郭建行,賈頌華,李博潤(rùn),李珊珊,冀曉龍,2,3*,劉延奇,2,3*
(1.鄭州輕工業(yè)大學(xué)食品與生物工程學(xué)院,河南 鄭州 450001;2.食品生產(chǎn)與安全河南省協(xié)同創(chuàng)新中心,河南 鄭州 450001;3.河南省冷鏈?zhǔn)称焚|(zhì)量安全控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,河南 鄭州 450001)
地球表面大約70% 的面積被海洋覆蓋,海洋中擁有豐富的海洋生物資源。大型藻類(lèi)是其中之一,被人們廣泛利用的主要有紅藻門(mén)、褐藻門(mén)以及綠藻門(mén)三大類(lèi)[1],在生產(chǎn)上具有很高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值和發(fā)展?jié)摿2-3]。紅海藻(Bangia fusco-purpurea)主要生長(zhǎng)在太平洋和大西洋的亞熱帶和溫帶海域,廣泛分布于我國(guó)福建等沿海地區(qū)。紅藻種類(lèi)繁多,包括紫菜、麒麟菜、石花菜、角叉菜、龍須菜、江蘺、馬尾藻等屬植物,紅海藻含有豐富的營(yíng)養(yǎng)成分,是海藻中營(yíng)養(yǎng)價(jià)值最高的天然水產(chǎn)之一[4]。據(jù)農(nóng)業(yè)百科全書(shū)記載,紅海藻是一種兼具藥食兩用價(jià)值的物質(zhì),具有滋陰?kù)罨鸺邦A(yù)防疾病等作用[5],是一種暢銷(xiāo)的海洋綠色植物。紅海藻中含有許多生物活性成分,如多酚、黃酮、多糖、多種維生素(VA、VC、VE等)、多不飽和脂肪酸等[6-8]。
近年來(lái),對(duì)于紅海藻的研究主要集中在多酚、黃酮等活性物質(zhì),但隨著糖化學(xué)和糖生物學(xué)技術(shù)的快速發(fā)展,紅海藻多糖也逐漸成為國(guó)內(nèi)外學(xué)者研究的熱點(diǎn)。由于紅海藻多糖具有特殊的結(jié)構(gòu)特征和生物學(xué)特性,使其成為功能性食品和保健食品的來(lái)源;其生物活性主要包含抗氧化、免疫調(diào)節(jié)、抗病毒、抗癌和調(diào)節(jié)腸道菌群等[2,9-10]。紅海藻多糖的生物活性與其理化結(jié)構(gòu)密切相關(guān);因此,研究紅海藻多糖的結(jié)構(gòu)特性是探索生物活性的基礎(chǔ)[11]。本文以紅海藻多糖的國(guó)內(nèi)外近期的研究成果為基礎(chǔ),綜述紅海藻多糖的提取、分離純化、理化性質(zhì)及結(jié)構(gòu)特征、生物活性的研究現(xiàn)狀,以期為紅海藻多糖構(gòu)效關(guān)系研究提供理論依據(jù),為進(jìn)一步開(kāi)發(fā)紅海藻多糖生物制品提供參考。
提取紅海藻多糖前需要對(duì)原料進(jìn)行預(yù)處理,即清洗紅海藻,對(duì)新鮮紅海藻進(jìn)行脫水干燥處理(常用的干燥方法有熱風(fēng)干燥、真空冷凍干燥、旋轉(zhuǎn)干燥以及輻射干燥[12]等),然后對(duì)干制品進(jìn)行粉碎過(guò)篩得紅海藻粉[13-14],紅海藻多糖的提取、純化、結(jié)構(gòu)特征及生物活性如圖1所示。
圖1 紅海藻多糖的提取、純化、結(jié)構(gòu)特征及生物活性示意圖Fig.1 Schematic diagram of extraction,purification,structural characteristics,and biological activity of polysaccharides from red seaweed
