一起犢牛腹瀉病的病原學(xué)診斷

沈思思

（黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)分院，黑龍江 齊齊哈爾 161000）

犢牛腹瀉是犢牛常見疾病，也是養(yǎng)牛業(yè)經(jīng)濟損失的主要原因。引起犢牛腹瀉因素主要包含病毒和細菌，常見病毒主要包括：冠狀病毒(BCoV)、輪狀病毒(RV)、牛病毒性腹瀉病毒(BVDV)等，常見細菌主要包括：大腸桿菌(ETEC)和沙門氏菌(Salmonella)等。這些病原體的臨床癥狀和病理剖檢相似，確診需結(jié)合實驗室檢測。本試驗旨在采用PCR方法對犢牛腹瀉樣本進行檢測，了解我市某牛場犢牛腹瀉的病因，從而進一步控制疾病的發(fā)生，為研究犢牛腹瀉奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 病料采集

無菌采集1月齡發(fā)病犢牛肛拭子樣本18份。

1.2 主要儀器與試劑

DNA、RNA試劑盒購自北京世紀元亨動物防疫技術(shù)有限公司；cDNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒、DNA MarkerⅡ、Taq酶均購自寶生物工程（大連）有限公司；離心機（TGL-16G）購自上海安亭科學(xué)儀器廠產(chǎn)品；PCR儀（S1000）購自美國伯樂公司產(chǎn)品；凝膠成像儀（WD-9413B）購自北京六一儀器廠產(chǎn)品。

1.3 引物信息與參考毒株

RV、BCoV、BVDV、沙門氏菌和大腸桿菌引物信息見表1。RV陽性樣本、BCoV陽性樣本、BVDV陽性樣本和沙門氏菌分離株、大腸桿菌分離株均由黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)分院實驗室保存。

表1 引物信息

1.4 方法

1.4.1 病料處理與核酸提取

將18份肛拭子樣本用PBS緩沖液稀釋均勻，12000r/min離心5min，取上清液。按照RNA和DNA試劑盒說明書提取RNA和DNA，-20℃保存。將RNA用反轉(zhuǎn)錄試劑盒反轉(zhuǎn)錄成cDNA，-20℃保存。

1.4.2 PCR擴增

用輪狀病毒、牛冠狀病毒、牛病毒性腹瀉病毒、沙門氏菌和大腸桿菌引物分別對18份肛拭子樣本的cDNA和DNA模板進行PCR擴增。反應(yīng)體系為25μL：cDNA 2.0μL，2×Taq PCR Master Mix12.5μL，上、下游引物1.0μL，ddH2O補足至25μL。PCR擴增條件：95℃5min,95℃30,52℃45s，72℃45s，循環(huán)30次，72℃10min。取擴增產(chǎn)物5μL在1%瓊脂糖凝膠板上點樣，電泳15min，凝膠成像儀上觀察結(jié)果。送生物工程（上海）股份有限公司測序。

2 結(jié)果與分析

2.1 PCR擴增結(jié)果

PCR結(jié)果見圖1～圖2，分別擴增出RV 231bp和ETEC 498bp的兩條條帶。測序結(jié)果顯示，RV與Bank登錄序列同源性為100%，大腸桿菌K99同源性為98%。

圖1 RV PCR擴增圖

2.2 陽性檢出率與混合感染情況

18份樣本中檢測出RV陽性樣本5份，陽性率為27.7%；大腸桿菌K99陽性樣本9份，陽性率為50%?；旌细腥韭蕿?00%。

3 結(jié)論

我們采集了該牛場18份腹瀉肛拭子，提取DNA和RNA，并對犢牛常見腹瀉病因輪狀病毒、牛冠狀病毒、牛病毒性腹瀉病毒、沙門氏菌和產(chǎn)腸毒素大腸桿菌（ETEC）進行PCR檢測，結(jié)果表明該牛場腹瀉病主要由輪狀病毒和致病性大腸桿菌K99混合感染所致，并且混合感染率為100%。

4 討論

輪狀病毒具有高度傳染性，對消毒劑有對抗性。50%～100%的牛表現(xiàn)出對RVA的免疫反應(yīng)。1～3周的犢牛最易感，感染率隨年齡的增加而下降。新生犢?？杀荒概Ｅ懦龅牟《靖腥?，感染犢牛從第二天開始通過糞便排出病毒，這種排出可持續(xù)7～8天。RV通常影響新生犢牛，3個月以上的犢牛通常不受影響。感染犢牛通常會導(dǎo)致嚴重腹瀉甚至危機生命。

RV的發(fā)病機制和嚴重程度通常受初乳攝入量、犢牛的日齡、健康狀況、母牛的免疫狀態(tài)和病毒的毒力影響。母牛在分娩前接受兩次疫苗接種刺激特異性抗體產(chǎn)生，犢牛在出生后6小時內(nèi)接受2～3升的初乳，通過初乳產(chǎn)生被動免疫來抵抗疾病的發(fā)生。