雞屎藤苷酸對(duì)肝癌HepG2細(xì)胞炎癥因子水平、生長(zhǎng)、凋亡、侵襲和血管生成的影響*

杜國(guó)明 ，吳濤 ，盧文士 ，劉作民 ，王貞儀

（1.鶴壁市人民醫(yī)院普外科，鶴壁 458030；2.新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院普外科，衛(wèi)輝 453100）

肝癌（HCC）是世界范圍內(nèi)常見(jiàn)的侵襲型惡性腫瘤，也是癌癥相關(guān)死亡的第二大主要原因，具有復(fù)發(fā)高、轉(zhuǎn)移快的特點(diǎn)。早期肝癌患者的5年生存率可達(dá)60%～80%[1]，但不幸的是，大多數(shù)患者在確診時(shí)已處于晚期，導(dǎo)致肝癌的病死率高，預(yù)后效果差，5年生存率甚至不到20%[2]。傳統(tǒng)化學(xué)治療、放射治療在一定程度上改善患者的臨床預(yù)后，但其不良反應(yīng)不容忽視。因此，尋求安全有效的藥物對(duì)提高預(yù)后效果，改善患者生存質(zhì)量具有重要意義。

雞屎藤又名雞矢藤，具有疏肝和胃、活血止痛的功效。研究發(fā)現(xiàn)，雞屎藤顆?？梢砸种芓GF-β1/Smad7途徑，抑制大鼠的肝纖維化[3]。一般認(rèn)為，其環(huán)烯醚萜苷類(lèi)為主要活性成分，包括雞屎藤苷酸[4]。雞屎藤苷酸具有鎮(zhèn)痛、抗炎、抗驚厥[5]、抗腫瘤[6]等藥理活性。雞屎藤抑制的TGF-β1/Smad7途徑是某些抗肝癌進(jìn)展和轉(zhuǎn)移藥的靶標(biāo)[7]，而且同時(shí)可能用于癌痛[8]，是有希望的抗肝癌前藥，但雞屎藤苷酸對(duì)肝癌的作用未見(jiàn)報(bào)道。本研究旨在體外實(shí)驗(yàn)探討雞屎藤苷酸對(duì)肝癌細(xì)胞HepG2炎癥因子水平、生長(zhǎng)、凋亡、侵襲和血管生成的影響，從腫瘤侵襲遷移的角度對(duì)肝癌的治療及預(yù)后提供實(shí)驗(yàn)參考。

1 材料

1.1 細(xì)胞 人肝正常細(xì)胞系LO2、人肝癌細(xì)胞系SMC-7721、BEL7402、HepG2、 臍 靜 脈 內(nèi) 皮 細(xì) 胞HUVEC均購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞庫(kù)。

1.2 試劑 雞屎藤苷酸（paederosidic acid，PA，分子量：464.44，純度≥98%），成都普菲德科技有限公司；鹽酸厄洛替尼（Erlotinib hydrochloride，純度≥98%），美國(guó)Sigma-Aldrich公司。1%青-鏈霉素溶液、10%胎牛血清、DMEM培養(yǎng)基，美國(guó)Gibco公司；Annexin V-FITC/PI細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒，北京索萊寶科技有限公司；人γ干擾素（IFN-γ）試劑盒、白細(xì)胞介素-6（IL-6）試劑盒、白細(xì)胞介素-10（IL-10）試劑盒，上海江萊生物科技有限公司；B細(xì)胞淋巴 2（Bcl2）、Bcl2 相關(guān) X（Bax）、裂解型含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶（Cleaved Caspase-3）、含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶3（Caspase-3）、波形蛋白（Vimentin）、纖維黏連蛋白（FN）、E-鈣黏蛋白（E-cad）、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）等相關(guān)抗體，美國(guó)Thermo Fisher公司。

1.3 儀器 MR-96A酶標(biāo)儀，深圳邁瑞生物醫(yī)療電子股份有限公司；FACS Calibur流式細(xì)胞儀，美國(guó)BD公司；JC-CHP-80S CO2培養(yǎng)箱，青島聚創(chuàng)環(huán)保集團(tuán)有限公司；Transwell小室，美國(guó)康寧公司；CR22N21N高速冷凍離心機(jī)，日本日立Himac公司；ZF-288全自動(dòng)凝膠成像儀，上海金鵬分析儀器有限公司。

