NSGA-II 遺傳算法結(jié)合響應(yīng)面法優(yōu)化樺褐孔菌活性成分提取工藝

云浩程，于繁華，程 杜，劉 震，牛華周，侯萬(wàn)超，李賽男, ，劉春明, ，張語(yǔ)遲

（1.長(zhǎng)春師范大學(xué)中心實(shí)驗(yàn)室，吉林長(zhǎng)春 130032；2.長(zhǎng)春師范大學(xué)計(jì)算機(jī)科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，吉林長(zhǎng)春 130032）

樺褐孔菌（），又名白樺茸、黑樺菌、樺菌等，屬于真菌門、擔(dān)子菌亞門、層菌綱、非褐菌目、多孔菌科、褐臥孔菌屬，主要分布在北緯40～50°地區(qū)，在預(yù)防和治療癌癥、心臟病、胃病和食道病等方面起到獨(dú)到效用且無任何毒副作用，因此引起科研工作者的關(guān)注，目前國(guó)內(nèi)外對(duì)于樺褐孔菌的研究主要集中在其多糖類成分，而對(duì)其中三萜類和黃酮類有效成分提取研究較少。三萜、黃酮類化合物具有顯著的生物活性，三萜類化合物具有調(diào)節(jié)血壓、降低膽固醇、抑制病毒增殖等作用；黃酮類化合物在抗氧化、防治心腦血管疾病、增強(qiáng)免疫力等方面具有明顯作用。

樺褐孔菌活性成分的傳統(tǒng)提取工藝主要有回流提取法、微波提取法、沉淀吸附法等，但以上方法存在得率較低、耗時(shí)耗能的不足，而酶解法提取效率高、無污染；超聲提取法在液體介質(zhì)中具有良好穿透性，可以產(chǎn)生擴(kuò)散擊碎，增強(qiáng)溶劑滲透力等作用，提高得率縮短時(shí)間、同時(shí)避免了高溫對(duì)有效成分生物活性的影響，因此本文選取超聲輔助酶法對(duì)樺褐孔菌中總?cè)?、黃酮進(jìn)行提取。

目前在樺褐孔菌三萜類和黃酮類成分提取工藝的相關(guān)研究主要是針對(duì)其單一類成分進(jìn)行提取，通常采用正交試驗(yàn)或響應(yīng)面法設(shè)計(jì)優(yōu)選提取工藝，以上方法雖能快速地篩選出既定范圍內(nèi)最優(yōu)工藝，但卻只能在有代表性的因素水平點(diǎn)組合進(jìn)行試驗(yàn)，存在局部?jī)?yōu)化精確度低，只能優(yōu)化單一目標(biāo)提取工藝的缺點(diǎn)。NSGA-II 多目標(biāo)遺傳算法是目前被公認(rèn)較為先進(jìn)的多目標(biāo)進(jìn)化優(yōu)化算法，通過引入快速非支配排序的精英策略，使它具有強(qiáng)大的全局搜索能力能更有效地求得模型全局最優(yōu)解，因此本研究采用NSGAII 遺傳算法結(jié)合響應(yīng)面對(duì)樺褐孔菌的提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，彌補(bǔ)了響應(yīng)面法只能分別對(duì)單一目標(biāo)最優(yōu)提取方案進(jìn)行預(yù)測(cè)的不足，達(dá)到同時(shí)提高食品中多種有效成分得率、降低研究成本的目的。

本文以樺褐孔菌為研究對(duì)象，采用超聲輔助酶法提取樺褐孔菌中的三萜、黃酮類化合物，在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上采用NSGA-II 多目標(biāo)遺傳算法結(jié)合響應(yīng)面優(yōu)選最佳提取工藝，從而為后續(xù)有效成分活性研究、分離純化以及功能評(píng)價(jià)奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

樺褐孔菌菌塊 吉林省晏達(dá)順參業(yè)有限公司，經(jīng)鑒定為樺褐孔菌（Fr.） Pila 的子實(shí)體；實(shí)驗(yàn)用水為超純水 美國(guó)Millipore 公司；香草醛 天津市福晨化學(xué)試劑廠；纖維素酶（50 U/mg）江蘇銳陽(yáng)生物科技有限公司；蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品 純度大于98%，成都普菲德生物技術(shù)有限公司；齊墩果酸標(biāo)準(zhǔn)品 純度大于98%，Sigma 公司；甲醇 色譜純，美國(guó)Thermo Fisher 公司；冰乙酸、高氯酸、亞硝酸鈉、硝酸鋁、氫氧化鈉 分析純，天津市鑫鉑特化工有限公司。

