熟地黃對(duì)6-羥基多巴胺誘導(dǎo)的多巴胺能神經(jīng)細(xì)胞氧化應(yīng)激的影響

王家鵬 孫曉杰

(山東中醫(yī)藥高等?？茖W(xué)校 1中醫(yī)系，山東 煙臺(tái) 264199；2招生就業(yè)處)

帕金森病是一種神經(jīng)退行性疾病，其病理特征為腦黑質(zhì)致密區(qū)域多巴胺能神經(jīng)元缺失，神經(jīng)元缺失可誘導(dǎo)紋狀體多巴胺異常減少，誘導(dǎo)基底神經(jīng)節(jié)異常，進(jìn)而誘發(fā)行動(dòng)遲緩、平衡功能障礙、肢體僵硬等運(yùn)動(dòng)癥狀，氧化應(yīng)激被認(rèn)為是多巴胺能神經(jīng)細(xì)胞功能紊亂的重要原因〔1〕。目前常見(jiàn)的帕金森病治療藥物有多巴胺受體激動(dòng)藥、抗膽堿藥等，這些藥物多數(shù)為對(duì)癥治療，只能部分改善運(yùn)動(dòng)缺陷，且不能阻止病情進(jìn)展，研發(fā)有效藥物改善帕金森病備受關(guān)注〔2〕。熟地黃是玄參科植物地黃塊根經(jīng)過(guò)炮制加工而成，具有抗衰老、抗氧化、改善記憶力、調(diào)節(jié)免疫等作用〔3〕。有研究〔4〕顯示，熟地黃能夠緩解帕金森病模型大鼠異動(dòng)癥狀?，F(xiàn)階段尚不清楚熟地黃對(duì)6-羥基多巴胺(OHDA)誘導(dǎo)的多巴胺能神經(jīng)細(xì)胞的影響。本實(shí)驗(yàn)研究熟地黃對(duì)6-OHDA誘導(dǎo)的多巴胺能神經(jīng)細(xì)胞氧化應(yīng)激的影響和機(jī)制。

1 材料與方法

1.1材料 細(xì)胞：多巴胺能神經(jīng)細(xì)胞SH-SY5Y(貨號(hào)：258028)購(gòu)自寧波明舟生物科技有限公司。多巴胺能神經(jīng)細(xì)胞SH-SY5Y培養(yǎng)在含有10%胎牛血清的DMEM細(xì)胞培養(yǎng)液內(nèi)，細(xì)胞培養(yǎng)條件為37℃，飽和濕度，5% CO2培養(yǎng)箱。藥物：熟地黃(北京索萊寶科技有限公司，編號(hào)：DYS8270，規(guī)格：1 g)。試劑與儀器：6-OHDA(Sigma公司，美國(guó)，貨號(hào)：H4381-100MG)；p38MAPK激活劑Anisomycin(Sigma公司，美國(guó)，貨號(hào)：A5862-0.5ML)；兔抗p-p38MAPK抗體(Cell Signaling Technology公司，美國(guó)，貨號(hào)：4511)；活性氧(ROS)檢測(cè)試劑盒(北京百奧萊博科技有限公司，貨號(hào)：HR8786)；兔抗剪切的含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶(酶切Caspase)-3抗體(Abcam公司，美國(guó)，貨號(hào)：ab2302)；兔抗p38MAPK抗體(北京百奧萊博科技有限公司，貨號(hào)：YT820)；兔抗Ki-67抗體(Abgent公司，美國(guó)，貨號(hào)：A-AJ1427c)；丙二醛(MDA)檢測(cè)試劑盒(北京索萊寶科技有限公司，貨號(hào)：BC0020)；DMEM培養(yǎng)基(Sigma公司，美國(guó)，貨號(hào)：DF-042-B)；兔抗Bcl-2相關(guān)X蛋白(Bax)抗體(Abcam公司，美國(guó)，貨號(hào)：ab53154)；超氧化物歧化酶(SOD)檢測(cè)試劑盒(碧云天生物技術(shù)研究所，貨號(hào)：S0101S)；胎牛血清(浙江天杭生物科技股份有限公司，貨號(hào)：11011-8611)；乳酸脫氫酶(LDH)檢測(cè)試劑盒(碧云天生物技術(shù)研究所，貨號(hào)：C0017)；流式細(xì)胞儀(Becton，Dickinson and Company公司，美國(guó)，LSRFortessa X-20型)；酶標(biāo)儀(北京普凱瑞生物科技有限公司，SpectraMax iD5型)。

