精子線粒體膜電位在宮腔內(nèi)人工授精的綜合評估作用

戎春浩，周黎明，李燕

宮腔內(nèi)人工授精（IUI）是通過體外優(yōu)化處理精子并以非性交的方式注入女性宮腔，使精卵自然結(jié)合，從而達到受孕的目的，其與其他的輔助生殖技術(shù)（ART）相比，是一種成本更低且侵入性傷害更小的治療不孕不育的方法[1]。但IUI 的成功率卻不如其他ART 助孕方式高，總體成功率約15%[2-3]，其中男性精子質(zhì)量問題是重要因素。精子的授精能力取決于精子的質(zhì)量和內(nèi)在功能，目前臨床上還是以傳統(tǒng)的精液參數(shù)作為ART治療前的男性精子質(zhì)量評估指標(biāo)，如射精量、精子濃度、精子總數(shù)、精子總活動率、精子前向運動率、精子不活動率、精子DNA 碎片指數(shù)及精子正常形態(tài)率等。有研究表明，精子質(zhì)量與IUI成功率之間存在著相關(guān)性，較高的精子正常形態(tài)率及活動率是IUI 成功的關(guān)鍵因素[4]。但在ART 治療中，由于男性精子功能缺陷，有5%～10%的治療周期會發(fā)生授精失敗[5]。

有研究發(fā)現(xiàn)，精子線粒體能量的儲存與細胞膜上的質(zhì)子濃度和電位差有關(guān)[6]，因此可以通過對精子線粒體膜電位（MMP）的分析，評估精子能量水平和受精能力。精子MMP 完整性不僅反映精子線粒體的能量狀態(tài)，還與精子活動能力密切相關(guān)，其是反應(yīng)精子功能的一個重要指標(biāo)，近幾年越來越受到關(guān)注。本研究以每一進入IUI周期的臨床妊娠率作為最終評估指標(biāo)，探討MMP對IUI妊娠結(jié)局的預(yù)測價值?，F(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 收集2020 年6 月至2021 年8 月在寧波市婦女兒童醫(yī)院生殖中心行IUI治療的不孕不育夫婦的臨床資料。納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）女方年齡＜40歲；（2）男方年齡＜45 歲；（3）無卵巢功能減退；（4）女方基礎(chǔ)卵泡刺激素水平正常（＜11 IU/L）；（5）女方輸卵管通暢及無排卵障礙、子宮內(nèi)膜異位癥；（6）女方排除盆腔炎癥和生殖內(nèi)分泌異常等潛在的不孕因素；（7）夫妻雙方均無染色體異常、性病等。根據(jù)男方精子MMP 的檢測結(jié)果，將研究對象分為低MMP 組（≤52%）和高MMP 組（＞52%）。本研究所有對象均簽署知情同意書。

1.2 方法

1.2.1 精液常規(guī)分析 男方禁欲2～7d后，通過手淫法采集精液樣本于無菌容器內(nèi)，根據(jù)《世界衛(wèi)生組織人類精液檢查與處理實驗室手冊》第5 版[7]標(biāo)準(zhǔn)方法進行分析，測定一次射精量，用計算機輔助精子分析儀（北京穗加SSA-II）檢測精子精子濃度、總數(shù)、總活動率、前向運動率及不活動率等。

1.2.2 精子形態(tài)分析 采用改良巴氏染色法（華康公司，深圳）對樣本進行涂片、染色，按照《世界衛(wèi)生組織人類精液檢查與處理實驗室手冊》第5 版形態(tài)學(xué)判讀標(biāo)準(zhǔn)計數(shù)。油鏡下至少計數(shù)200 條精子，讀取2 張玻片，正常形態(tài)率=（正常形態(tài)精子數(shù)/精子總數(shù)）×100%。

1.2.3 精子染色質(zhì)結(jié)構(gòu)分析試驗 應(yīng)用精子核完整性染色試劑盒（星博公司，浙江），嚴(yán)格按產(chǎn)品說明書操作，對精子進行吖啶橙染色，其中天然雙鏈DNA呈綠色熒光，單鏈DNA 呈紅色熒光，熒光信號通過流式細胞儀（BD-Calibur）進行分析，計算得出精子DNA 碎片指數(shù)。