2 方法

2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 將凍存的細(xì)胞水浴融化后，接種于含有1%青-鏈霉素溶液、10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中，在37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每48 h更換培養(yǎng)基，待細(xì)胞鋪滿(mǎn)瓶底達(dá)80%以上，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。HUVEC細(xì)胞培養(yǎng)條件相同。

2.2 CCK8法檢測(cè)細(xì)胞活力 稀釋細(xì)胞密度為1×104個(gè)/mL，接種至 96 孔板，每孔 100 μL。24 h 后分別更換為100 μL含有不同濃度的雞屎藤苷酸溶液（0、1.25、2.5、5、10、20、40、160 和 320 μg/mL）的培養(yǎng)基，每濃度組設(shè)置6個(gè)復(fù)孔，培養(yǎng)24或48 h后，加入10 μL的CCK8試劑，1 h后，在酶標(biāo)儀450 nm波長(zhǎng)處讀取吸光度值OD，計(jì)算細(xì)胞的相對(duì)活力，篩選合適劑量。

2.3 流式檢測(cè)細(xì)胞凋亡 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的肝癌細(xì)胞HepG2，消化、稀釋后，加入2.2篩選的合適劑量的雞屎藤苷酸溶液（20 μg/mL 和 40 μg/mL），每組設(shè)置6個(gè)復(fù)孔厄洛替尼（0.86 ng/mL）作為陽(yáng)性對(duì)照，培養(yǎng)48 h后，用PBS溶液洗滌，胰酶消化使細(xì)胞懸浮，培養(yǎng)基終止消化，800 rpm/min離心5 min，離心半徑為13.5 cm，棄上清后，用1×Binding Buffer緩沖液稀釋成1×107個(gè)/mL的細(xì)胞懸液，取100 μL細(xì)胞懸液，按照試劑盒說(shuō)明，將5μL標(biāo)記FITC的AnnexinV與5 μL PI染液混勻，避光孵育10 min后，洗去染色液，用流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)。

2.4 ELISA檢測(cè)相關(guān)炎癥因子的含量 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的肝癌細(xì)胞HepG2，消化、稀釋后，加入合適劑量的雞屎藤苷酸溶液，每組設(shè)置6個(gè)復(fù)孔，培養(yǎng)48 h后，將細(xì)胞懸浮于磷酸鹽緩沖溶液（PBS）中，反復(fù)凍融破壞細(xì)胞膜，離心收集上清，分別按照IFN-γ、IL-6、IL-10試劑盒說(shuō)明進(jìn)行操作。在波長(zhǎng)為450 nm處檢測(cè)各組吸光度，計(jì)算IFN-γ、IL-6、IL-10含量。

2.5 Western blot 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的肝癌細(xì)胞HepG2，消化、稀釋后，加入合適劑量的雞屎藤苷酸溶液，每組設(shè)置6個(gè)復(fù)孔，培養(yǎng)48 h后。用PBS溶液洗滌，加入裂解試劑收集裂解液，離心15 min，用BCA試劑盒測(cè)定總蛋白濃度，10%SDS-PAGE膠分離蛋白后轉(zhuǎn)膜，用5%脫脂牛奶室溫孵育封閉蛋白2h。分別加入 Bax、Bcl2、Cleaved Caspase-3、Caspase-3、IL-6、IL-10、E-cad、Vimentin、FN 以及 VEGF 等的相應(yīng)一抗，孵育完成后，室溫下，用1×TBST緩沖液清洗PVDF膜10 min，重復(fù)3次，二抗室溫孵育2 h，1×TBST再洗3次，將PVDF膜正面向上置于潔凈的玻璃板上，加入ECL工作液顯色。將玻璃置于全自動(dòng)凝膠成像分析儀中進(jìn)行曝光，統(tǒng)計(jì)灰度值并計(jì)算蛋白表達(dá)量。

2.6 Transwell檢測(cè)細(xì)胞侵襲 將Matrigel膠用PBS稀釋后，包被于Transwell小室底膜的上室面，在下室加入800 μL含10%血清的培養(yǎng)基，取不同濃度藥液處理肝癌細(xì)胞HepG2，調(diào)整密度為1×105，接種100 μL于上室，放入培養(yǎng)箱中24 h后，取出侵襲小室，用PBS沖洗培養(yǎng)基，將小室內(nèi)層未穿過(guò)的細(xì)胞用濕潤(rùn)的棉簽擦除。用預(yù)冷的4%多聚甲醛固定處理后，進(jìn)行0.1%結(jié)晶紫溶液染色及顯微鏡觀察。

