LncRNAMNX1-AS1 調(diào)節(jié)miR-744-5p/SH3BGRL3對喉癌細胞生長、遷移的影響

尹稱意，馬兵良，徐玨

喉癌主要以鱗狀細胞癌最常見，其發(fā)病率呈上升趨勢[1]。盡管現(xiàn)在醫(yī)療水平技術(shù)不斷提高，但是喉癌患者的預(yù)后情況尚無明顯改善，侵襲和轉(zhuǎn)移是造成喉癌高死亡率的重要原因[2]。因此，研究喉癌發(fā)生發(fā)展的作用機制有利于發(fā)現(xiàn)喉癌診治和判定預(yù)后的潛在標志物。長鏈非編碼RNA（lncRNAs）是由RNA 聚合酶II轉(zhuǎn)錄生成的長度超過200 nt的副產(chǎn)物，雖然不具有編碼蛋白質(zhì)的能力，但其序列特征與信使RNA（mRNA）相似，參與細胞增殖、分化、代謝及個體發(fā)育等生物學(xué)功能[3-4]。既往研究顯示，喉癌患者血清、癌組織中LncRNA H19 表達均上調(diào)，LncRNA H19 可能作為評估患者預(yù)后的重要標志物[5]。長鏈非編碼RNA MNX1 反義RNA1（LncRNAMNX1-AS1）是新發(fā)現(xiàn)的一種分子[6]，有研究顯示，干擾LncRNA MNX1-AS1 誘導(dǎo)卵巢癌細胞的干樣特性降低，對細胞抑制作用明顯[7]。另有研究顯示，LncRNA MNX1-AS1 在膀胱癌中顯著上調(diào)且與不良預(yù)后相關(guān)[8]。但LncRNA MNX1-AS1 調(diào)節(jié)喉癌細胞生長、遷移的作用機制尚未見報道。因此，本研究分析干擾LncRNA MNX1-AS1 對喉癌細胞生長、遷移的影響，初步探討其影響喉癌發(fā)展的作用機制，現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1 材料 實驗細胞：人喉癌Hep-2 細胞購自中科院上海細胞所。實驗主要試劑和儀器：所使用質(zhì)粒以及抗體均購自上海吉瑪公司；Cell Counting Kit-8（CCK8）購自日本同仁Dojindo 公司；RPMI-1640 培養(yǎng)基、青鏈霉素購自武漢益普生物科技有限公司；胎牛血清、胰蛋白酶購自北京澤平科技有限責(zé)任公司；Trizol、LipofectamineTM2000 購自北京索萊寶科技有限公司，TaqMan?MicroRNA Reverse Transcription kit 及TaqMan?UniversalPCR MasterMix購自上海凱杰企業(yè)管理有限公司；cDNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自上海康朗生物科技有限公司；BCA 試劑盒購自上海羽哚生物科技有限公司；Transwell 小室購自Corning 公司（美國）；雙熒光素酶報告基因系統(tǒng)試劑盒購自成都安森盛源科技有限公司ELx808 酶標儀購自常熟市圣海電器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng) 將Hep-2 細胞置于含有10%FBS和1%青霉素-鏈霉素的RPMI1640培養(yǎng)基培養(yǎng)。將細胞保持在37℃充滿5%CO2的培養(yǎng)箱中。