UPLC-Q-Extractive 超高效液相色譜-高分辨質(zhì)譜聯(lián)用儀 美國(guó)Thermo Scientific 公司；Waters 2695 高效液相色譜儀 美國(guó)Waters 公司；Evaluation 600 型紫外-可見分光光度儀 美國(guó)Thermo-Scientific 公司；KQ250E 型超聲波清洗機(jī) 昆山市超聲儀器有限公司；Satorius-BSA2202S 分析天平 德國(guó)Satorius 公司；DK-98-II 型恒溫水浴鍋 天津市泰斯特儀器有限公司；GZX-9030MBE 電熱鼓風(fēng)干燥箱上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；FW177 中草藥粉碎機(jī) 天津市泰斯特儀器有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 樺褐孔菌總?cè)?、黃酮的提取工藝 將樺褐孔菌菌塊放置干燥箱內(nèi)65 ℃干燥至恒重后取500 g粉碎機(jī)粉碎，過40 目篩得到粗粉，稱取樺褐孔菌粗粉1.0 g，置于干燥錐形瓶中，加入20 倍的75%乙醇和占原材料質(zhì)量1%的纖維素酶，酶解時(shí)間為60 min，酶解后在90 ℃溫度下水浴10 min 使酶被滅活，再超聲提取20 min（超聲功率400 W、超聲溫度24 ℃），經(jīng)過減壓過濾后，收集濾液。

1.2.2 樺褐孔菌總?cè)啤ⅫS酮的測(cè)定

1.2.2.1 對(duì)照品溶液的配制 分別稱取齊墩果酸、蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品20.0 mg 置于100 mL 的容量瓶中，分別加入甲醇和75%乙醇超聲溶解，稀釋至刻度搖勻，即為質(zhì)量濃度200 μg/mL 的齊墩果酸、蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品溶液。

1.2.2.2 樣品測(cè)定及得率計(jì)算 利用香草醛-冰醋酸顯色法和硝酸鋁顯色法分別在550、504 nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度，將所得吸光度值分別代入齊墩果酸和蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程，求得溶液中的總?cè)啤ⅫS酮質(zhì)量濃度，并且按照下述公式計(jì)算出總?cè)?、黃酮含量。

式中：W（%）表示總?cè)?、黃酮得率；c 表示通過吸光度值計(jì)算出的溶液質(zhì)量濃度，μg/mL；D 表示溶液稀釋倍數(shù)；V 表示供試品溶液體積，mL；m 表示藥材取樣量，g。

1.2.3 單因素實(shí)驗(yàn) 每組實(shí)驗(yàn)均稱取1.0 g 樺褐孔菌粉末，根據(jù)1.2.1 工藝提取樺褐孔菌中總?cè)?、黃酮進(jìn)行單因素實(shí)驗(yàn)，考察各因素變量對(duì)樺褐孔菌中總?cè)啤ⅫS酮得率的影響，條件為：固定乙醇濃度為75%，液料比20 mL/g，酶解時(shí)間60 min，超聲提取時(shí)間20 min，考察不同酶添加量（纖維素酶占原材料質(zhì)量比例）0.5%、1%、1.5%、2%、2.5%對(duì)總?cè)?、黃酮得率的影響；固定乙醇濃度75%，液料比20 mL/g，酶添加量1%，超聲提取時(shí)間20 min，考察不同酶解時(shí)間30、45、60、75、90 min 對(duì)總?cè)啤ⅫS酮得率的影響；固定乙醇濃度75%，酶添加量1%，酶解時(shí)間60 min，超聲提取時(shí)間20 min，考察不同液料比15、20、25、30、35 mL/g，對(duì)總?cè)?、黃酮得率的影響；固定液料比20 mL/g，酶解時(shí)間60 min，酶添加量1%，超聲提取時(shí)間20 min，考察不同乙醇濃度45%、55%、65%、75%、85%對(duì)總?cè)?、黃酮得率的影響。