1.2分組及給藥方法 取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的多巴胺能神經(jīng)細(xì)胞，根據(jù)不同的實(shí)驗(yàn)需求接種到細(xì)胞培養(yǎng)板內(nèi)，24 h后，添加不同濃度的含藥培養(yǎng)液，對(duì)照組細(xì)胞培養(yǎng)液不添加任何藥物，6-OHDA組、熟地黃低劑量組、熟地黃中劑量組、熟地黃高劑量組、熟地黃高劑量+Anisomycin組細(xì)胞培養(yǎng)液中均添加100 μmol/L的6-OHDA〔5〕，同時(shí)熟地黃低、中、高劑量組細(xì)胞培養(yǎng)液中分別添加120、240、480 μmol/L的熟地黃，熟地黃高劑量+Anisomycin組細(xì)胞培養(yǎng)液中添加480 μmol/L的熟地黃和2 ng/ml的p38MAPK激活劑Anisomycin〔6〕。各組細(xì)胞培養(yǎng)24 h后進(jìn)行相關(guān)檢測(cè)。

1.3檢測(cè)指標(biāo)與方法 (1)CCK-8實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞增殖：多巴胺能神經(jīng)細(xì)胞按照每個(gè)孔內(nèi)4 000個(gè)細(xì)胞接種到96孔板內(nèi)，細(xì)胞培養(yǎng)24 h后，分別在每個(gè)孔內(nèi)添加10 μl CCK-8溶液，繼續(xù)孵育10 min，用酶標(biāo)儀測(cè)定波長(zhǎng)為450 nm的吸光度(OD)值，以O(shè)D值表示細(xì)胞增殖活性。(2)Western印跡檢測(cè)相關(guān)蛋白表達(dá)：多巴胺能神經(jīng)細(xì)胞按照每個(gè)孔內(nèi)接種5×104個(gè)細(xì)胞接種到24孔板內(nèi)，24 h后，用磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌細(xì)胞2次，添加含10%苯甲基磺酰氟(PMSF)的放射免疫沉淀(RIPA)溶液，放在冰上裂解，30 min后，在4℃條件下高速離心，收集蛋白上清，經(jīng)二喹啉甲酸(BCA)方法檢測(cè)蛋白濃度后，與2倍結(jié)合緩沖液混合煮沸5 min。在每個(gè)十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)上樣孔內(nèi)添加40 μg蛋白樣品，先以90 V的電壓電泳30 min后，再以120 V的電壓電泳1.5 h。以200 mA恒流轉(zhuǎn)膜1.5 h。將NC膜放置5%牛血清白蛋白溶液中封閉2 h。NC膜放在一抗溶液(p-p38MAPK、酶切Caspase-3抗體以1∶800稀釋，p38MAPK抗體以1∶1 500稀釋，Ki-67、Bax抗體以1∶1 000稀釋)中，4℃搖床過(guò)夜。NC膜放在1∶2 000稀釋后的二抗溶液內(nèi)，在室溫中結(jié)合2 h。ECL發(fā)光。Image J分析比較灰度值，以GAPDH校正。(3)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)凋亡：多巴胺能神經(jīng)細(xì)胞按照每個(gè)孔內(nèi)接種5×104個(gè)細(xì)胞接種到24孔板內(nèi)，24 h后，收集細(xì)胞，用PBS洗滌細(xì)胞2次，每個(gè)測(cè)定樣品取1×106個(gè)細(xì)胞，懸浮于500 μl的結(jié)合緩沖液中，分別添加5 μl的膜連蛋白(Annexin)V-FITC和碘化丙啶(PI)溶液，轉(zhuǎn)移至避光條件下結(jié)合20 min，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)凋亡變化。(4)ROS、MDA、SOD含量和培養(yǎng)液上清中LDH檢測(cè)：多巴胺能神經(jīng)細(xì)胞按照每個(gè)孔內(nèi)接種5×104個(gè)細(xì)胞接種到24孔板內(nèi)，24 h后，收集細(xì)胞和培養(yǎng)液上清，以ROS檢測(cè)試劑盒(CellROX Green熒光探針?lè)?、MDA檢測(cè)試劑盒(可見(jiàn)分光光度法)、SOD檢測(cè)試劑盒(黃嘌呤氧化法)分別測(cè)定細(xì)胞中ROS、MDA、SOD含量，ROS檢測(cè)結(jié)果以對(duì)照組為參照，分析其余各組ROS含量變化百分比；以LDH檢測(cè)試劑盒(比色法)測(cè)定培養(yǎng)液上清中LDH含量，步驟均按照試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS23.0軟件進(jìn)行單因素方差分析。