紅海藻的品種、生長(zhǎng)條件、提取條件以及提取方法等因素都會(huì)影響紅海藻多糖的提取率,甚至對(duì)多糖結(jié)構(gòu)生物活性產(chǎn)生一定的影響[2,15]。紅海藻多糖的提取方法有很多,主要包括溶劑浸提法(熱水浸提法、堿浸提法、酸浸提法)、酶輔助提取法、超聲輔助提取法、微波輔助提取法等,主要相關(guān)方法的原理及評(píng)價(jià)見(jiàn)表1。
表1 紅海藻多糖提取方法及評(píng)價(jià)Table 1 Extraction method and evaluation of red seaweed polysaccharides
提取的紅海藻粗多糖通常含有蛋白質(zhì)、色素以及小分子化合物等雜質(zhì),對(duì)多糖結(jié)構(gòu)分析和生物活性有較大的影響,所以雜質(zhì)的去除十分重要。去除紅海藻多糖中的蛋白質(zhì)通常采用Sevag法、三氯乙酸法、酶法。Sevag法除蛋白成本低、效果好,但經(jīng)過(guò)多次操作多糖損失大;三氯乙酸法操作簡(jiǎn)單,但是會(huì)破壞多糖結(jié)構(gòu);酶法除蛋白效果更好,雖不引入有機(jī)試劑,但耗時(shí)長(zhǎng)、成本高,不適用于工業(yè)生產(chǎn)[25]。當(dāng)紅海藻粗多糖有顏色時(shí),需要進(jìn)行脫色處理,常用的脫色方法有活性炭吸附法、過(guò)氧化氫氧化法、大孔樹(shù)脂吸附法。其中過(guò)氧化氫氧化法脫色效果最好,但須嚴(yán)格控制過(guò)氧化氫的用量,否則會(huì)導(dǎo)致多糖降解,目前應(yīng)用范圍較廣的脫色技術(shù)是樹(shù)脂吸附法[2,26]。對(duì)于多糖中的小分子化合物一般會(huì)采用膜分離技術(shù)[27],根據(jù)多糖分子量大小選取不同分子量截留膜,由于其操作簡(jiǎn)單,易獲得膜材料,能夠用于未來(lái)工業(yè)化生產(chǎn)。
為了得到純度更高的多糖,還需對(duì)紅海藻粗多糖做進(jìn)一步的分離純化,常用的分離純化方法主要有陰離子交換樹(shù)脂(DEAE Sepharose Fast Flow、DEAE Cellulose、DEAE Sephadex等)和凝膠過(guò)濾柱層析(Sephadex G、Sephacryl S、Sepharose CL等),它們是純化紅海藻多糖最有效的方法之一[28],最后用不同濃度梯度的NaCl進(jìn)行洗脫、收集、濃縮、透析、凍干得到純化的紅海藻多糖。Jiang等[29]采用Sephacryl S-400對(duì)提取的紅海藻多糖進(jìn)行純化得到均一的紅海藻多糖。Geng等[30]采用Sephadex G-200對(duì)提取的粗多糖進(jìn)行純化,得到兩種紅海藻多糖。通過(guò)柱層析純化可以獲得高純度的紅海藻多糖,能夠更進(jìn)一步地對(duì)紅海藻多糖結(jié)構(gòu)進(jìn)行解析,研究其生物學(xué)功能,以便深入挖掘紅海藻多糖構(gòu)效關(guān)系及其生物活性作用機(jī)理。
紅海藻多糖生物活性與結(jié)構(gòu)密切相關(guān),探究紅海藻多糖結(jié)構(gòu)對(duì)研究生物活性及潛在構(gòu)效關(guān)系具有十分重要意義。紅海藻多糖的理化和結(jié)構(gòu)特征主要包括單糖組成、分子量、糖苷鍵的類(lèi)型、糖苷鍵的構(gòu)型以及糖苷鍵的位置。目前主要采用化學(xué)分析、光譜分析以及色譜分析技術(shù)來(lái)確定多糖化學(xué)結(jié)構(gòu),包括甲基化分析、Smith降解、氣相色譜、液相色譜、凝膠色譜、核磁共振等。紅海藻多糖種類(lèi)、提取方法、分離純化方法都會(huì)對(duì)多糖結(jié)構(gòu)產(chǎn)生影響。