1.2.4 響應(yīng)面因素水平設(shè)計(jì)與試驗(yàn)方法 根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，分別以酶添加量（A）、酶解時(shí)間（B）、液料比（C）、乙醇濃度（D）為考察因素，以樺褐孔菌總?cè)?、黃酮得率為考察指標(biāo)，稱取樺褐孔菌藥材粉末1.0 g，共29 份，按照 Box-Behnken 試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案進(jìn)行提取，全部試驗(yàn)總計(jì)29 組，其中中心點(diǎn)設(shè)置為5 組重復(fù)實(shí)驗(yàn)，用以估計(jì)實(shí)驗(yàn)誤差，其因素水平分析選取見表1。

表1 響應(yīng)面試驗(yàn)因素水平設(shè)計(jì)Table 1 Response surface test factor level design

1.2.5 NSGA-II 算法實(shí)現(xiàn)步驟 運(yùn)用R 語(yǔ)言v4.0.2軟件，NSGA-II 算法隨機(jī)產(chǎn)生種群規(guī)模大小為N 的父代種群P，然后父代種群P利用交叉變異產(chǎn)生子代種群Q（Q規(guī)模大小為N），并通過結(jié)合子代Q產(chǎn)生了種群規(guī)模大小為2N 的新種群Z，再對(duì)種群Z進(jìn)行快速非支配排序和擁擠度計(jì)算，依據(jù)個(gè)體之間的非支配關(guān)系和個(gè)體擁擠度的大小，選擇合適的個(gè)體重新結(jié)合并產(chǎn)生新的父代種群P，最后通過傳統(tǒng)的遺傳算法的基本操作再將P與Q混合一起形成新的種群Zi，重復(fù)上述操作，直到滿足結(jié)束條件。NSGA-II 算法的優(yōu)化流程如圖1 所示。

圖1 NSGA-II 算法流程Fig.1 NSGA-II algorithm flow

1.2.6 樺褐孔菌提取物中三萜、黃酮類成分含量檢測(cè)與鑒定

1.2.6.1 三萜、黃酮類成分含量檢測(cè)液相色譜條件C色譜柱（SunFire，250 mm×4.6 mm，Waters），以甲醇（A）和0.1% HPO水溶液（D）作為流動(dòng)相，梯度程 序?yàn)椋?～10 min（10%～30% A），10～15 min（30%～38% A），15～17 min（38% A），17～22 min（38%～42% A），22～40 min（42%～49% A），40～60 min（49%～80% A），60～90 min（80%～100% A）；流速0.4 mL/min；進(jìn)樣體積為10.0 μL；檢測(cè)波長(zhǎng)：320 nm；柱溫：30 ℃；測(cè)定樣品：樺褐孔菌提取物。

1.2.6.2 三萜、黃酮類成分液-質(zhì)聯(lián)用（UPLC-MS/MS）鑒定條件 UPLC 選擇二元線性梯度洗脫：流動(dòng)相為甲醇（A）和0.1%甲酸水溶液（D），流動(dòng)相梯度程序：0～10 min（10%～20% A），10～15 min（20%～25% A），15～28 min（25%～36% A），28～43 min（36%～60%A），43～70 min（60%～85% A），70～90 min（85%～90%A）；流速：0.3 mL/min；樣品進(jìn)樣量：5 μL；檢測(cè)波長(zhǎng)：320 nm；柱溫：30 ℃。液相色譜光電二級(jí)陣列管檢測(cè)器通過三通閥和質(zhì)譜相連接，離子源：電噴霧離子源（ESI）；分析模式：正離子模式；掃描范圍m/z：150～2000；離子阱條件：離子源噴霧電壓4.5 kV，鞘氣輔助氣為氮?dú)?，流速?0 L/min；金屬毛細(xì)管溫度350 ℃，金屬毛細(xì)管電壓3.5 V；測(cè)定樣品：樺褐孔菌提取物。

1.3 數(shù)據(jù)處理

應(yīng)用Design-Expert.V8.0.6.1 軟件進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)、方差分析以及二次模型建立，利用R 語(yǔ)言v4.0.2 搭建NSGA-II 模型，作圖采用Origin7.5、Visio Professional 2019 軟件。多目標(biāo)優(yōu)化問題是由多個(gè)目標(biāo)函數(shù)組成，多目標(biāo)優(yōu)化問題可以表述如下：