1.2.2 細胞轉(zhuǎn)染 取對數(shù)期生長的Hep-2 細胞，接種至不含血清的RPMI 1640 培養(yǎng)基的6 孔板中（1.0×105個/孔），培養(yǎng)24 h 后。構(gòu)建穩(wěn)定敲低細胞系：將細胞分成sh NC 組和sh MNX1-AS1 組，將lncRNA MNX1-AS1 shRNA 慢病毒轉(zhuǎn)染至sh MNX1-AS1 組細胞，將對照shRNA慢病毒插入pLVX-tdTomato-Puro載體轉(zhuǎn)染至sh NC 組。構(gòu)建瞬時轉(zhuǎn)染細胞系：將細胞分成 NC mimics 組、miR-744-5p mimics 組、NC inhibitor 組、miR-744-5p inhibitor 組、sh SH3BGRL3組、miR-744-5p inhibitor+sh SH3BGRL3組。利用LiPofectamine TM 2000 脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法，將miR-NC mimics 轉(zhuǎn)染至NC mimics組細胞，miR-744-5p mimics 轉(zhuǎn)染至miR-744-5p mimics 組，miR-NC inhibitor 轉(zhuǎn)染至NC inhibitor 組細胞，miR-744-5p inhibitor 轉(zhuǎn)染至miR-744-5p inhibitor 組細胞，sh SH3BGRL3 轉(zhuǎn)染至sh SH3BGRL3 組，miR-744-5p inhibitor和同時 sh SH3BGRL3 轉(zhuǎn)染至miR-744-5p inhibitor+sh SH3BGRL3 組細胞。轉(zhuǎn)染48 h 后收集細胞用于后續(xù)實驗。引物序列見表1。

表1 實驗所用引物序列

1.2.3 實時熒光定量（RT-PCR）檢測MNX1-AS1、miR-744-5-p 和SH3BGRL3表達水平 采用Trizol 法提取細胞的總RNA，采用紫外分光光度計法測定RNA的濃度。以RNA 為模板進行逆轉(zhuǎn)錄獲得cDNA 并置于4 ℃保存，進行熒光定量PCR 擴增，置于RT-PCR 儀中進行測定，設(shè)置反應(yīng)條件：95 ℃，5 min 預(yù)變性；95 ℃變性10 s，60 ℃退火35 s，65 ℃延伸30 s，擴增35 個循環(huán)。以U6 和GAPDH 做為內(nèi)參。采用2－CT法統(tǒng)計MNX1-AS1、miR-744-5-p 和SH3BGRL3 mRNA 相對表達量。

1.2.4 敲低MNX1-AS1 表達對喉癌細胞生長的影響 取對數(shù)期生長的sh NC組和sh MNX1-AS1 組Hep-2 細胞，細胞轉(zhuǎn)染見1.2.2 項，將細胞（5×103/孔）接種于96 孔板。采用LipofectamineTM2000進行轉(zhuǎn)染后將細胞置于CO2培養(yǎng)箱進行培養(yǎng)24 h，于0、24、48、72 h 對細胞吸光度（OD）進行檢測。每孔加入100l 體積的CCK-8 溶液于37 ℃環(huán)境中繼續(xù)孵育2 h，用酶標儀檢測450 nm的吸光度。

1.2.5 過表達miR-744-5p 對喉癌細胞生長的影響 取對數(shù)期生長的NC mimics 組和miR-744-5p mimics 組Hep-2 細胞，細胞轉(zhuǎn)染見1.2.2 項，細胞生長具體操作過程同1.2.4 項。

1.2.6 MNX1-AS1/miR-744-5p/SH3BGRL3軸對喉癌細胞生長的影響 取對數(shù)期生長的NC inhibitor 組、miR-744-5p inhibit or 組和miR-744-5pinhibitor+shSH3BGRL3組Hep-2 細胞，細胞轉(zhuǎn)染見1.2.2 項，細胞生長具體操作過程同1.2.4 項。

1.2.7 敲低MNX1-AS1 表達對喉癌細胞遷移能力的影響 取對數(shù)期生長的sh NC 組和sh MNX1-AS1 組Hep-2 細胞，細胞轉(zhuǎn)染見1.2.2 項。在24 孔板中，將細胞懸液（5×104/ml）接種于Transwell上室，下室加入500l 含10%血清的培養(yǎng)基，置于培養(yǎng)箱孵育。37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h，取出Transwell 小室，棉簽輕輕擦拭小室膜上表面，甲醛固定10 min，0.3%結(jié)晶紫溶液染色20 min，用PBS洗3 次，在倒置顯微鏡下觀察，觀察小室膜下表面細胞數(shù)量取其平均值，本實驗平行重復(fù)3 次。