紅海藻多糖易溶于水,不溶于乙醇等有機(jī)試劑,純化后的多糖在260、280 nm處無(wú)紫外吸收峰,說(shuō)明不含蛋白質(zhì)和核酸,在紅外光譜下檢測(cè)出多糖特征吸收峰。
紅海藻多糖理化性質(zhì)及生物活性與其分子量密切相關(guān),通常采用高效液相凝膠色譜(high performance gel permeation chromatography,HPGPC) 結(jié)合多角度激光光散射折射率檢測(cè)器(multiangle laser light scattering-refractive index detector,MALLS-RID) 測(cè)定多糖分子量[31]。紅海藻多糖分子量一般分布在30kDa~610kDa,紅海藻多糖理化特性、化學(xué)結(jié)構(gòu)及藥理活性如表2所示[11,29,32-37]。
研究表明,一般植物多糖分子量在90 kDa以上時(shí),基本上都能形成三股螺旋結(jié)構(gòu)并具有生物活性[38]。測(cè)定紅海藻水溶性組分及堿溶性組分分子量分布在6 kDa~2 400 kDa,且不同濃度的多糖分子量分布在10 kDa~1400 kDa,分子量分布廣泛與多糖組分復(fù)雜程度以及多糖溶解度有關(guān)[39]。從紫菜中提取的多糖分子量分布在7.86 kDa~600 kDa[40],龍須菜多糖平均分子量為157 kDa[31],這些多糖分子量的差異可能是由于不同生長(zhǎng)環(huán)境因素、不同提取條件以及不同純化方式造成的。如超聲輔助提取馬尾藻多糖,經(jīng)過(guò)超聲處理后多糖分子量降低,這是因?yàn)殚L(zhǎng)時(shí)間超聲波輔助提取會(huì)破壞多糖的分子鏈,使多糖主鏈斷裂進(jìn)而導(dǎo)致分子量降低[41]。
表2 紅海藻多糖理化特性、化學(xué)結(jié)構(gòu)及藥理活性Table 2 Physicochemical properties,chemical structure,and pharmacological activity of red seaweed polysaccharides
多糖主要由單糖和糖醛酸組成,分析紅海藻多糖、單糖組成是研究結(jié)構(gòu)與生物活性的前提。紅海藻多糖經(jīng)過(guò)三氟乙酸水解糖苷鍵和衍生化后,通常用氣相色譜、高效液相色譜和質(zhì)譜技術(shù)聯(lián)用研究紅海藻多糖單糖組成。Malafronta等[42]采用不同的方式處理方式紅海藻多糖,研究發(fā)現(xiàn)經(jīng)過(guò)處理后果糖、半乳糖、木糖、甘露糖、葡萄糖醛酸含量下降,而甘露糖醛酸、半乳糖醛酸含量升高,表明經(jīng)過(guò)高壓均質(zhì)和超濾處理后單糖含量增多。Yu等[11]從不同海域收集提取紅海藻多糖,它們主要由半乳糖、葡萄糖、木糖、果糖、阿拉伯糖和甘露糖組成,但不同海域單糖含量比例不同。Cui等[34]對(duì)紅海藻多糖進(jìn)行純化,并對(duì)純化組分進(jìn)行單糖分析,研究發(fā)現(xiàn)中性糖主要由半乳糖和木糖組成。紅海藻多糖的單糖組成主要受多種因素影響,如不同來(lái)源、提取純化方法以及生長(zhǎng)條件等因素。