2 結(jié) 果

2.1熟地黃對(duì)多巴胺能神經(jīng)細(xì)胞增殖影響 與0 μmol/L(0.56±0.06)比較，120、240、480 μmol/L的熟地黃處理后多巴胺能神經(jīng)細(xì)胞增殖活性(0.51±0.08、0.49±0.06、0.47±0.07)沒(méi)有變化(P>0.05)；960、1 920 μmol/L熟地黃處理后多巴胺能神經(jīng)細(xì)胞增殖活性(0.40±0.06、0.32±0.04)顯著降低(P<0.05)。選擇對(duì)多巴胺能神經(jīng)細(xì)胞沒(méi)有毒性的120、240、480 μmol/L的熟地黃進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2.2熟地黃可抑制6-OHDA誘導(dǎo)的多巴胺能神經(jīng)細(xì)胞中p38MAPK信號(hào)激活 與對(duì)照組(0.15±0.03)比較，6-OHDA組多巴胺能神經(jīng)細(xì)胞中p-p38MAPK/p38MAPK表達(dá)量(0.89±0.09)顯著升高(P<0.05)；與6-OHDA組比較，熟地黃低、中、高劑量組表達(dá)量(0.63±0.05、0.41±0.03、0.29±0.02)逐漸顯著降低(P<0.05)；與熟地黃高劑量組比較，熟地黃高劑量+Anisomycin組表達(dá)量(0.45±0.06)顯著升高(P<0.05)。見(jiàn)圖1。

1～6：對(duì)照組、6-OHDA組、熟地黃低劑量組、熟地黃中劑量組、熟地黃高劑量組、熟地黃高劑量+Anisomycin組；同下圖圖1 各組多巴胺能神經(jīng)細(xì)胞中p38MAPK信號(hào) 相關(guān)蛋白表達(dá)

2.3熟地黃調(diào)控p38MAPK對(duì)6-OHDA誘導(dǎo)的多巴胺能神經(jīng)細(xì)胞增殖、凋亡影響 與對(duì)照組比較，6-OHDA組多巴胺能神經(jīng)細(xì)胞增殖活性顯著降低，凋亡率顯著升高(P<0.05)；與6-OHDA組比較，熟地黃低、中、高劑量組多巴胺能神經(jīng)細(xì)胞增殖活性逐漸顯著升高，凋亡率逐漸顯著降低(P<0.05)；與熟地黃高劑量組比較，熟地黃高劑量+Anisomycin組多巴胺能神經(jīng)細(xì)胞增殖活性顯著降低，凋亡率顯著升高(P<0.05)。見(jiàn)圖2，表1。