1.2.8 過表達miR-744-5p對喉癌細胞遷移能力的影響 取對數(shù)期生長的NC mimics組和miR-744-5pmimics 組Hep-2 細胞，細胞轉(zhuǎn)染見1.2.2 項。遷移實驗操作步驟見1.2.7。

1.2.9 MNX1-AS1/miR-744-5p/SH3BGRL3軸對喉癌細胞遷移能力的影響 取對數(shù)期生長的NC inhibitor 組、miR-744-5p inhibitor 組和miR-744-5p inhibitor+sh SH3BGRL3 組Hep-2 細胞，細胞轉(zhuǎn)染見1.2.2 項。遷移實驗操作步驟見1.2.7。

1.2.10 雙熒光酶素報告基因?qū)嶒濴ncRNAMNX1-AS1 與miR-744-5-p 結(jié)合位點通過生物信息學(xué)預(yù)測網(wǎng)站StarBase v3.0（http://starbase.sysu.edu.cn/）上進行鑒定。將含有 miR-744-5p 結(jié)合序列的LncRNA MNX1-AS1 插入pLVX-IRESPuro 載體獲得野生型質(zhì)粒MNX1-AS1 WT。LncRNA MNX1-AS1 與miR-744-5p結(jié)合的序列被突變并插入pLVX-IRESPuro 載體獲得突變型質(zhì)粒MNX1-AS1 Mut。取對數(shù)期生長的喉癌細胞Hep-2 接種于24 孔板中（2.5×105個/孔），培養(yǎng)24 h后，棄培養(yǎng)基。采用Lipofectamine TM 2000 轉(zhuǎn)染1 g 熒光素酶報告載體，將MNX1-AS1 WT 與miR-744-5p mimic或 NC mimic、MNX1-AS1 Mut 與miR-744-5p mimics 或 NC mimic+MNX1-AS1 Mut 分別共轉(zhuǎn)染喉癌細胞Hep-2 中。轉(zhuǎn)染12 h 后，更換新鮮的培養(yǎng)基。再培養(yǎng)24 h 后，裂解細胞，離心（3 500 r/min、5 min）后，取上清液檢測熒光素酶活性。

1.2.11 蛋白免疫印跡實驗 取NCmimics 組和miR-744-5p 組細胞，加入RIPA裂解液提取細胞總蛋白，BCA法蛋白濃度測定蛋白濃度。沸水浴中煮沸10min，電泳后轉(zhuǎn)膜，用5%脫脂牛奶室溫封閉1h。加入一抗SH3BGRL3（1∶5 000），4 ℃孵育過夜。次日PBS 洗滌3 次，然后加入相應(yīng)二抗（1∶1000），室溫孵育1h，PBS洗滌3次，發(fā)光液進行顯色，選擇內(nèi)參GAPDH。

1.3 統(tǒng)計方法 采用SPSS 22.0 統(tǒng)計軟件進行分析。計量資料以均數(shù)±標準差表示，多組比較采用單因素方差分析，兩組比較采用t 檢驗；計數(shù)資料采用2檢驗。P ＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 LncRNA MNX1-AS1、miR-744-5p、SH3BGRL3在喉癌組織中表達水平及細胞轉(zhuǎn)染效率 與sh NC 組相比，MNX1-AS1組MNX1-AS1mRNA水平降低（P＜0.05）；與NC mimics 組相比，miR-744-5pmimics 組miR-744-5p mRNA 水平升高（P ＜0.05）；與NC inhibitor 組相比，miR-744-5p inhibitor 組miR-744-5p mRNA 水平降低（P ＜0.05）；與shNC組相比，shSH3BGRL3 組SH3BGRL3 mRNA 水平降低（P ＜0.05）。見圖1。