關(guān)于紅海藻多糖的一級(jí)結(jié)構(gòu)通常采用高碘酸氧化、甲基化、Smith降解、核磁共振技術(shù)來(lái)確定多糖骨架和分支結(jié)構(gòu)(表2)。另外采用DEAE-Cellulose離子交換色譜以及Sephacryl凝膠滲透色譜對(duì)紅海藻多糖進(jìn)行分離純化,利用甲基化反應(yīng)、紅外光譜、核磁共振技術(shù)對(duì)純化組分進(jìn)行結(jié)構(gòu)解析,推斷多糖主鏈以及重復(fù)單元。 LJP-11 主鏈主要包含 1,3,6-Manp、1,4-Glcp;LJP-12 主鏈主要包含 1,4-Manp、1-α-D-Galp、1,3,6-Manp、1,6-Glup;LJP-31 主鏈主要包含 1,3,6-Manp、1,4-Glcp、1-β-L-Araf、1-α-D-Glap、1,4-Manp[43-44]。Jiang等[29]采用Sephacryl-400分離純化紅海藻多糖,利用Smith降解、甲基化分析、高碘酸鹽氧化、核磁共振技術(shù)對(duì)純化組分進(jìn)行結(jié)構(gòu)解析,BFP主鏈主要由(1→3)-β-D-Galp、(1→3)-β-D-Galp6S-(1→ 4)-α-DGalp、(1→4)-α-D-Galp-(1→ 4)-α-L-Galp-(1 → 3)-β-D-Galp、(1→4)-α-D-Galp 組成。 采用強(qiáng)陰離子交換色譜和凝膠滲透色譜對(duì)海藻多糖進(jìn)行分離純化,對(duì)純化組分HP2S進(jìn)行主鏈結(jié)構(gòu)解析,HP2S主鏈主要由(1→2)-Rhap、(1→3)-Rhap 和(1→2,3)-Rhap 構(gòu)成,且硫酸根也位于碳鏈上組成硫酸化多糖[45]。通過(guò)研究紅海藻多糖的結(jié)構(gòu),以探索它們的構(gòu)效關(guān)系及生物差異是至關(guān)重要的。
植物多糖空間結(jié)構(gòu)復(fù)雜,現(xiàn)有關(guān)海藻多糖高級(jí)結(jié)構(gòu)研究主要有掃描電鏡、原子力顯微鏡、X-射線衍射等方法對(duì)多糖高級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行表征[46]。海藻多糖作為生物抑菌膜,在掃描電鏡下呈連續(xù)、無(wú)孔、光滑、無(wú)裂紋的形貌,且有擴(kuò)散寬的衍射峰,表明多糖形成的膜是高結(jié)晶度的非晶態(tài)性質(zhì)[47]。Lakshmi等[48]從海藻中提取的海藻多糖在掃描電鏡下呈現(xiàn)較小微孔的海綿狀結(jié)構(gòu),在X-射線衍射中有3個(gè)彌散峰。而且高濃度的多糖在原子力顯微鏡中呈現(xiàn)多個(gè)分子相互纏繞、折疊,形成緊密穩(wěn)定的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。多糖生物活性與空間結(jié)構(gòu)密不可分,對(duì)多糖高級(jí)結(jié)構(gòu)的研究有助于闡明多糖的構(gòu)效關(guān)系。
近年來(lái),隨著對(duì)紅海藻多糖研究的不斷深入,對(duì)其生物活性有了更全面的發(fā)現(xiàn),免疫調(diào)節(jié)、抗腫瘤、抗氧化、調(diào)節(jié)腸道菌群等生物活性對(duì)人類(lèi)健康有不同程度的促進(jìn)作用。
在生物體內(nèi)會(huì)產(chǎn)生各種活性氧自由基,導(dǎo)致細(xì)胞氧化損傷,從而導(dǎo)致機(jī)體各種疾病的發(fā)展,如心血管疾病、神經(jīng)性疾病、癌癥、腎臟疾病、動(dòng)脈硬化以及糖尿病等,這是由于過(guò)多的氧自由基破壞了活性氧水平和自由基清除之間的平衡[49]。植物中含有許多天然活性成分被篩選出來(lái)作為抗氧化劑,尤其是多糖,具有很高的抗氧化能力。