圖2 各組多巴胺能神經(jīng)細(xì)胞凋亡情況

表1 各組多巴胺能神經(jīng)細(xì)胞增殖活性和凋亡率及Ki-67、Bax、酶切Caspase-3蛋白表達(dá)量比較

2.4熟地黃調(diào)控p38MAPK對(duì)6-OHDA誘導(dǎo)的多巴胺能神經(jīng)細(xì)胞增殖、凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)影響 與對(duì)照組比較，6-OHDA組多巴胺能神經(jīng)細(xì)胞中Ki-67蛋白表達(dá)量顯著降低，Bax、酶切Caspase-3蛋白表達(dá)量顯著升高(P<0.05)；與6-OHDA組比較，熟地黃低、中、高劑量組多巴胺能神經(jīng)細(xì)胞中Ki-67蛋白表達(dá)量逐漸顯著升高，Bax、酶切Caspase-3蛋白表達(dá)量逐漸顯著降低(P<0.05)；與熟地黃高劑量組比較，熟地黃高劑量+Anisomycin組多巴胺能神經(jīng)細(xì)胞中Ki-67蛋白表達(dá)量顯著降低，Bax、酶切Caspase-3蛋白表達(dá)量顯著升高(P<0.05)。見(jiàn)表1，圖3。

2.5熟地黃調(diào)控p38MAPK對(duì)6-OHDA誘導(dǎo)的多巴胺能神經(jīng)細(xì)胞氧化應(yīng)激影響 與對(duì)照組比較，6-OHDA組多巴胺能神經(jīng)細(xì)胞中SOD含量顯著降低，ROS、MDA含量顯著升高，培養(yǎng)液上清中LDH含量升高(P<0.05)；與6-OHDA組比較，熟地黃低、中、高劑量組多巴胺能神經(jīng)細(xì)胞中SOD含量逐漸顯著升高，ROS、MDA含量逐漸顯著降低，培養(yǎng)液上清中LDH含量逐漸顯著降低(P<0.05)；與熟地黃高劑量組比較，熟地黃高劑量+Anisomycin組多巴胺能神經(jīng)細(xì)胞中SOD含量顯著降低，ROS、MDA含量顯著升高，培養(yǎng)液上清中LDH含量顯著升高(P<0.05)。見(jiàn)表2。

圖3 各組各組多巴胺能神經(jīng)細(xì)胞中增殖和凋亡 相關(guān)蛋白表達(dá)

表2 各組多巴胺能神經(jīng)細(xì)胞中ROS、MDA、SOD含量和培養(yǎng)液上清中LDH含量比較

3 討 論

帕金森病屬于神經(jīng)退行性疾病，多發(fā)生于中老年人，也是中老年殘疾的重要誘因〔7〕。帕金森病常見(jiàn)病理變化為腦黑質(zhì)致密帶多巴胺神經(jīng)細(xì)胞脫落、缺失，目前尚不清楚帕金森病發(fā)生的原因，遺傳因素、興奮性因素、自身免疫因素、氧化應(yīng)激、環(huán)境因素等均與其有關(guān)，其中氧化應(yīng)激因素研究最多〔8,9〕。6-OHDA是常見(jiàn)的體外構(gòu)建帕金森病細(xì)胞模型的誘導(dǎo)因子〔10〕。帕金森病條件下，多巴胺能神經(jīng)細(xì)胞中合成大量ROS，這些ROS不能被抗氧化酶SOD等及時(shí)清除，誘導(dǎo)ROS聚集，而過(guò)量的ROS可促進(jìn)脂質(zhì)發(fā)生過(guò)氧化，生成MDA；脂質(zhì)是細(xì)胞膜的重要組成部分，其過(guò)氧化后可誘導(dǎo)細(xì)胞膜完整性破壞，導(dǎo)致原本多存在于細(xì)胞內(nèi)的LDH釋放至細(xì)胞外，因此檢測(cè)MDA、LDH水平可間接反映氧化應(yīng)激水平〔11,12〕。過(guò)量的ROS還可以激活細(xì)胞凋亡蛋白如Bax、酶切Caspase-3，促進(jìn)細(xì)胞凋亡發(fā)生〔13〕。Ki-67是細(xì)胞增殖標(biāo)志蛋白，其表達(dá)變化與細(xì)胞增殖水平有關(guān)〔14〕。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，6-OHDA誘導(dǎo)多巴胺神經(jīng)細(xì)胞氧化應(yīng)激，激活細(xì)胞凋亡，成功構(gòu)建了體外帕金森病細(xì)胞模型。