1.2.4 精子MMP 檢測 參照精子中段線粒體染色試劑盒說明書（星博公司，浙江），用PBS 調(diào)整精子濃度1×106/ml，采用熒光染料JC-1 進行染色，熒光信號通過流式細胞儀（BD-Calibur）進行檢測，計算得出精子MMP 值。

1.2.5 IUI 助孕方案及臨床妊娠率統(tǒng)計女方患者通過克羅米芬（CC）或促性腺激素（HMG）促排卵，B超、血尿LH峰值等方法綜合評估監(jiān)測卵泡生長發(fā)育，在平均卵泡直徑＞16 mm時，肌注HCG 1 000 U，36 h 后行IUI。受精方法：女方截石位，清洗會陰、消毒，采用雙腔導(dǎo)管將上游精子懸液緩慢注入宮腔，授精量為0.5～2ml，術(shù)后保持仰臥位15～20min。術(shù)后14d測血清-hCG含量，若≥25IU/L，且4周后陰道超聲檢查觀察到宮內(nèi)孕囊和胎心搏動，則確定為臨床妊娠。在臨床妊娠12 周內(nèi)發(fā)生妊娠丟失則為早期流產(chǎn)。

1.3 統(tǒng)計方法 采用SPSS 23.0 統(tǒng)計軟件進行分析，計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用方差分析或t 檢驗；計數(shù)資料采用2檢驗；相關(guān)性分析采用Spearman分析。P ＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組基本資料比較 本研究共納入329 個IUI助孕周期，其中低MMP組共205 個周期，高MMP 組共124 個周期。兩組女方年齡、BMI 指數(shù)、AMH、男方年齡及禁欲天數(shù)差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（均P ＞0.05）。見表1。

表1 兩組基本資料比較

2.2 兩組精液參數(shù)及臨床妊娠結(jié)局比較 高MMP 組的精子濃度、精子總數(shù)、精子總活動率、精子前向運動率及正常精子形態(tài)率均高于低MMP組（均P＜0.05）。低MMP 組的精子不活動率和精子DNA碎片指數(shù)均高于高MMP組（均P＜0.01）。兩組射精量差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P ＞0.05）。高MMP 組的IUI 臨床妊娠率高于低MMP 組（P ＜0.01）。見表2。

表2 兩組精液參數(shù)及臨床妊娠結(jié)局比較

2.3 MMP與傳統(tǒng)精液參數(shù)的相關(guān)性分析 MMP 與精子濃度、精子總數(shù)、精子總活動率、精子前向運動率及正常精子形態(tài)率均呈正相關(guān)（均P＜0.01）；MMP與精子不活動率及精子DNA 碎片率呈負相關(guān)（均P＜0.01）；MMP與一次射精量無關(guān)（P ＞0.05）。見表3。

表3 MMP 與傳統(tǒng)精液參數(shù)的相關(guān)性分析

3 討論

本研究結(jié)果顯示高MMP 組IUI 臨床妊娠率高于低MMP 組。高MMP 組和低MMP 組的精子濃度、精子總數(shù)、精子總活動率、精子前向運動率、精子不活動率、正常精子形態(tài)率和精子DNA碎片指數(shù)差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P ＜0.05）。精子MMP 與精子濃度、精子總數(shù)、精子總活動率、精子前向運動率、正常精子形態(tài)率呈正相關(guān)，與精子不活動率、精子DNA 碎片指數(shù)呈負相關(guān)。這表明精子MMP 水平與精子數(shù)量減少、精子運動能力下降、精子畸形率增加、DNA 碎片指數(shù)上升及IUI 臨床妊娠率降低有關(guān)，其是重要的精子功能評估指標(biāo)。精子MMP 水平檢測聯(lián)合傳統(tǒng)精液參數(shù)有助于綜合評估男性不育。