體外自由基清除試驗(yàn)是測(cè)定紅海藻多糖清除自由基能力的方法,包括ABTS+自由基清除率、DPPH自由基清除率、還原力、超氧陰離子自由基清除能力、鐵離子還原能力等都被用于測(cè)定紅海藻多糖抗氧化能力。Jaballi等[33]采用DPPH法測(cè)定從紅海藻多糖分離CCP組分的抗氧化能力,在濃度為2 mg/mL時(shí),紅海藻多糖分離組分具有幾乎和沒(méi)食子酸相同的抗氧化活性。從江蘺中提取純化的多糖組分對(duì)超氧陰離子自由基和ABTS+自由基具有很強(qiáng)的清除能力,IC50為2.5 mg/mL,同時(shí)還能抑制脂質(zhì)氧化[50]。從龍須菜中分離出不同組分的多糖,它們抗氧化能力和濃度呈正相關(guān),其中龍須菜多糖分離組分抗氧化活性最強(qiáng)。在體內(nèi)抗氧化實(shí)驗(yàn)中,以江蘺中分離出的硫酸多糖,對(duì)大鼠進(jìn)行腹腔注射,氧化應(yīng)激反應(yīng)有明顯效果,且各劑量均能提高過(guò)氧化氫酶和超氧化物歧化酶活性[51]。紅海藻多糖在體內(nèi)外都顯示出了良好的清除自由基能力,因此可以作為食品添加劑或功能性保健產(chǎn)品原料。
目前植物多糖發(fā)揮抗癌作用的機(jī)制是通過(guò)激活宿主免疫反應(yīng)發(fā)揮抗癌活性,誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋零,直接作用于癌細(xì)胞將其殺死或抑制其生長(zhǎng)[52]。He等[53]從條斑紫菜中分離出的兩種多糖PYP-20、PYP-50對(duì)正常人肝細(xì)胞HL-7702沒(méi)有毒性,但可以抑制Hep3B、HeLa和MDA-MB-231等癌細(xì)胞的增殖。朱正日等[54]探討海藻多糖對(duì)H22肝癌小鼠抗腫瘤作用機(jī)理時(shí)發(fā)現(xiàn)海藻多糖能夠抑制癌細(xì)胞生長(zhǎng),增強(qiáng)機(jī)體免疫能力,同時(shí)下調(diào)Bcl-2基因表達(dá),達(dá)到抑癌效果。通過(guò)對(duì)比分離后多糖的分子量及結(jié)構(gòu),發(fā)現(xiàn)低分子量多糖片段對(duì)腫瘤細(xì)胞的抑制效果最好。
紅海藻多糖具有獨(dú)特的生物活性,尤其是免疫調(diào)節(jié)活性,不僅可以保護(hù)相關(guān)免疫器官,還可以增強(qiáng)巨噬細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、自然殺傷細(xì)胞等免疫細(xì)胞功能[55]。巨噬細(xì)胞是主要的免疫細(xì)胞之一,主要通過(guò)吞噬功能發(fā)揮免疫活性。紅海藻多糖通過(guò)激活NF-κB和p38MAPK信號(hào)通路增強(qiáng)RAW264.7細(xì)胞的吞噬功能[56]。
研究發(fā)現(xiàn),紅海藻多糖的免疫調(diào)節(jié)活性與多糖分子量大小以及多糖取代度有關(guān)。從紅藻中提取純化了4 種多糖組分 PHPD-Ⅰ、PHPD-Ⅱ、PHPD-Ⅲ、PHPD-Ⅳ并對(duì)其進(jìn)行免疫活性比較,發(fā)現(xiàn)最低分子量組分(PHPD-Ⅳ)具有最高的免疫調(diào)節(jié)活性。對(duì)活性最高的組分PHPD-Ⅳ進(jìn)行純化,純化組分PHPD-Ⅳ-4能明顯上調(diào)ERK1/2、JNK和p38的磷酸化水平,并呈劑量依賴(lài)性[57]。利用硫酸鹽修飾龍須菜多糖可以顯著提高吞噬細(xì)胞RAW264.7的吞噬增殖能力,并通過(guò)激活誘導(dǎo)型一氧化氮合酶、白細(xì)胞介素-6和腫瘤壞死因子-α基因表達(dá),促進(jìn)活性氧、一氧化氮、白細(xì)胞介素-6和腫瘤壞死因子-α的產(chǎn)生[56]。綜上所述,紅海藻多糖的免疫調(diào)節(jié)能力主要是抑制MAPK、ERK1/2、NF-κB的活性,促進(jìn)細(xì)胞因子的分泌和巨噬細(xì)胞的吞噬作用來(lái)實(shí)現(xiàn)的,但是對(duì)紅海藻多糖的免疫活性與結(jié)構(gòu)的關(guān)系缺乏系統(tǒng)的研究。