其中Ω 是決策空間，F(xiàn): Ω→ R由k 個(gè)實(shí)值目標(biāo)函數(shù)組成，R被稱為目標(biāo)空間?？蓪?shí)現(xiàn)的目標(biāo)集被定義為集合{ F(x) ∈ Ω}，同時(shí)NSGA-II 算法引入精英策略，防止在算法運(yùn)行過程中優(yōu)秀的Pareto 解流失，通過將父代種群與其產(chǎn)生的子代種群混合后進(jìn)行非支配排序、擁擠度計(jì)算得出下一代種群個(gè)體，便能夠更好避免父代種群中優(yōu)秀個(gè)體流失。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果

如圖2 所示得到酶添加量與總?cè)?、黃酮得率的關(guān)系：得率隨著酶添加量增加呈現(xiàn)先升高后下降的趨勢(shì)，呈現(xiàn)先升高趨勢(shì)原因是植物組織在纖維素酶的作用下逐漸水解，有利于三萜、黃酮類化合物的釋放，從而提高得率，在酶添加量為原料質(zhì)量的2%時(shí)達(dá)到峰值，得率下降是因?yàn)槊傅暮砍掷m(xù)增加導(dǎo)致底物分解，底物濃度相對(duì)較低，酶與底物觸面積減少，并且和底物結(jié)構(gòu)相同的分子與酶的活性中心結(jié)合產(chǎn)生了對(duì)酶的抑制作用，導(dǎo)致得率降低，經(jīng)檢驗(yàn)酶添加量對(duì)總?cè)?、黃酮得率影響極顯著（＜0.01）。

圖2 酶添加量對(duì)總?cè)?、黃酮得率的影響Fig.2 Effect of enzyme addition on the extraction rate of total triterpenes and flavonoids

如圖3 所示得到酶解時(shí)間與總?cè)?、黃酮得率的關(guān)系：在酶解時(shí)間為30～45 min 得率呈升高趨勢(shì)，時(shí)間為45 min 時(shí)得率有顯著的提高（＜0.05），而在45～90 min 之間，隨著酶解反應(yīng)的進(jìn)行過長(zhǎng)的反應(yīng)時(shí)間會(huì)導(dǎo)致溶液三萜、黃酮類化合物發(fā)生降解，致使得率逐漸降低，因此酶解時(shí)間應(yīng)控制在45 min 左右較為適宜。經(jīng)檢驗(yàn)酶解時(shí)間對(duì)總?cè)频寐视绊戯@著（＜0.05），對(duì)總黃酮得率極顯著（＜0.01）。

圖3 酶解時(shí)間對(duì)總?cè)?、黃酮得率的影響Fig.3 Effect of enzymatic digestion time on the extraction rate of total triterpenes and flavonoids

如圖4 所示得到液料比與總?cè)啤ⅫS酮得率的關(guān)系：當(dāng)液料比為20 mL/g 時(shí)總?cè)?、黃酮得率達(dá)到峰值，繼續(xù)增加提取劑，提取率呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，此現(xiàn)象產(chǎn)生的原因是，起初溶質(zhì)和溶劑的接觸面積隨著液料比的增加，提高了有效成分的擴(kuò)散速度，更有利于樺褐孔菌中有效成分的提?。坏崛┻^多時(shí)，原料中其他物質(zhì)也大量溶解在提取劑中，由于液體量增多，濃縮時(shí)間增長(zhǎng)，損失量增多，導(dǎo)致樺褐孔菌黃酮類化合物得率降低。因此提取工藝的液料比應(yīng)控制在20 mL/g 左右。經(jīng)檢驗(yàn)液料比對(duì)總?cè)啤ⅫS酮提取率影響極顯著（＜0.01）。

圖4 液料比對(duì)總?cè)?、黃酮得率的影響Fig.4 Effect of liquid to material ratio on the extraction rate of total triterpenes and flavonoids

如圖5 所示得到乙醇濃度與總?cè)?、黃酮得率的關(guān)系：當(dāng)乙醇濃度為45%～65%之間，得率隨著乙醇濃度增加逐漸增大，其原因是增大乙醇濃度可以促使細(xì)胞溶脹，有利于提取劑向細(xì)胞內(nèi)部的滲透，從而提高了總?cè)?、黃酮的得率，乙醇濃度達(dá)到65%時(shí)得率達(dá)到峰值并與前后水平呈現(xiàn)極顯著（＜0.01）差異，之后隨乙醇濃度的升高得率降低，推測(cè)與提取物化學(xué)極性大小有關(guān)，當(dāng)提取溶劑極性較小時(shí)，提取出更多的雜質(zhì)，導(dǎo)致提取物占比減少，因此最佳乙醇濃度為65%左右，經(jīng)檢驗(yàn)乙醇濃度對(duì)總?cè)?、黃酮得率影響極顯著（＜0.01）。

