Omi/HtrA2 抑制劑對蛛網(wǎng)膜下腔出血大鼠早期腦損傷的影響

程振宇，申屠華松，陳亦華，何忠平，俞北偉，王瑞權(quán)，傅斌

自發(fā)性蛛網(wǎng)膜下腔出血（SAH）可直接破壞腦組織，誘發(fā)劇烈的炎癥反應(yīng)；同時破壞血腦屏障通透性，加重腦水腫。各種因素聚集造成神經(jīng)細(xì)胞凋亡，誘發(fā)SAH 后的早期腦損傷[1-2]。Omi/HtrA2 是一種參與細(xì)胞凋亡的線粒體絲氨酸蛋白酶，而UCF-101 是Omi/HtrA2 特異性抑制劑[3]。動物實(shí)驗顯示，UCF-101 可顯著抑制腦缺血神經(jīng)細(xì)胞凋亡[4]，改善外傷性脊髓損傷[5]，也可明顯降低膿毒癥性腦病腦炎癥反應(yīng)和神經(jīng)細(xì)胞凋亡及改善血腦屏障通透性[6-8]。本研究觀察UCF-101 腹腔注射對SAH 大鼠腦組織炎癥反應(yīng)、腦水腫、血腦屏障通透性、神經(jīng)細(xì)胞凋亡及相關(guān)蛋白表達(dá)的影響，旨在揭示Omi/HtrA2抑制劑對大鼠SAH后早期腦損傷的保護(hù)作用并探討其作用機(jī)制，現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1 材料 健康Wistar 大鼠（上海斯萊克實(shí)驗動物有限責(zé)任公司），雄性，清潔級，體質(zhì)量250～300 g；UCF-101（規(guī)格：5 mg/支，德國Calbiochem公司）；ApoAlert細(xì)胞凋亡檢測試劑盒（規(guī)格：100T/盒，美國Biosciences Clontech 公司）；白介素-1（IL-1）、IL-6 和 腫瘤壞死因子-（TNF-）酶聯(lián)免疫分析試劑盒（規(guī)格：96孔/kit，武漢艾美捷科技有限公司）；酶免疫分析儀（型號：iMark，美國Biorad 公司）；脫色搖床（型號：TY-80B，常州澳華儀器有限公司）；轉(zhuǎn)印槽（型號：Trans-Blot，美國Biorad 公司）；電泳儀（型號：DYCP-31C，北京六一生物科技有限公司）；小型垂直電泳槽（型號：164-8001，美國Biorad 公司）；生物倒置顯微鏡（型號：IX-71，中國奧林巴斯有限公司）。

1.2 動物模型制備 本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會審核，按照隨機(jī)數(shù)字表法將120只大鼠分成 Sham 組、SAH 組和UCF-101 組，每組40 只。根據(jù)指標(biāo)測定的需要每組大鼠又被分成4 個亞組，各10 只大鼠，分別用于蛋白表達(dá)、細(xì)胞凋亡、腦水腫和血腦屏障通透性測定。采用Roux 等建立的枕大池二次注血法制作SAH 大鼠模型，Sham 組大鼠注入等量0.9%氯化鈉注射液。在手術(shù)操作前0.5 h，UCF-101 組大鼠腹腔注射UCF-101（劑量：3.0mol/kg），其余兩組大鼠腹腔注射0.9%氯化鈉注射液（劑量：10 ml/kg）。在24 h 后，處死大鼠進(jìn)行指標(biāo)測定。

1.3 Western-blotting 檢測 大鼠腦組織經(jīng)細(xì)胞裂解、離心及蛋白濃度測定后，經(jīng)凝膠電泳、電轉(zhuǎn)移和室溫封閉，加入兔抗大鼠 AQP-9、MMP-9、Occludin、Claudin-5、ZO-1、TIMP-1 和GAPDH 單克隆抗體孵育過夜，洗膜，加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔IgG二抗室溫?fù)u床孵育，洗膜，化學(xué)發(fā)光試劑作用，X 光膠片曝光、沖洗并掃描。采用quality one軟件分析雜交條帶灰度值，以GAPDH水平為內(nèi)對照，比較相對灰度值。

