西蘭花莖果膠的提取及理化性質(zhì)研究

讓鳳菊，王俊龍，劉偉，任家璇，歐陽(yáng)艷

（伊犁師范大學(xué)化學(xué)與環(huán)境科學(xué)學(xué)院新疆維吾爾自治區(qū)教育廳普通高等學(xué)校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，新疆 伊寧 835000）

果膠是一種結(jié)構(gòu)復(fù)雜的天然高分子多糖，主要以α-1，4糖苷鍵連接半乳糖醛酸組成。根據(jù)酯化程度的不同，果膠可分為兩種：酯化度（degree of esterification，DE）值高于50% 的稱為高酯果膠（high methoxyl pection，HMP），低于50% 的則稱為低酯果膠（low methoxyl pection，LMP）[1]。因其具有良好的凝膠性、乳化性和抗氧化性等功能而被廣泛應(yīng)用于食品醫(yī)藥行業(yè)[2]，被糧農(nóng)組織和世界衛(wèi)生組織[FAO（Food&Agriculture Organization）/WHO（World Health Organization）]聯(lián)合委員會(huì)認(rèn)定為一種安全無(wú)毒的食品添加劑。作為可溶性膳食纖維，果膠表現(xiàn)出一定的藥理活性，如降膽固醇水平、降糖及減肥[3]，提高人體免疫能力和抗癌[4]等。目前，國(guó)內(nèi)果膠的產(chǎn)能受制于原料問(wèn)題，大部分需要靠進(jìn)口解決，且成本昂貴，近年來(lái)，從農(nóng)副產(chǎn)品的生產(chǎn)廢料中尋找新果膠來(lái)源已成為研究熱點(diǎn)。如葡萄渣[5]、可可豆莢[6]和香蕉皮[7]、西紅柿渣[8]、火龍果皮[9]等等。

西蘭花，又名西藍(lán)花（Brassica oleracea L.var.Italica），是為十字花科蕓薹屬一年生植物，因其營(yíng)養(yǎng)豐富，富含多種活性成分，備受研究者關(guān)注。近年來(lái)，隨著國(guó)際市場(chǎng)對(duì)西蘭花的需求量的增大，國(guó)內(nèi)西蘭花的產(chǎn)量日益增加，2017年產(chǎn)量己超過(guò)1 044萬(wàn)t，占世界西蘭花總產(chǎn)量的40.2% ，居世界第一。西蘭花的食用部分是花球，占其總重量的25% ～40% ，根莖部分則被視為廢棄物而丟棄，造成環(huán)境的污染和資源的浪費(fèi)。因此研究這些廢棄物再利用既有較大經(jīng)濟(jì)效益，又能減少環(huán)境污染。

目前有關(guān)西蘭花的活性成分研究多集中在硫代葡萄糖苷[10-12]，而關(guān)于果膠的研究較少[13-14]。本試驗(yàn)采用正交試驗(yàn)優(yōu)化西蘭花莖果膠提取工藝，測(cè)定了果膠的理化性質(zhì)、表觀結(jié)構(gòu)，以期為西蘭花果膠的開(kāi)發(fā)利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

西蘭花莖：餐廳；檸檬酸、乙酸、鹽酸、硫酸、氫氧化鈉、酚酞、無(wú)水乙醇（均為分析純）：上海士峰生物科技有限公司；咔唑、半乳糖醛酸：阿拉丁試劑（上海）有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

UV-2500紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)、傅里葉變換紅外光譜儀（Fourier transform infrared spectrometer，F(xiàn)TIR）：日本島津分析儀器廠；heidolph旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：上海鉑鱗貿(mào)易儀器；BSA124S電子天平：北京賽多利斯儀器有限公司；JSM-7500F掃描電鏡：日本電子株式會(huì)社；LGJ-10N冷凍干燥機(jī)：北京亞星儀科科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 原材料預(yù)處理