圖5 乙醇濃度對(duì)總?cè)?、黃酮得率的影響Fig.5 Effect of ethanol concentration on the extraction rate of total triterpenes and flavonoids

2.2 響應(yīng)面法優(yōu)化樺褐孔菌中總?cè)?、黃酮的提取工藝

2.2.1 響應(yīng)面回歸模型的建立 利用Design-Expert.V8.0.6.1 軟件對(duì)上述各影響因素設(shè)計(jì)Box-Benhnken試驗(yàn)，按照響應(yīng)面試驗(yàn)因素水平設(shè)計(jì)，共設(shè)計(jì)29 個(gè)試驗(yàn)點(diǎn)，以樺褐孔菌總?cè)?、黃酮得率為響應(yīng)值，其中Y為總?cè)频寐剩琘為總黃酮得率，設(shè)計(jì)方案及實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表2。

表2 響應(yīng)面設(shè)計(jì)試驗(yàn)方案及結(jié)果Table 2 Response surface design test protocol and results

利用 Design-Expert.V8.0.6.1 軟件對(duì)表2 數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸擬合，分別得到以樺褐孔菌總?cè)疲╕）、黃酮得率（Y）為目標(biāo)函數(shù)的二次多項(xiàng)回歸方程：

2.2.2 響應(yīng)面回歸模型顯著性檢驗(yàn)及分析 由Analysis模塊下挑選ANOVA 解析，獲得如表3、表4 所示多元回歸模型方差分析表，在總?cè)?、黃酮響應(yīng)面多元回歸模型方差分析中，總?cè)颇Ｐ?23.20，＜0.0001、總黃酮模型=32.43，＜0.0001，表明以上二次多元回歸模型均是極顯著的（＜0.01）；總?cè)颇Ｐ褪M=0.35，=0.9206＞0.05、總黃酮模型失擬=2.62，=0.1829＞0.05，二者失擬項(xiàng)均不顯著（＞0.05），表明所選用的二次多項(xiàng)模型的擬合程度良好；總?cè)啤ⅫS酮模型決定系數(shù)分別為=0.9587、=0.9701 證明回歸方程有較高的可信度，校正決定系數(shù)分別為= 0.9173、=0.9402，說明該模型的擬合程度較好；各因素對(duì)樺褐孔菌總?cè)频寐实挠绊懘笮椋好柑砑恿浚ˋ）＞乙醇濃度（D）＞酶解時(shí)間（B）＞液料比（C），其中A、D 為極顯著因素（＜0.01），交互項(xiàng)中AC 對(duì)總?cè)铺崛∽饔脼闃O顯著（＜0.01）；各因素對(duì)樺褐孔菌總黃酮得率的影響大小為：乙醇濃度（D）＞液料比（C）＞酶添加量（A）＞酶解時(shí)間（B），其中D 為極顯著因素（＜0.01），C 為顯著因素（＜0.05），交互項(xiàng)中AD 對(duì)總黃酮提取作用為顯著（＜0.05）。

表3 總?cè)祈憫?yīng)面多元回歸模型方差分析結(jié)果Table 3 Results of analysis of variance of total triterpene response surface multiple regression model

表4 總黃酮響應(yīng)面多元回歸模型方差分析結(jié)果Table 4 Results of analysis of variance of total flavonoid response surface multiple regression model

2.2.3 響應(yīng)面交互作用分析 利用Analysis 模塊下Model Graphs 選項(xiàng)得到評(píng)價(jià)各因素交互強(qiáng)度的等高線及響應(yīng)曲面圖。等高線的形狀反映出兩因素間交互作用的強(qiáng)弱，圓形表示兩因素交互作用不顯著無促進(jìn)作用，橢圓形表示交互作用顯著存在促進(jìn)作用，表3、表4 方差分析表明總?cè)苹貧w模型交互項(xiàng)AC極顯著（＜0.01），總黃酮回歸模型交互項(xiàng)AD 顯著（＜0.05），與圖6、圖7 中交互項(xiàng)AC 和AD 呈橢圓形的等高線圖相對(duì)應(yīng)。

圖6 酶添加量（A）與液料比（C）對(duì)總?cè)频寐视绊懙捻憫?yīng)面圖和等高線Fig.6 Response surface plots and contours of the effect of enzyme addition and liquid to material ratio on the extraction rate of total triterpenes

