非洲豬瘟檢測方法研究進展

劉厚榮，張 強，錢 明

（1.上海海關學院檢驗檢疫技術(shù)交流部，上海 201204；2.上海海關動植物與食品檢驗檢疫技術(shù)中心，上海 200003）

非洲豬瘟（African swine fever，ASF）是由非洲豬瘟病毒（ASFV）感染而引發(fā)的一種只在家豬和野豬中傳播的發(fā)病快、病程短、病死率高達100%的接觸性傳染病，是世界動物衛(wèi)生組織（Office international desépizooties，OIE）規(guī)定的法定報告動物疫病，也是我國重點監(jiān)控防范的一類動物疫病[1]。該病于1921年在非洲肯尼亞被首次報道，隨后流傳至西歐及拉美國家。我國于2018年8月確診首例非洲豬瘟病例，隨后在全國呈爆發(fā)性流行傳播，給我國生豬產(chǎn)業(yè)帶來沉重打擊[2]。

ASF疫苗開發(fā)過程中滅活或亞單位疫苗難以誘導中和抗體，減毒疫苗雖最具開發(fā)潛力，但也面臨難以通過傳代途徑獲得安全有效的弱毒疫苗，疫苗開發(fā)工作仍在安全性、有效性、生產(chǎn)工藝、生產(chǎn)成本等諸多方面存在問題[3]。“隔離—撲殺—銷毀—消毒”是目前阻斷ASFV傳播重要方式，因此，快速精準的檢測手段是非洲豬瘟防控的關鍵措施[4]。本文總結(jié)了國內(nèi)外對ASF檢測技術(shù)的最新進展，以期為ASF的高效診斷提供參考。

1 ASFV分離和豬紅細胞吸附檢測

ASFV分離結(jié)合豬紅細胞吸附檢測（HAD）是OIE推薦的檢測金標準之一，HAD測試的陽性結(jié)果被認定為是ASF感染診斷的決定性因素。然而，該技術(shù)也由于原代培養(yǎng)細胞對檢測過程的高技術(shù)標準要求，操作過程中易于出現(xiàn)假陰性，且檢測反應耗時長，目前通常被作為其他檢測方式的輔助診斷。近年來，針對該技術(shù)的細胞培養(yǎng)技術(shù)有了很大提升，Do和Nguyen[5]通過比較評估可用的細胞系與各種培養(yǎng)基因子確定用于復制ASFV的候選商業(yè)細胞系，大大提高了HAD檢測結(jié)果的可靠性。

2 基于分子生物學的檢測方法

ASFV基因組約為170～194 kb，編碼150余個潛在基因[6]。ASF分子生物學檢測方法主要基于ASFV的保守且特異的基因序列，通過特定基因擴增，分析檢測目標序列片段。分子生物學檢測手段以其準確高效的特點而被檢測人員所青睞。

2.1 聚合酶鏈式反應（PCR）

PCR檢測方法是OIE推薦的ASF診斷方式之一，具有靈敏度高、特異性強和檢測快捷的優(yōu)點。目前，大部分診斷用引物通常是根據(jù)p72的B646L基因的保守區(qū)設計的。近年來，優(yōu)于OIE推薦引物檢測結(jié)果而具有更高特異性、敏感性的p72蛋白基因PCR檢測方式也在不斷更新建立[7]。

2.2 實時熒光定量PCR（qRT-PCR）

qRT-PCR基于其高靈敏度、高準確性而被廣泛用于ASFV的檢測。最近的qRT-PCR技術(shù)優(yōu)化主要體現(xiàn)在更高靈敏度和較短的檢測時間方面。Wang等[8]使用凍干粉試劑建立的qRT-PCR從標本處理到結(jié)果報告只需2小時即可完成。此外，任名等[9]建立的以ASFV p72基因為靶標的檢測方法，比普通PCR方法靈敏度高100倍。

2.3 微滴數(shù)字PCR

ddPCR技術(shù)是近年來新興的一種定量檢測技術(shù)，不同于qRT-PCR依賴于標準曲線和Ct值的“相對定量”方式，ddPCR可實現(xiàn)單分子水平上的“絕對定量”檢測，極大地提高了對微量樣品檢測的敏感性和準確性。ddPCR技術(shù)基于其極高的敏感度和準確性更加適用于ASFV的早期微量檢測，在ASFV早期防控及流調(diào)溯源、食品加工、食品銷售等各痕量檢測環(huán)節(jié)展現(xiàn)了獨特優(yōu)勢[10]。