1.4 細(xì)胞凋亡檢測 將大鼠腦組織進(jìn)行4%多聚甲醛固定24 h后，脫水、透明、浸蠟進(jìn)行包埋。4 m 厚度切片，60 ℃烤片3 h，切片脫蠟。根據(jù)ApoAlert TUNEL細(xì)胞凋亡檢測試劑盒說明書進(jìn)行操作，最后用含抗熒光淬滅劑的封片液封片，然后在熒光顯微鏡下觀察采集圖像，計算凋亡神經(jīng)細(xì)胞比例。

1.5 酶聯(lián)免疫吸附法測定 取腦組織標(biāo)本研磨后置于離心管中，用高速勻漿器在沐浴中進(jìn)行勻漿，以20 000 r/min 離心10 min，提取上清液按照試劑盒說明書操作，采用酶聯(lián)免疫吸附試驗檢測IL-1、IL-6 和TNF-濃度。

1.6 腦組織含水量測定 在10%水合氯醛麻醉下，大鼠斷頸處死，迅速取腦稱重，在80℃條件下的恒溫箱中烘烤48h后再次稱重兩次，兩次測定值之差＜0.2mg，采用公式計算腦水腫指數(shù)：腦水腫指數(shù)=（濕重－干重）/濕重×100%。

1.7 血腦屏障滲透性測定 采用測定腦組織中伊文氏藍(lán)含量來確定大鼠血腦屏障的滲透性。首先建立伊文氏藍(lán)標(biāo)準(zhǔn)回歸曲線，然后經(jīng)股靜脈注射伊文氏藍(lán)，處死大鼠，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)向左心室灌注0.9%氯化鈉注射液，切取顳底組織并稱重。腦組織與50%三氯乙酸溶液混勻后離心，取上清液，應(yīng)用紫外分光光度儀進(jìn)行比色，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算出伊文氏藍(lán)含量，結(jié)果以g/g 腦組織表示。

1.8 統(tǒng)計方法 采用SPSS 19.0 統(tǒng)計軟件，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，多組比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t法。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠腦組織炎癥因子表達(dá)SAH 組、UCF-101 組大鼠腦組織IL-1、IL-6 和TNF-表達(dá)水平高于Sham組（均P ＜0.05），且SAH 組各指標(biāo)均高于UCF-101 組（均P ＜0.05）。見表1。

表1 各組大鼠腦組織IL-1、IL-6 和TNF-表達(dá)水平 pg/mg

表1 各組大鼠腦組織IL-1、IL-6 和TNF-表達(dá)水平 pg/mg

2.2 各組大鼠血腦屏障通透性和內(nèi)皮細(xì)胞緊密連接蛋白表達(dá) SAH 組、UCF-101 組大鼠腦組織 occludin、claudin-5 和ZO-1 蛋白表達(dá)均低于Sham組（均P ＜0.05），且SAH組上述指標(biāo)均低于UCF-101 組（均P ＜0.05）；SAH組、UCF-101 組血腦屏障通透性均高于Sham 組（均P ＜0.05），且SAH 組高于UCF-101 組（P ＜0.05）。見表2。

表2 各組大鼠血腦屏障通透性和內(nèi)皮細(xì)胞緊密連接蛋白表達(dá)

2.3 各組大鼠腦水腫指數(shù)和基質(zhì)蛋白表達(dá) SAH 組、UCF-101 組大鼠腦組織TIMP-1 蛋白表達(dá)均低于Sham 組（均P＜0.05），SAH 組低于UCF-101 組（P ＜0.05）。SAH 組、UCF-101 組大鼠腦水腫指數(shù)、腦組織MMP-9 和AQP-9 蛋白表達(dá)均高于Sham組（均P＜0.05），且SAH組上述各指標(biāo)均高于UCF-101 組（均P＜0.05）。見表3。

表3 各組腦水腫指數(shù)和基質(zhì)蛋白表達(dá)

2.4 各組大鼠腦組織神經(jīng)細(xì)胞凋亡情況 Sham 組、SAH 組和UCF-101 組大鼠腦組織凋亡神經(jīng)細(xì)胞比例依次是（5.92±1.00）%、（26.68±4.92）% 和（15.85±2.24）%（F=219.45，P ＜0.001）。SAH組、UCF-101 組大鼠腦組織凋亡神經(jīng)細(xì)胞比例高于Sham組（均P＜0.05），且SAH 組高于UCF-101 組（均P ＜0.05）。見封三彩圖2。