長(zhǎng)期使用抗肥胖藥物會(huì)引起嚴(yán)重的副作用,如胃腸道不良反應(yīng)、肝腎功能損傷等,對(duì)身體產(chǎn)生嚴(yán)重危害[58]。因此,探索更加安全有效的藥物或功能性食品預(yù)防和治療肥胖已成為新的研究熱點(diǎn)。抑制脂質(zhì)的合成是有效的抗肥胖方法,高脂飲食會(huì)導(dǎo)致體重、體脂、膽固醇水平異常。在高脂食品中添加紅海藻多糖可以降低小鼠體重、肝臟脂肪以及血漿中膽固醇含量,多糖通過(guò)抑制SREBP-2和HMGR基因表達(dá),使膽固醇轉(zhuǎn)化為膽汁,從而抑制膽固醇合成;(1→4)-β-D-Glu 單元通過(guò)抑制甘油三酯轉(zhuǎn)移蛋白基因、肝臟脂肪酸結(jié)合蛋白基因以及腸道脂肪酸結(jié)合蛋白基因的表達(dá)來(lái)降低脂肪含量[59]。硫酸化海藻多糖和龍須菜多糖通過(guò)抑制α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶活性來(lái)達(dá)到抗肥胖作用[60]。將紅海藻多糖作為食品添加劑,研發(fā)抗肥胖和抗糖尿病的食品,以達(dá)到減脂的效果。
植物多糖通過(guò)調(diào)節(jié)腸道菌群結(jié)構(gòu)功能、維護(hù)腸道屏障完整性來(lái)改善腸道微生物菌群穩(wěn)定,并為機(jī)體提供能量以及代謝產(chǎn)物。紅海藻多糖在唾液、胃以及小腸中的消化系統(tǒng)中缺乏相應(yīng)的酶無(wú)法被消化吸收,但被盲腸和結(jié)腸中的微生物群代謝吸收[61]。短鏈脂肪酸是結(jié)腸細(xì)菌發(fā)酵代謝的主要產(chǎn)物,對(duì)宿主胃腸上皮細(xì)胞完整性、免疫功能、食欲調(diào)節(jié)和葡萄糖穩(wěn)態(tài)有重要影響。喂食高脂飼料小鼠體內(nèi)的短鏈脂肪酸水平顯著下降,而在添加紅海藻多糖時(shí)短鏈脂肪酸水平上升[62-63]。紅海藻多糖還能夠改善腸道微生物區(qū)系的組成和豐度,例如龍須菜中提取的硫酸化多糖能增加類(lèi)桿菌、雙歧桿菌、乳酸菌等有益菌的豐度,降低厚壁菌、薩特氏菌等有害菌的豐度,調(diào)節(jié)腸道微生物菌群比例,增加有益菌群比例[64]。在未來(lái)還需對(duì)腸道微生物進(jìn)行代謝組學(xué)研究,使其對(duì)紅海藻多糖的降解朝著對(duì)人體有益的方向進(jìn)行。
對(duì)紅海藻多糖提取、分離純化、結(jié)構(gòu)特性及生物活性進(jìn)行綜述,探討了紅海藻多糖構(gòu)效關(guān)系。目前紅海藻多糖的研究受到國(guó)內(nèi)外學(xué)者廣泛的關(guān)注,也取得了一定的成果,但對(duì)紅海藻多糖的研究還缺乏廣度和深度。紅海藻多糖的提取純化僅限于實(shí)驗(yàn)室研究,未達(dá)到工業(yè)應(yīng)用的要求;紅海藻多糖結(jié)構(gòu)多樣且復(fù)雜,而目前對(duì)其研究主要集中在一級(jí)結(jié)構(gòu),未能深入挖掘多糖生物活性的構(gòu)效關(guān)系、量效關(guān)系;關(guān)于紅海藻多糖抗氧化、抗腫瘤、免疫調(diào)節(jié)等生物活性的研究多為體外研究,少有體內(nèi)研究和臨床試驗(yàn)。未來(lái),應(yīng)圍繞創(chuàng)新高效的提取純化工藝,深入開(kāi)展紅海藻多糖生物活性和臨床應(yīng)用研究,明確作用機(jī)理、構(gòu)效關(guān)系和量效關(guān)系,為紅海藻多糖的開(kāi)發(fā)應(yīng)用提供理論依據(jù)。