2.4 恒溫擴增技術(shù)

恒溫擴增技術(shù)是一種在等溫下進行的PCR反應，無需經(jīng)過高溫變性低溫退火等溫度變化步驟，無需PCR儀，擴增產(chǎn)物也無需電泳檢測，只在一個恒溫器中便可完成所有反應，在現(xiàn)場快檢工作中具有十分廣闊的應用前景。

2.4.1 環(huán)介導等溫擴增法（LAMP）

LAMP技術(shù)在鏈置換DNA聚合酶的作用下，核酸可在60℃～65℃恒溫下擴增約15～60分鐘，最后根據(jù)生成產(chǎn)物的渾濁度判定檢測結(jié)果，具有靈敏度高、操作簡便的優(yōu)點。最近有研究將產(chǎn)物與熒光染料相結(jié)合，建立了易于觀察鑒定檢測結(jié)果的ASFV實時熒光LAMP快速檢測方法[11]。

2.4.2 交叉引物擴增技術(shù)（CPA）

CPA與LAMP有著“異曲同工”之妙，二者都是通過多個引物設計在恒溫狀態(tài)下對目標基因進行擴增。CAP的特點在于針對目的基因4個或5個區(qū)域設計4條或者5條特異性引物，利用具有鏈置DNA聚合酶在63℃左右條件下進行高效特異地基因擴增。Gao等[12]基于交叉引物擴增技術(shù)結(jié)合免疫層析條開發(fā)了適用于ASFV的現(xiàn)場檢測方法（CPA-strip），進一步加強了CAP檢測的簡便化。

2.4.3 重組酶聚合酶等溫擴增技術(shù)（RPA）

RPA技術(shù)主要依賴于三種功能蛋白：結(jié)合單鏈核酸的重組酶、單鏈DNA結(jié)合蛋白和鏈置換DNA聚合酶，該技術(shù)的最佳反應溫度在37℃左右，檢測方法靈敏快速且操作簡單。最近建立的RPA方法以及結(jié)合RPA技術(shù)與側(cè)流層析試紙條是ASFV檢測qRT-PCR有前途的替代方案[13]。

2.4.4 CRISPR等溫擴增技術(shù)（CRISPR-AMP）

CRISPR-AMP是近年來新興的基因檢測技術(shù)，相比于傳統(tǒng)PCR和其他等溫擴增技術(shù)，CRISPR-AMP技術(shù)具有靈敏度高、抗干擾性強、普適性的特點。Bai等[14]構(gòu)建的結(jié)合重組酶輔助擴增和CRISPR/Cas12a的系統(tǒng)可在37℃環(huán)境中，一小時內(nèi)以飛摩爾級的靈敏度識別ASFV靶標，該系統(tǒng)的檢測試劑可被凍干到三個試管中，并在4℃儲存至少7天時保持相同的靈敏度便于現(xiàn)場持續(xù)使用。

2.5 生物傳感器

生物傳感器是近年來新興的一種將傳統(tǒng)分子生物學信號轉(zhuǎn)變?yōu)闊晒獾纫讬z測判別信號的檢測技術(shù)。Biagetti等[15]利用DNA/LNA探針與目標DNA序列之間相互作用的可逆性質(zhì)構(gòu)建了允許進行多次快速分析的生物傳感器，該生物傳感器的結(jié)果與OIE推薦的qRT-PCR結(jié)果具有一致準確性。

2.6 多重PCR（mPCR）

mPCR是在普通PCR的反應體系中同時加入多種針對不同檢測對象的特異引物，從而實現(xiàn)在同一反應中對多個目標進行鑒定，具有省時省力的優(yōu)點。近期的研究表明，通過mPCR所建立的檢測體系不僅可用于檢測非洲豬瘟的單一感染，也可用于多種病原的混合感染，且檢測結(jié)果與單一PCR檢測結(jié)果一致[16]。

3 基于血清學的檢測方法

血清學診斷方法基于其簡單、成本相對較低、對專用設備要求不高的優(yōu)勢，是目前ASFV常用的診斷檢測方式之一。ASFV的血清學檢測包括抗原檢測和抗體檢測，但抗原檢測的方法對檢測條件要求更為嚴格。由于目前尚無針對ASFV而推廣應用的商業(yè)化疫苗，患病個體感染ASFV后并不能徹底中和抗體，因此，ASFV抗體的陽性檢測結(jié)果可直接表明病毒的感染，然而，有些患病個體也會出現(xiàn)發(fā)病十分迅速，還未產(chǎn)生抗體而病死，因此基于抗體的檢測方法一般需要結(jié)合其他檢測手段一并診斷。