將回收的西蘭花莖洗凈、切片，在80℃～100℃水中煮沸2 min～3 min滅酶，將滅酶后的西蘭花莖放入烘箱中90℃烘干，粉碎，過(guò)40目篩備用。

1.3.2 果膠提取工藝流程

精確稱取一定質(zhì)量西蘭花莖粉末于燒杯中，加入稀鹽酸溶解，調(diào)節(jié)適當(dāng)pH值，置于一定溫度的恒溫水浴鍋中加熱一定時(shí)間，趁熱用四層紗布過(guò)濾，將濾液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮，以粗果膠提取液的2倍的量加入95% 乙醇，置于冰箱中冷藏過(guò)夜，用紗布靜置過(guò)濾后得粗果膠，將其置于烘箱中80℃烘干，干燥，稱量粗果膠重量，計(jì)算粗果膠的得率。

1.3.3 西蘭花莖果膠提取單因素試驗(yàn)

1.3.3.1 不同酸對(duì)果膠得率的影響

按照1.3.2提取果膠的工藝流程，在料液比為1∶20（g/mL）、提取溫度為 80 ℃、pH 值為 2.0、提取時(shí)間60 min條件下，分別用鹽酸、硫酸、檸檬酸、磷酸、乙酸提取西蘭花莖果膠，比較果膠得率，確定最佳提取劑。

1.3.3.2 不同pH值對(duì)果膠得率的影響

以鹽酸為提取劑，在料液比為 1∶20（g/mL）、提取溫度為80℃、提取時(shí)間60 min條件下，調(diào)節(jié)pH值分別為 1.5、2.0、2.5、3.0、3.5， 按照 1.3.2 提取果膠的工藝流程提取果膠，比較不同pH值下果膠得率。

1.3.3.3 不同料液比對(duì)果膠得率的影響

以鹽酸為提取劑，在pH值為1.5、提取溫度為80℃、提取時(shí)間為60 min條件下，調(diào)節(jié)料液比分別為1∶5、1∶10、1∶15、1∶20、1∶25（g/mL），按照 1.3.2 提取果膠，比較不同料液比下西蘭花莖果膠得率。

1.3.3.4 不同提取溫度對(duì)果膠得率的影響

以鹽酸為提取劑，在 pH1.5、料液比為 1∶25（g/mL）、提取時(shí)間為60 min條件下，調(diào)節(jié)提取溫度分別為50、60、70、80、90 ℃，按照 1.3.2 提取果膠，比較不同溫度下西蘭花莖果膠得率。

1.3.3.5 不同提取時(shí)間對(duì)果膠得率的影響

以鹽酸為提取劑，在 pH1.5、料液比為 1∶25（g/mL）、提取溫度為90℃條件下，調(diào)節(jié)提取時(shí)間分別為35、50、65、80、95 min，按照 1.3.2 提取果膠，比較不同提取時(shí)間下西蘭花莖果膠得率。

1.3.4 正交試驗(yàn)優(yōu)化西蘭花莖果膠提取工藝

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，以pH值、料液比、提取溫度、提取時(shí)間為考察因素，果膠的得率為指標(biāo)，進(jìn)行正交試驗(yàn)，優(yōu)化西蘭花莖果膠提取的最佳工藝參數(shù)。