IUI 助孕方式一直是治療男性因素引起不孕的主要方法之一，相比體外受精（IVF）和卵胞漿內(nèi)單精子注射技術(shù)（ICSI），其操作簡單、費用少及侵襲性更弱，但是妊娠成功率只有15%～20%[8]。實驗室精液常規(guī)參數(shù)分析一直是評估男性生育力的常規(guī)檢查，也是作為男性不育患者是否適合做IUI 的判斷依據(jù)。但是近幾年來，越來越多的學(xué)者提出僅僅通過傳統(tǒng)精液基本參數(shù)來評估男方的生育力水平是不夠的，David 等[9]研究發(fā)現(xiàn)僅僅通過傳統(tǒng)的精液參數(shù)對宮腔內(nèi)人工授精結(jié)局的預(yù)測無法達到預(yù)期效果，精子內(nèi)在的功能缺陷也會對生育力產(chǎn)生影響。

精子從睪丸生成到附睪里成熟需要經(jīng)過一系列動態(tài)變化，發(fā)育過程中其他細胞器和細胞質(zhì)會逐漸消失。線粒體從最初的大約103 個線粒體減少到80 個[10]。當(dāng)精卵結(jié)合發(fā)生時，精子線粒體會通過自噬途徑被完全降解清除[11]。精子線粒體參與氧化磷酸化并合成ATP，為精子運動提供主要的能量來源；維持鈣離子穩(wěn)態(tài)；參與類固醇激素的生物合成；發(fā)生氧化應(yīng)激反應(yīng)，產(chǎn)生ROS；通過“固有”凋亡途徑調(diào)控精子凋亡，維持男性生育力；維持精子頂體酶活性、頂體反應(yīng)和染色質(zhì)完整性，直接影響精子的受精能力[12]。

MMP是指在精子能量代謝過程中，電子經(jīng)呼吸鏈傳遞產(chǎn)生ATP，同時復(fù)合物Ⅰ、Ⅲ和Ⅳ將質(zhì)子從線粒體內(nèi)膜基質(zhì)側(cè)泵至內(nèi)膜外所形成的跨膜電位差。在正常的精子線粒體中，跨膜電位差反映了電子傳輸和氧化磷酸化的過程，該過程驅(qū)動線粒體ATP 的產(chǎn)生。因此，MMP是反映精子線粒體功能的完整性。而線粒體最顯著的功能就是以ATP 形式產(chǎn)生化學(xué)能，精子利用這些能量從而維持活動能力，這是男性生育能力的主要決定因素之一。Gallon 等[13]發(fā)現(xiàn)MMP 低的精子，精卵結(jié)合發(fā)生頂體反應(yīng)的能力較差，使精子不易通過卵丘透明帶，繼而發(fā)生受精障礙。MMP 反映了精子線粒體的功能完整性和能量狀態(tài)，如果MMP降低就會直接影響精子的質(zhì)量和功能，從而導(dǎo)致男性不育的發(fā)生[14]。而另一項研究表明，精子線粒體膜電位的改變，可以預(yù)測精子的授精能力，精子線粒體膜電位越高，精子的授精能力越強[15]。本研究數(shù)據(jù)也證實了這一點，精子MMP越高精子活動能力越強。Marchetti 等[16]以傳統(tǒng)實驗室精液參數(shù)精子活動率和精子MMP 水平為依據(jù)，對91 例ART 助孕周期的分析以及受精成功組和失敗組的比較，發(fā)現(xiàn)精子MMP檢測更優(yōu)于傳統(tǒng)精子活動力檢測對受精結(jié)局的預(yù)測。也有學(xué)者提出精子MMP和精子DNA碎片指數(shù)聯(lián)合預(yù)測女性配偶自然受孕的能力優(yōu)于精液傳統(tǒng)參數(shù)[17]，是臨床評估特發(fā)性男性不育的重要指標(biāo)[18]。所以，對于行IUI助孕方式的男性不育患者來說，精子MMP檢查是十分有意義的，可以提前評估出低授精能力的精液樣本，做到IUI風(fēng)險預(yù)估，必要時可以改變ART助孕方式來確保良好的結(jié)局。