圖1 LncRNA MNX1-AS1、miR-744-5p、SH3BGRL3 在喉癌細胞中表達水平

2.2 敲低MNX1-AS1 表達對喉癌細胞生長的影響 細胞培養(yǎng)至48 h 后，sh-NC 組細胞吸光值明顯高于sh MNX1-AS1 組（P ＜0.05）。見表2。

表2 敲低MNX1-AS1 表達對細胞生長的影響（=3）

表2 敲低MNX1-AS1 表達對細胞生長的影響（=3）

2.3 miR-744-5p 過表達對細胞生長的影響 細胞培養(yǎng)至48 h 后，NC mimics組細胞吸光值明顯高于 miR-744-5p mimics 組（P ＜0.05）。見表3。

表3 過表達miR-744-5p 對細胞生長的影響（=3）

表3 過表達miR-744-5p 對細胞生長的影響（=3）

2.4 敲低MNX1-AS1 表達對喉癌細胞遷移能力的影響 與sh NC 組相比，sh MNX1-AS1 組細胞遷移數(shù)量明顯減少（P ＜0.05）。見封二彩圖7。

2.5 miR-744-5p 過表達對喉癌細胞遷移能力影響 與NC mimics 組相比，miR-744-5p mimics 組細胞遷移數(shù)量明顯減少（P ＜0.05）。見封二彩圖8。

圖8 過表達miR-744-5p 對喉癌細胞遷移能力的影響

2.6 LncRNA MNX1-AS1與miR-744-5p靶向調(diào)節(jié)關(guān)系 生物信息學(xué)顯示miR-744-5p 具有LncRNA MNX1-AS1潛在結(jié)合序列。與NC mimic 和MNX1-AS1 WT 共轉(zhuǎn)染組相比，miR-744-5p mimic 和MNX1-AS1 WT 共轉(zhuǎn)染組細胞熒光素酶活性降低（P ＜0.05）。同時，MNX1-AS1Mut轉(zhuǎn)染細胞的熒光素酶活性無變化（P ＞0.05）。sh-MNX1-AS1 組細胞中miR-744-5p 的表達比sh-NC 細胞中表達增加（P ＜0.05）。與NCmimics 組相比，miR-744-5p mimics 組中SH3BGRL3 蛋白表達水平明顯降低（P ＜0.05）。見圖2。

圖2 LncRNA MNX1-AS1 與miR-744-5p 靶向調(diào)節(jié)關(guān)系

2.7 MNX1-AS1/miR-744-5p/SH3BGRL3軸對喉癌細胞生長的影響 細胞培養(yǎng)至72h后，與NCinhibitor組相比，miR-744-5p inhibitor 組細胞吸光度高于miR-744-5p inhibitor 組（P ＜0.05）；miR-744-5p inhibitor+sh SH3BGRL3 組吸光度低于miR-744-5p inhibitor 組，但高于NC inhibitor 組（P ＜0.05）。見表4。

表4 MNX1-AS1/miR-744-5p/SH3BGRL3 軸在喉癌細胞中的作用（=3）

表4 MNX1-AS1/miR-744-5p/SH3BGRL3 軸在喉癌細胞中的作用（=3）

2.8 MNX1-AS1/miR-744-5p/SH3BGRL3軸對喉癌細胞遷移的影響 與NC inhibitor組相比，miR-744-5p inhibitor組遷移細胞數(shù)量增加（P ＜0.05）；miR-744-5p inhibitor+shSH3BGRL3組遷移細胞數(shù)量少于miR-744-5pinhibitor 組，多于NC inhibi tor 組（P ＜0.05）。見封三彩圖1。