表1 正交試驗(yàn)因素水平Table 1 Factor level of orthogonal test

1.3.5 西蘭花果膠得率的計(jì)算

西蘭花果膠得率按式（1）計(jì)算。

式中：P為果膠得率，% ；m為提取得到的粗果膠質(zhì)量，g；W為西蘭花莖粉末質(zhì)量，g。

1.3.6 西蘭花理化性質(zhì)指標(biāo)的測(cè)定

1.3.6.1 半乳糖醛酸含量

標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制：參考侯彩云[15]和侯玉婷等[16]的方法略微改動(dòng)，稱取0.100 g D-半乳糖醛酸標(biāo)準(zhǔn)品于水中溶解，在100 mL容量瓶中定容混合均勻得到半乳糖醛酸標(biāo)準(zhǔn)品。用移液槍移取不同體積標(biāo)準(zhǔn)溶液分別注入10 mL容量瓶中定容，得到不同質(zhì)量濃度半乳糖醛酸標(biāo)準(zhǔn)溶液。依次取1 mL上述半乳糖醛酸標(biāo)準(zhǔn)溶液于50 mL比色管中，再加入一定體積的濃硫酸，在100℃加熱20 min，降溫至室溫后分別加入0.15% 咔唑-乙醇溶液，在暗處顯色1 h，在528 nm出測(cè)定其吸光度，以半乳糖醛酸質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（x），以吸光度為縱坐標(biāo)（y），繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。得標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程：y=0.018 2x-0.019 8，R2=0.999 3。

果膠半乳糖醛酸含量的測(cè)定：按照1.3.2提取一定量果膠，參照上述比色法測(cè)定吸光度，并依據(jù)式（2）計(jì)算西蘭花樣品中半乳糖醛酸含量（GA）。

式中：m1為標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計(jì)算出的每毫升稀釋液中所含半乳糖醛酸的含量，mg/mL；v為西蘭花果膠提取液體積，mL；k為西蘭花莖果膠提取液稀釋倍數(shù)；m2為所稱取的西蘭花莖果膠粉末的質(zhì)量，g。

1.3.6.2 西蘭花莖果膠溶解度的測(cè)定

參考鄒榮[17]的方法并改進(jìn)，取果膠樣品0.5 g，加入75 mL蒸餾水，于40℃下振蕩2 h，懸浮液離心（5 000 r/min，15 min），取上清液，置于 105℃烘箱中烘至恒重，按式（3）計(jì)算果膠溶解度。

式中：S為溶解度，% ；M1為西蘭花莖果膠的原始質(zhì)量，g；M2為西蘭花莖果膠恒重后質(zhì)量，g。

1.3.6.3 西蘭花莖果膠灰分含量的測(cè)定

根據(jù)GB 25533—2010《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品添加劑果膠》[18]中灰分的測(cè)定方法分析西蘭花中灰分含量。按式（4）計(jì)算灰分含量。

式中：m1為坩堝和果膠樣品總質(zhì)量，g；m2為灰化的坩堝和粗果膠質(zhì)量，g；m0為西蘭花莖果膠的質(zhì)量，g。

1.3.6.4 西蘭花果膠酸不溶物的測(cè)定

參考辛明等[19]的方法，根據(jù)干燥后濾渣的質(zhì)量計(jì)算西蘭花莖中果膠酸不溶物的含量，按式（5）計(jì)算果膠酸不溶物含量。

式中：m1為西蘭花果膠濾渣恒重質(zhì)量，g；m0為西蘭花果膠的質(zhì)量，g。

1.3.6.5 西蘭花莖果膠pH值的測(cè)定

用熱蒸餾水配制0.1% 西蘭花莖果膠溶液，冷卻至室溫后，用pH計(jì)測(cè)定其果膠的pH值。

1.3.6.6 西蘭花莖果膠酯化度的測(cè)定

西蘭花果膠酯化度的測(cè)定方法參考郭興峰等[20]的方法。稱取西蘭花果膠提取物0.5 g左右，先加少量濃度為95% 的乙醇將其潤(rùn)濕，再加少量的熱蒸餾水溶解。待西蘭花莖的果膠完全溶解后，滴加2滴酚酞指示劑，再加入0.1 mol/L的NaOH溶液，滴定至剛有顏色變化時(shí)記錄下NaOH溶液消耗體積（V1）。在西蘭花莖果膠溶液中再加入10 mL 0.1 mol/L的NaOH溶液混勻，酯化反應(yīng)2 h，加入0.1 mol/L的HCl溶液10 mL，最終再使用1 mol/L的NaOH溶液滴定至溶液剛有顏色變化，記錄NaOH消耗的溶液的體積（V2），西蘭花莖的酯化度（DE）按照式（6）計(jì)算。