2.7 內(nèi)皮細(xì)胞成管實(shí)驗(yàn)檢測(cè)腫瘤小管的形成 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的肝癌細(xì)胞HepG2，消化、稀釋后，根據(jù)分組加入合適劑量的雞屎藤苷酸或厄洛替尼溶液，培養(yǎng)48 h后，收集培養(yǎng)基，用于配制細(xì)胞密度為5×103個(gè)/mL的HUVEC細(xì)胞懸液，取0.5 mL HUVEC懸液接種于鋪設(shè)基質(zhì)膠的48孔板，12 h后，采用普通光學(xué)顯微鏡進(jìn)行管樣結(jié)構(gòu)觀察和拍攝，并用圖像分析軟件IPP 6.1統(tǒng)計(jì)分析[9]。

2.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 21.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，選擇單因素方差分析One-Way ANOVA，數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 雞屎藤苷酸對(duì)肝癌細(xì)胞活力的影響 雞屎藤苷酸處理24 h，對(duì)肝正常細(xì)胞系LO-2影響較小，對(duì)肝癌細(xì)胞系SMC-7721，HepG2和BEL7402有不同程度的活力抑制，以HepG2最敏感（P<0.05，圖1）。不同時(shí)間對(duì)雞屎藤酸苷處理對(duì)其藥效影響較小，當(dāng)溶液濃度小于20 μg/mL時(shí)，雞屎藤苷酸對(duì)肝癌細(xì)胞活力的抑制作用較小，不具有明顯差異。當(dāng)濃度大于40 μg/mL時(shí)，雞屎藤苷酸對(duì)肝癌細(xì)胞活力的抑制作用明顯（P<0.05，圖1），且呈劑量依賴(lài)性抑制。實(shí)驗(yàn)提示，雞屎藤苷酸抑制肝癌細(xì)胞HepG2生長(zhǎng)。選擇空白對(duì)照、20 μg/mL、40 μg/mL 雞屎藤苷酸劑量及陽(yáng)性對(duì)照厄洛替尼（0.86 ng/mL），進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

圖1 不同濃度雞屎藤苷酸對(duì)肝癌細(xì)胞系活力的影響

3.2 雞屎藤苷酸對(duì)肝癌細(xì)胞凋亡的影響 與雞屎藤苷酸0 μg/mL的對(duì)照組相比，20 μg/mL組凋亡細(xì)胞數(shù)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但40 μg/mL組的細(xì)胞凋亡率顯著升高（P<0.05，圖 2Ⅰ-Ⅱ），40 μg/mL 組 Bax/Bcl-2和Cleaved Caspase-3/Caspase-3也升高（P<0.05，圖2Ⅲ-Ⅴ）。實(shí)驗(yàn)提示雞屎藤苷酸促進(jìn)肝癌細(xì)胞HepG2凋亡。

圖2 雞屎藤苷酸對(duì)肝癌細(xì)胞HepG2凋亡的影響

3.3 雞屎藤苷酸對(duì)肝癌細(xì)胞侵襲的影響 與空白對(duì)照組相比，20 μg/mL組侵襲細(xì)胞數(shù)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，染色細(xì)胞數(shù)目減少，40 μg/mL組侵襲細(xì)胞的數(shù)量明顯減少（P<0.05，圖3），實(shí)驗(yàn)提示雞屎藤苷酸抑制肝癌細(xì)胞的侵襲。

圖3 雞屎藤苷酸對(duì)肝癌細(xì)胞侵襲的影響

3.4 雞屎藤苷酸對(duì)肝癌血管形成的影響 與空白對(duì)照組相比，20 μg/mL組VEGF表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，40 μg/mL組HepG2 VEGF的表達(dá)明顯下調(diào)（P<0.05，圖 4I）。小管形成實(shí)驗(yàn)表明，20 μg/mL組與空白對(duì)照組差異不明顯，40 μg/mL組小管形成數(shù)明顯減少，管腔不完整（P<0.05，圖4Ⅰ-Ⅱ），實(shí)驗(yàn)提示雞屎藤苷酸下調(diào)肝癌細(xì)胞HepG2血管內(nèi)皮因子的表達(dá)并抑制腫瘤血管的形成。