圖1 MNX1-AS1/miR-744-5p/SH3BGRL3 軸對喉癌細胞遷移的影響（＊＜0.05，＃＜0.05）

3 討論

喉癌是臨床常見的頭頸部腫瘤，臨床主張采用手術(shù)和保守治療方案治療喉癌患者[9]。在過去的幾十年里，隨著環(huán)境污染的加重、人口老齡化的趨勢，喉癌的發(fā)病及死亡狀況不容樂觀[10]。因此，尋找特異、有效的喉癌腫瘤標志物已成為喉癌研究的熱點之一。近年來，越來越多的研究表明，lncRNA異常表達在腫瘤的研究中取得了較大進展，其具有成為診斷和治療腫瘤的標志物的潛質(zhì)[11-12]。

本研究結(jié)果表明細胞轉(zhuǎn)染成功且穩(wěn)定。MNX1-AS1 是運動神經(jīng)元和胰腺同源框蛋白1 及基因的反義RNA，已被多項研究證明是多種人類惡性腫瘤的致癌基因[13]。例如過表達MNX1-AS1 促進體外肝內(nèi)膽管癌細胞的增殖、遷移和侵襲[14]。有研究表明，MNX1-AS1 在宮頸癌和肺癌組織以及細胞系中均明顯表達上調(diào)[15-16]，這與本研究結(jié)果基本一致。此外，本研究通過一系列體外細胞功能試驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)，敲低MNX1-AS1 表達抑制喉癌細胞生長和遷移能力。LncRNA 可以通過表觀遺傳水平、轉(zhuǎn)錄及轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控基因表達，是近年來研究非編碼RNA 的熱點，特定lncRNA 表達的改變與喉癌的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[17-18]。既往研究顯示，敲低MNX1-AS1 表達抑制卵巢癌細胞增殖和遷移[19]，與本研究結(jié)果相似，說明MNX1-AS1 在喉癌中發(fā)揮致癌作用。

此外，lncRNA在位于細胞質(zhì)中時通常作為與miRNA結(jié)合的ceRNA而發(fā)揮作用，調(diào)節(jié)多個靶基因的表達[20]。本研究發(fā)現(xiàn)過表達miR-744-5p 可以抑制喉癌細胞增殖和遷移能力。越來越多的研究表明，miRNA在喉癌中表達上調(diào)或下調(diào)，發(fā)揮促癌或者抗癌作用。既往研究顯示，過表達miR-744-5p 可以抑制膀胱癌細胞增殖、遷移和侵襲，而抑制miR-744-5p 則起相反的作用[21]。結(jié)合本研究結(jié)果表明，miR-744-5p 在喉癌細胞中低表達，并且發(fā)揮癌基因作用，過表達miR-744-5p可以阻止喉癌Hep-2 細胞生長和遷移的能力。同時，本研究探索了靶向MNX1-AS1 的miRNA發(fā)現(xiàn)miR-744-5p 是具有潛在結(jié)合序列的預(yù)測miRNA。隨后，本研究通過熒光素酶報告基因測定證實了miR-744-5p 靶標與MNX1-AS1 結(jié)合。另外，研究發(fā)現(xiàn)敲低MNX1-AS1 表達可以上調(diào)miR-744-5p 在Hep-2 細胞中的表達，而過表達miR-744-5p 可以下調(diào)SH3BGRL3蛋白在Hep-2 細胞中表達。SH3BGRL3是硫氧還蛋白超基因家族的成員，被稱為腫瘤壞死因子抑制蛋白[22]。本研究結(jié)果顯示，與NC inhibitor 組相比，miR-744-5p inhibitor 組細胞吸光度值、遷移細胞數(shù)量高于miR-744-5pinhibitor 組；miR-744-5pinhibitor+shSH3BGRL3 組吸光度值、遷移細胞數(shù)量低于miR-744-5pinhibitor組，但高于NCinhibitor組。這些研究結(jié)果證明MNX1-AS1 敲低的作用可以通過miR-744-5p 的下調(diào)來逆轉(zhuǎn)，而SH3BGRL3的敲低則消除了這種可逆作用。MNX1-AS1 可能通過miR-744-5p/SH3BGRL3 軸促進喉癌的發(fā)展過程，MNX1-AS1 可能成為治療喉癌的潛在靶點。