圖7 酶添加量（A）與乙醇濃度（D）對(duì)總黃酮得率影響的響應(yīng)面圖和等高線Fig.7 Response surface plots and contours of the effect of enzyme addition and ethanol concentration on the extraction rate of total flavonoids

由圖6 可知固定酶解時(shí)間（B）為45 min，乙醇濃度（D）為65%，總?cè)频牡寐孰S酶添加量（A）和液料比（C）的增大呈現(xiàn)先增后減的趨勢(shì)，酶添加量較低時(shí)，等高線比較平緩，此時(shí)液料比對(duì)總?cè)频奶崛×坑绊懖惶@著，但酶添加量在2%左右時(shí)，等高線排列緊密，液料比對(duì)總?cè)频奶崛×坑酗@著影響，且酶添加量（A）對(duì)應(yīng)的曲面坡度較液料比（C）的陡峭，說明酶添加量對(duì)總?cè)频寐实挠绊懗潭却笥谝毫媳龋–），等高線呈橢圓形表示酶添加量（A）和液料比（C）交互作用顯著，兩因素間存在促進(jìn)作用，與回歸方程中 AC 項(xiàng)方差分析結(jié)果（＜0.01）極顯著相符。

由圖7 可知固定酶解時(shí)間（B）為45 min，液料比（C）為20 mL/g，總黃酮的得率隨酶添加量（A）和乙醇濃度（D）的增大呈現(xiàn)先增后減的趨勢(shì)，乙醇濃度較低時(shí)，等高線比較平緩，此時(shí)酶添加量對(duì)總?cè)频奶崛×坑绊懖惶@著，但乙醇濃度在65%左右時(shí)，等高線排列緊密，酶添加量對(duì)總黃酮的得率有顯著影響，且乙醇濃度對(duì)應(yīng)的曲面坡度較酶添加量的陡峭，說明乙醇濃度（D）對(duì)總黃酮得率的影響程度大于酶添加量（A），等高線呈橢圓形表示酶添加量（A）和乙醇濃度（D）交互作用顯著，兩因素間存在促進(jìn)作用，與回歸方程中AD 項(xiàng)方差分析結(jié)果（＜0.05）顯著相符。根據(jù)響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)結(jié)果，可以清楚的觀察各因素對(duì)總?cè)啤ⅫS酮得率影響，但由于響應(yīng)面只能分別對(duì)單一目標(biāo)最優(yōu)提取方案進(jìn)行預(yù)測(cè)，因此下文2.3 利用NSGA-II 同時(shí)對(duì)Y、Y回歸方程模型進(jìn)行優(yōu)化并預(yù)測(cè)優(yōu)化方案。

2.3 NSGA-II 優(yōu)化模型建立與結(jié)果分析

2.3.1 NSGA-II 優(yōu)化模型建立 采用NSGA-II 算法對(duì)響應(yīng)面回歸方程進(jìn)行優(yōu)化，設(shè)定決策變量為A（酶添加量）、B（酶解時(shí)間）、C（液料比）、D（乙醇濃度），種群規(guī)模為29，迭代次數(shù)為200，目標(biāo)個(gè)體數(shù)為2。根據(jù)真實(shí)實(shí)驗(yàn)產(chǎn)生初始種群，差分進(jìn)化產(chǎn)生子代，再進(jìn)行非支配排序和擁擠距離選擇下一代的父代，最終得到Pareto 最優(yōu)解。建立數(shù)學(xué)模型如下：

2.3.2 NSGA-II 預(yù)測(cè)結(jié)果分析 利用R 語(yǔ)言求解后得到圖8 所示的Pareto 前沿面。

圖8 多目標(biāo)優(yōu)化模型Pareto 前沿面結(jié)果圖Fig.8 Pareto front for multiobjective optimization

由圖8 可知，在A 區(qū)域可獲得較高的黃酮得率，但三萜得率并不理想；在C 區(qū)域獲得的三萜得率較高，但黃酮得率較低。而在B 區(qū)域既可得到較高的三萜得率，同時(shí)也可獲得滿意的黃酮得率，為進(jìn)一步降低提取工藝的成本，既要考慮到樺褐孔菌中三萜類物質(zhì)具有較高的得率，又要兼顧較優(yōu)的總黃酮得率，折中考慮選擇B 區(qū)域方案，表5 為優(yōu)化模型B 區(qū)的域解集。