3.1 抗體檢測方法

3.1.1 酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）

ELISA是OIE推薦首選的ASFV血清學檢測手段，其原理基于ASFV抗原性的結(jié)構(gòu)蛋白為包被抗原而建立的間接檢測方式，是目前應用廣泛的血清學檢測方法。近年來，多種不同抗原包被的檢測方式被開發(fā)出來[17-18]。

3.1.2 免疫印跡（IBT）

IBT主要利用抗原-抗體的特異性反應，從蛋白混合物中檢測出目標蛋白，從而定量或定性地確定檢測樣品中目標蛋白的存在情況，該技術(shù)融合了血清學技術(shù)與蛋白質(zhì)電泳分析方法，具有靈敏度高的特點。Kazakova等[19]基于原核重組表達建立的p30免疫印跡測試系統(tǒng)特異性和靈敏度分別為98.75%和100%。

3.1.3 膠體金免疫層析技術(shù)（GICA）

GICA技術(shù)較之OIE推薦的ELISA、PCR或qRT-PCR技術(shù)，具有操作靈活不受檢測儀器限制的優(yōu)勢，非常適用于現(xiàn)場快速篩查。近期，有研究建立的交叉引物擴增-診斷試紙聯(lián)用免疫層析條及免疫金試紙條不僅具有診斷快速、靈敏度強、結(jié)果準確的特點，其痕量檢出效果也十分明顯[20]。

3.2 抗原檢測方法

3.2.1 熒光抗體試驗（FAT）

FAT是常用的抗原檢測方法之一，也是OIE推薦的ASFV檢測技術(shù)，其原理是基于熒光物標記抗體來實現(xiàn)對待測樣品中相應抗原的鑒定，該技術(shù)具有快速、靈敏度高、特異性強的優(yōu)點。有研究者[21]使用多重熒光微珠免疫分析建立的間接ELISA，對于在ASFV流行地區(qū)低毒力ASFV分離株檢測具有高特異性。

3.2.2 側(cè)向流動免疫色譜分析（LFIA）

LFIA是一種將免疫標記技術(shù)和色譜層析技術(shù)相結(jié)合的固相膜免疫分析技術(shù)，該方法主要借助標記物獲得可測量的信號來分析鑒定結(jié)果。近年來基于ASFV p72基因所建立的LFIA檢測方法展示出了特異性高、快速、易于判讀的檢測結(jié)果[22]。

3.2.3 雙抗夾心ELISA（ELISA-double sandwich method）

雙抗夾心ELISA的技術(shù)特點在于經(jīng)兩步抗原或抗體的識別，通過被酶標記的間接抗原或抗體催化底物擴大顯色反應，根據(jù)呈色的深淺進行定性或定量分析，具有高敏感度的特點。Hutchings和Ferris[23]對比分析了兩種用于ASF診斷的間接夾心ELISA的檢測效果，結(jié)果表明兩種測定法均顯示可檢測ASF病毒系統(tǒng)發(fā)育不同組的代表性野毒株的抗原。

4 小結(jié)與展望

2021年以來，我國共報告發(fā)生非瘟疫情14起，累計撲殺生豬0.36萬頭，ASFV防控形勢依舊十分嚴峻[24]。由于目前并沒有成熟的商業(yè)疫苗可以有效阻斷ASFV的傳播，因此高效可靠的病毒檢測方法仍是ASFV防控進而實現(xiàn)病毒清除的重要一環(huán)（表1）。在當前嚴峻的ASF疫情防控形勢下，為適應ASFV現(xiàn)場快速高通量檢測排查，應逐步擺脫如酶活、精密的檢測儀器、繁瑣的檢測步驟對檢測方法的束縛，朝著高效、高靈敏度、高特異性的方向進行研發(fā)，同時，還要注意到現(xiàn)場采樣環(huán)節(jié)中避免疫情擴散的取樣要求。為凈化ASFV在中國的傳播，應結(jié)合其傳染源、傳播途徑、易感群體各環(huán)節(jié)做好傳播阻斷，加強國外輸入風險把控，守衛(wèi)國門生物安全。