熟地黃是常見(jiàn)中藥材，具有滋陰補(bǔ)腎的功效，現(xiàn)代藥理學(xué)證明熟地黃有調(diào)節(jié)免疫力、改善骨質(zhì)疏松、降血糖、抗衰老、抗氧化、改善腎功能等作用〔15〕。熟地黃對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)有保護(hù)作用，可以抑制阿爾茨海默病大鼠海馬神經(jīng)細(xì)胞損傷，減少Caspase-3活化〔16〕；熟地黃治療后的注意缺陷多動(dòng)障礙大鼠神經(jīng)元發(fā)育明顯改善〔17〕。熟地黃對(duì)帕金森病可能有治療功效，復(fù)方地黃處理后的帕金森病動(dòng)物模型運(yùn)動(dòng)障礙癥狀減輕〔18〕；熟地黃處理后的MPP+誘導(dǎo)的神經(jīng)細(xì)胞凋亡減少，Bax和酶切Caspase-3蛋白表達(dá)減少〔19〕。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果說(shuō)明熟地黃能夠減輕6-OHDA誘導(dǎo)的多巴胺能神經(jīng)細(xì)胞氧化應(yīng)激，進(jìn)而減少細(xì)胞凋亡，與以前的研究報(bào)道結(jié)果一致〔12〕，均提示熟地黃可能是帕金森病治療的有效藥物。

熟地黃作用機(jī)制與信號(hào)途徑的轉(zhuǎn)導(dǎo)有關(guān)〔20〕。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，熟地黃處理可降低多巴胺能神經(jīng)細(xì)胞中p38MAPK磷酸化水平，熟地黃作用機(jī)制可能與p38MAPK有關(guān)。p38MAPK是MAPK信號(hào)通路的重要分支，在細(xì)胞增殖、氧化應(yīng)激、細(xì)胞凋亡、細(xì)胞衰老、炎癥、能量代謝過(guò)程中發(fā)揮作用〔21〕。有研究〔22〕表明，p38MAPK在帕金森病進(jìn)展中過(guò)度激活，p38MAPK具有促進(jìn)帕金森病發(fā)生的作用。p38MAPK在6-OHDA誘導(dǎo)的多巴胺能神經(jīng)細(xì)胞中過(guò)度磷酸化，且抑制p38MAPK可改善多巴胺能神經(jīng)細(xì)胞損傷〔23〕。本文以p38MAPK激活劑進(jìn)一步驗(yàn)證熟地黃的作用機(jī)制，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，p38MAPK激活劑能夠逆轉(zhuǎn)熟地黃對(duì)6-OHDA誘導(dǎo)的多巴胺能神經(jīng)細(xì)胞增殖、凋亡和氧化應(yīng)激的作用，提示熟地黃通過(guò)抑制p38MAPK信號(hào)發(fā)揮作用。

綜上，熟地黃可能是帕金森病治療的潛在藥物，其能夠通過(guò)抑制p38MAPK信號(hào)改善6-OHDA誘導(dǎo)的多巴胺能神經(jīng)細(xì)胞氧化應(yīng)激，進(jìn)而減少細(xì)胞凋亡。關(guān)于熟地黃通過(guò)何種具體靶向機(jī)制影響p38MAPK信號(hào)進(jìn)而發(fā)揮作用還有待進(jìn)一步研究。