表5 多目標(biāo)優(yōu)化模型B 區(qū)域Pareto 解集表Table 5 Pareto optimal solutions for optimization B region

2.3.3 NSGA-II 優(yōu)化結(jié)果實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證 通過表5 根據(jù)Pareto 解集B 區(qū)域方案預(yù)測(cè)分析得出最佳提取條件為酶添加量1.92%，酶解時(shí)間 45.03 min，液料比20.37 mL/g，乙醇濃度63.97%，該條件下預(yù)測(cè)得到總?cè)啤ⅫS酮平均得率分別為2.690%、5.394%，考慮到實(shí)際操作的局限性，將實(shí)際提取工藝條件修正為酶添加量1.9%，酶解時(shí)間45 min，液料比20 mL/g，乙醇濃度64%，進(jìn)行3 次重復(fù)驗(yàn)證試驗(yàn)，實(shí)際測(cè)得總?cè)?、黃酮平均得率為2.670%±0.05%、5.356%±0.09%，與預(yù)測(cè)得率平均值的相對(duì)誤差為0.75%、0.70%，實(shí)測(cè)總?cè)?、黃酮得率RSD 值分別為2.13%、2.24%，實(shí)測(cè)結(jié)果與預(yù)測(cè)值誤差較小，重復(fù)試驗(yàn)相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差較小，驗(yàn)證了NSGA-II 多目標(biāo)遺傳算法優(yōu)化提取工藝具有可行性。

2.4 應(yīng)用液-質(zhì)聯(lián)用技術(shù)鑒定樺褐孔菌中有效成分

采用“1.2.6”項(xiàng)高效液相色譜分離條件，樺褐孔菌提取物中有效成分得到較好的分離，如圖9，為樺褐孔菌提取物的高效液相色譜圖。采取液相色譜與質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)對(duì)液相色譜中主要化合物色譜峰相對(duì)應(yīng)的質(zhì)譜數(shù)據(jù)進(jìn)行了分析測(cè)定，結(jié)果如表6 所示。

表6 樺褐孔菌提取物中主要成分的液-質(zhì)聯(lián)用分析數(shù)據(jù)Table 6 LC-MS data of the main components in the extract of Inonotus obliquus

圖9 樺褐孔菌提取物取物液相色譜圖Fig.9 Chromatograms of extracts of Inonotus obliquus

化合物1 保留時(shí)間為24.20 min，正離子模式下其一級(jí)質(zhì)譜出現(xiàn)m/z:443.12[M+H]準(zhǔn)分子離子峰，二級(jí)質(zhì)譜主要碎片離子m/z:425.21 [M+H-HO]為該準(zhǔn)分子離子脫去1 個(gè)HO 分子所產(chǎn)生，m/z:407.23[M+H-2HO]為準(zhǔn)分子離子在此基礎(chǔ)上再脫去1 分子HO 所產(chǎn)生；m/z:411.16 [M+H-CHOH]離子為準(zhǔn)分子離子與-CHOH 裂解所產(chǎn)生，在此基礎(chǔ)上再脫掉1 分子HO 從而生成碎片離子m/z:393.15。經(jīng)液相色譜分析提取物中化合物1 相對(duì)百分含量為32.30%，且以上為碎片信息與文獻(xiàn)中報(bào)道的質(zhì)譜碎片信息一致，故確定化合物1 為白樺脂醇。

化合物2 保留時(shí)間為29.15 min，正離子模式下其一級(jí)質(zhì)譜出現(xiàn)m/z:427.60 [M+H]準(zhǔn)分子離子峰，二級(jí)質(zhì)譜主要碎片離子 m/z:412.81 [M+H-CH]為該準(zhǔn)分子離子裂解1 個(gè)-CH所產(chǎn)生，m/z:395.02 為準(zhǔn)分子離子在此基礎(chǔ)上脫去1 分子HO 所產(chǎn)生；m/z:315.03 碎片離子則為準(zhǔn)分子離子丟失C側(cè)鏈所產(chǎn)生。經(jīng)液相色譜分析提取物中化合物2 相對(duì)百分含量為10.50%，且以上碎片信息與文獻(xiàn)中報(bào)道的質(zhì)譜碎片信息一致，故確定化合物2 為羊毛甾醇。