圖4 雞屎藤苷酸對(duì)小管形成的影響

3.5 雞屎藤苷酸對(duì)肝癌細(xì)胞炎癥因子含量的影響 與空白對(duì)照組相比，20 μg/mL組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，40 μg/mL 組 IFN-γ、IL-6的含量明顯下降，IL-10的含量明顯升高（P<0.05，圖5），實(shí)驗(yàn)提示雞屎藤苷酸抑制促炎因子合成、促進(jìn)抗炎因子釋放，緩解炎癥的程度。

圖5 雞屎藤苷酸對(duì)肝癌細(xì)胞炎癥因子含量的影響

3.6 雞屎藤苷酸對(duì)肝癌細(xì)胞炎癥因子表達(dá)的影響 與空白對(duì)照組相比，20 μg/mL組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，40 μg/mL組IL-6的表達(dá)明顯下調(diào)，IL-10的表達(dá)明顯上調(diào)（P<0.05，圖6），實(shí)驗(yàn)提示雞屎藤苷酸調(diào)節(jié)肝癌細(xì)胞內(nèi)炎癥因子表達(dá)，減少了炎癥反應(yīng)與細(xì)胞免疫反應(yīng)，緩解肝癌的發(fā)生發(fā)展，與3.5的結(jié)果吻合。

圖6 雞屎藤苷酸對(duì)肝癌細(xì)胞炎癥因子表達(dá)的影響

3.7 雞屎藤苷酸對(duì)肝癌細(xì)胞侵襲相關(guān)蛋白表達(dá)的影響 與空白對(duì)照組相比，20 μg/mL組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，40 μg/mL 組波形蛋白（Vimentin）、纖維粘連蛋白（FN）的表達(dá)明顯下調(diào)，E-鈣黏蛋白（E-cad）的表達(dá)明顯上調(diào)（t=19.107、12.544、7.703，P<0.05，圖 7），實(shí)驗(yàn)提示雞屎藤苷酸抑制肝癌細(xì)胞的侵襲，與3.3的結(jié)果吻合。

圖7 雞屎藤苷酸對(duì)肝癌細(xì)胞侵襲相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

4 討論

肝癌是常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，對(duì)于肝癌的預(yù)防及治療仍是世界面臨的巨大挑戰(zhàn)，其發(fā)生發(fā)展與復(fù)雜的機(jī)制相關(guān)。大量研究表明，持續(xù)的炎癥是促進(jìn)和加重惡性腫瘤程度的重要原因[10]。

肝癌是典型的炎癥驅(qū)動(dòng)型腫瘤，在早期炎癥激活纖維化，最終導(dǎo)致肝硬化和肝癌的發(fā)生；在腫瘤階段，肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞死亡和由此引起的炎癥級(jí)聯(lián)激活的傷口愈合反應(yīng)持續(xù)存在[10]。因此，抗炎尤其是腫瘤微環(huán)境的炎癥，對(duì)于肝癌的治療來(lái)說(shuō)，可能有特別重要的意義。白細(xì)胞介素-6（IL-6）、人γ干擾素（IFN-γ）等促炎因子積極參與和調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞的發(fā)生發(fā)展[11]，白細(xì)胞介素-4（IL-4）、白細(xì)胞介素-10（IL-10）等抗炎因子，具有免疫抑制作用，緩解炎癥的發(fā)生，從而減少腫瘤的發(fā)生和轉(zhuǎn)移。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，IFN-γ、IL-6的含量明顯下降，IL-10的含量明顯升高，提示雞屎藤苷酸抑制促炎因子合成、促進(jìn)抗炎因子釋放，緩解炎癥的程度。

細(xì)胞凋亡（apoptosis）是指為維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定，細(xì)胞進(jìn)行有序的自主死亡。但當(dāng)細(xì)胞的凋亡機(jī)制受到抑制，不能進(jìn)行正常的細(xì)胞死亡清除時(shí)，導(dǎo)致癌變的發(fā)生。因此，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的凋亡，能夠有效抑制惡性轉(zhuǎn)化，緩解癌癥的進(jìn)程。比如，Liu等[12]的研究顯示，苦豆堿通過(guò)PI3K/Akt信號(hào)通路誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞凋亡和G2/M細(xì)胞周期阻滯，具有抗腫瘤潛力；Chen等[13]的研究表明，氟西汀通過(guò)誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡，發(fā)揮抗腫瘤作用。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，細(xì)胞凋亡率顯著升高，Bax/Bcl-2與Cleaved Caspase-3/Caspase-3升高，與上述研究一致，實(shí)驗(yàn)提示，雞屎藤苷酸促進(jìn)肝癌細(xì)胞HepG2凋亡。