圖2 各組大鼠腦組織神經(jīng)細(xì)胞凋亡情況

3 討論

SAH 后早期腦損傷的病理生理機(jī)制相當(dāng)復(fù)雜，涉及炎癥反應(yīng)、細(xì)胞凋亡、血腦屏障的破壞及腦水腫的形成等。這一系列過程由諸多蛋白參與和調(diào)節(jié)，從而維持一個相對平穩(wěn)的狀態(tài)[9-11]。在急性腦損傷后，腦組織中的炎癥因子、內(nèi)皮細(xì)胞緊密連接蛋白、水通道蛋白和基質(zhì)蛋白（如IL-1、IL-6、TNF-、AQP-9、MMP-9、Occludin、Claudin-5、ZO-1 和TIMP-1 等）的表達(dá)水平均會發(fā)生不同水平的改變，IL-1、IL-6、TNF-、AQP-9和MMP-9 蛋白表達(dá)水平上調(diào)，Occludin、Claudin-5、ZO-1 和TIMP-1 蛋白表達(dá)水平下降。這些蛋白表達(dá)水平的改變，造成腦組織穩(wěn)態(tài)的破壞，出現(xiàn)了神經(jīng)細(xì)胞凋亡和腦炎癥反應(yīng)的加劇，以及血腦屏障的破壞及腦水腫的形成[1-2]。本研究顯示，SAH大鼠神經(jīng)細(xì)胞凋亡、腦水腫和血腦屏障通透性加重的同時，也伴有上述蛋白表達(dá)水平的改變。因此，通過檢測上述蛋白在腦組織中的表達(dá)水平也一定程度上反映了SAH 大鼠腦損傷的程度。

Omi/HtrA2 是一種線粒體絲氨酸蛋白酶，可以增強(qiáng)含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶活性，從而參與細(xì)胞凋亡[3]。UCF-101 是Omi/HtrA2 特異性抑制劑，可以抑制急性肺炎大鼠肺炎癥反應(yīng)和細(xì)胞凋亡[12]，也可以抑制帕金森氏病大鼠的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)氧化應(yīng)激反應(yīng)[13]，同時對腦缺血大鼠的神經(jīng)細(xì)胞凋亡的抑制作用表現(xiàn)明顯[4]，且可降低膿毒癥腦部大鼠炎癥反應(yīng)、神經(jīng)細(xì)胞凋亡和血腦屏障通透性[6-8]。因此，Omi/HtrA2 抑制劑對SAH 大鼠腦損傷可能具有保護(hù)作用。研究提示，采用Omi/HtrA2 抑制劑UCF-101 腹腔注射治療實(shí)驗性缺血性腦損傷、外傷性脊髓損傷和膿毒癥性腦病具有一定效果[4-8]。關(guān)于UCF-101 腹腔注射的劑量沒有統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)，用于腦缺血和膿毒血癥腦病大鼠腹腔注射的UCF-101劑量分別是1.5mol/kg[4]和10mol/kg[6]。本研究采用的UCF-101腹腔注射的劑量是3mol/kg，結(jié)果顯示，使用UCF-101 腹腔注射對SAH大鼠進(jìn)行治療可以顯著逆轉(zhuǎn)SAH 造成的大鼠腦組織 IL-1、IL-6、TNF-、AQP-9、MMP-9、Occludin、Claudin-5、ZO-1 和TIMP-1 蛋白表達(dá)水平的變化，降低神經(jīng)細(xì)胞凋亡，改善血腦屏障通透性和減輕腦水腫。因此，UCF-101 對SAH 大鼠腦損傷可能具有顯著保護(hù)作用，其機(jī)制可能與其修復(fù)血腦屏障、減輕腦水腫、抑制促炎因子釋放和降低神經(jīng)細(xì)胞凋亡有關(guān)。

綜上所述，本研究初步揭示了Omi/HtrA2 抑制劑UCF-101 對SAH 腦損傷的保護(hù)作用及機(jī)制，為下一步繼續(xù)研究UCF-101 做為SAH 腦損傷治療新藥提供一定的理論依據(jù)。