化合物3 保留時(shí)間為34.30 min，正離子模式下其一級(jí)質(zhì)譜出現(xiàn)m/z:179.07 [M+H]準(zhǔn)分子離子峰，二級(jí)質(zhì)譜主要碎片離子 m/z:161.06 [M+H-HO]為該準(zhǔn)分子離子脫去1 個(gè)HO 所產(chǎn)生。m/z:164.03[M+H-CH]為該準(zhǔn)分子離子脫去1 個(gè)-CH所產(chǎn)生，m/z:137.06 碎片離子為準(zhǔn)分子離子在此基礎(chǔ)上丟失2'C 側(cè)鏈所產(chǎn)生。經(jīng)液相色譜分析提取物中化合物3 相對(duì)百分含量為30.99%，且以上碎片信息與文獻(xiàn)中報(bào)道的質(zhì)譜碎片信息一致，故確定化合物3 為紫萁酮。

化合物4 保留時(shí)間為40.68 min，正離子模式下其一級(jí)質(zhì)譜出現(xiàn)m/z:303.02 [M+H]準(zhǔn)分子離子峰，二級(jí)質(zhì)譜主要碎片離子 m/z:285.10 [M+H-HO]為該準(zhǔn)分子離子脫去1 分子HO 所產(chǎn)生，m/z:257.01碎片離子為在此基礎(chǔ)上失去1 個(gè)CO 所產(chǎn)生，m/z:229.06 則為碎片離子m/z:257.01 經(jīng)重排后再次失去1 個(gè)CO 所得到。經(jīng)液相色譜分析提取物中化合物4 相對(duì)百分含量為9.12%，且以上碎片信息與文獻(xiàn)中報(bào)道的質(zhì)譜碎片信息一致，故確定化合物4 為槲皮素。

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)在單因素實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上，利用響應(yīng)面法建立了二次多項(xiàng)式模型，通過方差分析證明理論模型擬合較好，得到各因素對(duì)總?cè)啤ⅫS酮得率影響關(guān)系，且交互項(xiàng)AC、AD 分別對(duì)總?cè)?、黃酮得率作用顯著（＜0.05），其次利用NSGA-II 遺傳算法結(jié)合響應(yīng)面回歸方程對(duì)最佳提取工藝進(jìn)行預(yù)測(cè)，相對(duì)于已有傳統(tǒng)提取工藝優(yōu)化的研究，該方法在搜索過程中不容易陷入局部最優(yōu)，能更準(zhǔn)確地搜索到最佳提取方案，更直觀地找出合理工藝參數(shù)區(qū)間并對(duì)多種目標(biāo)量同時(shí)進(jìn)行預(yù)測(cè)，預(yù)測(cè)獲得最佳提取工藝：酶添加量1.9%，酶解時(shí)間45 min，液料比20 mL/g，乙醇濃度64%，該條件下樺褐孔菌總?cè)?、黃酮的得率分別為2.670%±0.05%、5.356%±0.09%，進(jìn)行3 次重復(fù)驗(yàn)證試驗(yàn)，結(jié)果實(shí)測(cè)值與理論預(yù)測(cè)值吻合度較高，表明NSGA-II遺傳算法結(jié)合響應(yīng)面優(yōu)化樺褐孔菌有效成分提取工藝準(zhǔn)確可靠、重現(xiàn)性良好，經(jīng)UPLC-MS/MS 鑒定樺褐孔菌主要包含白樺脂醇、羊毛甾醇、紫萁酮、槲皮素四種有效成分，其相對(duì)百分含量分別為32.30%、10.50%、30.99%、9.12%。本研究結(jié)果為樺褐孔菌總?cè)?、黃酮的高效提取提供了工藝路線和工藝參數(shù)的數(shù)據(jù)支撐，而且對(duì)一般植物有效成分的提取也具有參考價(jià)值，具有同時(shí)提高多種有效成分得率，極大降低研究成本的應(yīng)用價(jià)值，為食品現(xiàn)代化、智能化生產(chǎn)提供了新思路。

本研究以超聲輔助酶解法為提取方法，利用NSGA-II 遺傳算法結(jié)合響應(yīng)面對(duì)提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，同時(shí)提高了三萜、黃酮類有效成分的得率，一定程度為樺褐孔菌有效成分的利用提供了理論基礎(chǔ)，但未進(jìn)一步對(duì)樺褐孔菌三萜、黃酮類有效成分活性開展深入研究。