纖維粘連蛋白（FN）是細(xì)胞外基質(zhì)中重要的細(xì)胞黏附分子，而腫瘤細(xì)胞黏附能力的改變被視作腫瘤細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移的起始[14]。此外，上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）是調(diào)控腫瘤細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移的機(jī)制之一，上皮標(biāo)志物E-鈣黏蛋白（E-cad）的減少和間質(zhì)標(biāo)志物波形蛋白（Vimentin）、N-鈣黏蛋白（N-Cad）、α-平滑肌肌動(dòng)蛋白（α-SMA）等的增加，使細(xì)胞緊密連接、極性丟失和間充質(zhì)細(xì)胞形態(tài)轉(zhuǎn)變，導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞粘附作用減弱而運(yùn)動(dòng)能力增強(qiáng)，從而獲得更強(qiáng)的遷移和侵襲能力[15]。因此，芍藥苷[16]在增加E-cad表達(dá)后，對(duì)HepG2生長(zhǎng)有抑制作用，能顯著降低肝癌細(xì)胞株的侵襲、轉(zhuǎn)移和黏附。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，侵襲細(xì)胞的數(shù)量明顯減少，波形蛋白（Vimentin）、纖維粘連蛋白（FN）的表達(dá)明顯下調(diào)，E-鈣黏蛋白（E-cad）的表達(dá)明顯上調(diào)，與上述研究一致，實(shí)驗(yàn)提示雞屎藤苷酸抑制肝癌細(xì)胞的侵襲與轉(zhuǎn)移。

肝癌是高度血管化的惡性疾病，血管生成對(duì)癌細(xì)胞的生長(zhǎng)、侵襲、轉(zhuǎn)移等至關(guān)重要[17]。其中，血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）是調(diào)節(jié)腫瘤血管生成的重要調(diào)控因素，據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，VEGF在肝癌組織和細(xì)胞內(nèi)呈現(xiàn)異常表達(dá)[18-19]。因此，抑制VEGF的表達(dá)是緩解腫瘤的發(fā)生發(fā)展的重要思路。本實(shí)驗(yàn)檢測(cè)了小管形成，以反映HepG2細(xì)胞分泌細(xì)胞因子對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞血管形成能力的促進(jìn)。結(jié)果顯示：雞屎藤苷酸處理導(dǎo)致VEGF表達(dá)下調(diào)，處理后的培養(yǎng)液使小管形成數(shù)明顯減少，與上述研究一致。提示雞屎藤苷酸通過(guò)降低VEGF表達(dá)，減少腫瘤血管生成，抑制肝癌細(xì)胞生長(zhǎng)、侵襲、轉(zhuǎn)移，具有良好的抗腫瘤潛力。

在肝癌中，炎癥、血管內(nèi)皮細(xì)胞紊亂、細(xì)胞外基質(zhì)和腫瘤微環(huán)境的改變等上述機(jī)制相互促進(jìn)，共同導(dǎo)致腫瘤的進(jìn)展[20]。雞屎藤苷酸對(duì)肝纖維化的TGF-β抑制機(jī)制[3]，被報(bào)道是某些抗肝癌藥物的靶標(biāo)[7]，發(fā)現(xiàn)其在雞屎藤酸苷處理的HepG2中也被抑制。同時(shí)雞屎藤苷酸可以直接導(dǎo)致HepG2細(xì)胞的凋亡，也能抑制腫瘤的管形成，降低炎癥因子水平，并調(diào)控侵襲相關(guān)蛋白以抑制侵襲。因此，雞屎藤苷酸抗肝癌作用可能是多方面的。

綜上，雞屎藤苷酸調(diào)節(jié)炎癥因子水平，抑制肝癌細(xì)胞HepG2生長(zhǎng)、侵襲、血管形成并促進(jìn)其凋亡，緩解腫瘤的發(fā)生發(fā)展，具有治療肝癌的潛力及深入研究的意義。