9。

表9 抗氧劑在BTXA中的遷移情況

3 討 論

直接接觸藥品的膠塞，在藥品銷售儲運(yùn)過程中氧化劑可能會滲透或遷移到藥品中，并隨著藥品進(jìn)入人體，可能導(dǎo)致嚴(yán)重的不良反應(yīng)[8-12]。因此,有必要對膠塞中抗氧化劑的含量進(jìn)行檢測和控制。目前，用于藥用膠塞抗氧化劑檢測的方法主要有3種。(1)氣相色譜法：利用氣體作流動相的色譜分離分析方法。汽化的試樣被載氣(流動相)帶入色譜柱中，柱中的固定相與試樣中各組分分子作用力不同，各組分從色譜柱中流出時間不同[1]。該方法主要用來檢測分子量低及對熱不敏感的抗氧化劑，如抗氧化劑BHT等。(2)液相色譜法：采用高壓輸液泵將規(guī)定的流動相泵入裝有填充劑的色譜柱，對供試品進(jìn)行分離測定的色譜方法[13]。(3)在線檢測技術(shù)：該技術(shù)是近年來的一種創(chuàng)新型檢測方法，主要利用先進(jìn)的接口實(shí)現(xiàn)設(shè)備智能的串聯(lián)，逐步實(shí)現(xiàn)智能化檢測，從而實(shí)現(xiàn)樣品在線檢測。如固相微萃取-氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜在線檢測技術(shù)及凝膠滲透色譜-高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜在線檢測技術(shù)，都有極好的應(yīng)用前景[14-15]。目前，在線檢測技術(shù)的檢測成本較高。

本研究建立了可用于檢測膠塞及BTXA中抗氧劑BHT、抗氧劑1010、抗氧劑330、抗氧劑1076、抗氧劑168含量的HPLC法。根據(jù)目前歐洲藥品局推薦的遺傳毒性致癌物的安全性閾值為每天1.5 μg國際藥用氣霧劑聯(lián)盟推薦的吸入制劑的安全性閾值為每天0.15 μg[16]。本研究建立的HPLC法的檢出限為3.1～16.5 ng,定量限為4.6～45.5 ng，遠(yuǎn)小于上述推薦值，提示該方法靈敏度符合要求。本研究結(jié)果顯示，各抗氧劑線性相關(guān)系數(shù)均大于0.999，重復(fù)性RSD均小于0.7%，具有較好穩(wěn)定性。本研究選擇甲醇-二氯甲烷溶液作為溶解液，其既可以溶解樣品，又可以溶解待測5種氧化劑。本研究結(jié)果顯示，BTXA中抗氧劑重復(fù)性RSD均小于4.7%，膠塞中抗氧劑BHT的重復(fù)性RSD為1.9%，BTXA中抗氧劑回收率為95%～105%，膠塞中抗氧劑回收率為87%～109%，均符合《分析方法驗(yàn)證指導(dǎo)原則》的相關(guān)要求[17]。本研究中在膠塞中僅檢出抗氧劑BHT，平均為0.014 2%。膠塞中抗氧劑符合《化學(xué)藥品注射劑與塑料包裝材料相容性研究技術(shù)指導(dǎo)原則(試行)》中塑料包裝材料添加劑及限度要求。同時，取加速條件下的BTXA 3批，分別于1、2、3、6個月測定BTXA中的抗氧劑，結(jié)果均未檢出，提示膠塞中抗氧劑BHT未向BTXA中發(fā)生遷移。

綜上所述，本研究建立的HPLC法具有操作簡單、方法準(zhǔn)確可靠且分析成本較低的優(yōu)點(diǎn)，可用于BTXA與藥用鹵化丁基膠塞相容性研究的常規(guī)分析與質(zhì)量評價。