1.3.7 西蘭花果膠的純化

參照張士凱等[21]果膠純化方法，在西蘭花莖的粗果膠中加入95% 的乙醇，使用磁力攪拌器以500 r/min攪拌20 min使雜質(zhì)溶出，然后以5 000 r/min離心10 min去上清液收集沉淀，使用95% 乙醇重復(fù)上述步驟3次，以此保證可以獲得較為純凈的果膠。使用95% 乙醇洗滌所獲得的果膠沉淀，靜置使乙醇揮發(fā)，再用少量蒸餾水溶解，裝入3 500 Da的透析袋中，以蒸餾水為透析液透析24 h，每4 h更換一次透析液。純化后的果膠冷凍干燥24 h后備用。

1.3.8 西蘭花果膠掃描電鏡測(cè)定

根據(jù)王文駿[22]的方法并加以改進(jìn)優(yōu)化，取適量冷凍干燥的西蘭花莖果膠，用瑪瑙研缽將其研磨成粉末，檢驗(yàn)粉末無(wú)磁性后，將其放到樣品臺(tái)的雙面膠上并涂薄金層，用10 kV的加速電壓掃描電鏡拍攝樣品的形貌特征，放大倍數(shù)為13 000倍。

1.3.9 西蘭花果膠紅外光譜的測(cè)定

參考王煒清等[23]的方法測(cè)定，稱取質(zhì)量為0.100 g的溴化鉀粉末，西蘭花莖果膠粉末0.001 g，將二者混合均勻，用瑪瑙研缽研磨5 min。將研磨好的混合物樣品置于60℃干燥箱里干燥1 h，制成透明壓片，采用傅里葉變換紅外光譜儀于400 cm-1～4 000 cm-1范圍內(nèi)進(jìn)行光譜掃描。

1.4 數(shù)據(jù)處理

所有試驗(yàn)均重復(fù)3次，結(jié)果用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。運(yùn)用Microsoft Excel 2016進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。用Origin 8.0軟件繪制圖形。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)

2.1.1 提取酸的選擇

以西蘭花果膠得率、半乳糖醛酸含量為指標(biāo)，用鹽酸、硫酸、檸檬酸、磷酸、乙酸提取果膠，結(jié)果見(jiàn)圖1。

圖1 不同酸對(duì)果膠得率及半乳糖醛酸含量的影響Fig.1 Effect of different acids on pectin yield and galactolic acid content

由圖1可知，檸檬酸組的果膠得率最多，為5.80% ；磷酸、乙酸較少不考慮；鹽酸組果膠得率為4.75% ，而硫酸組果膠得率為4.82% ，二者差別不大，但是用硫酸提取出的果膠顏色較深；通過(guò)比較鹽酸、檸檬酸提取粗果膠中半乳糖醛酸的含量發(fā)現(xiàn)，檸檬酸為提取劑果膠產(chǎn)率高但其半乳糖醛酸含量較低，為32.27% ，鹽酸的半乳糖醛酸含量為56.54% ；綜上，選用鹽酸作為提取劑。

2.1.2 pH值對(duì)果膠得率的影響

pH值對(duì)果膠得率的影響見(jiàn)圖2。

圖2 pH值對(duì)果膠得率的影響Fig.2 Effect of pH value on the yield of pectin

由圖2可知，西蘭花果膠得率隨著pH值的升高先增加后減小，在pH2.0時(shí)果膠得率最大，為4.60% ，后又緩慢上升。這可能是酸度增強(qiáng)有利原果膠的水解，使更多的原果膠轉(zhuǎn)化為水溶性的果膠，但當(dāng)pH小于2.0時(shí)，果膠得率較低，原因是溶液中的水溶性果膠在強(qiáng)酸條件下會(huì)進(jìn)一步脫脂裂解，從而使果膠得率下降。所以，較適合的pH值為2.0。

2.1.3 料液比對(duì)果膠得率的影響

料液比對(duì)果膠得率的影響如圖3所示。

圖3 料液比對(duì)果膠得率的影響Fig.3 Effect of feed-liquid ratio on the yield of pectin

由圖3可知，隨著提取溶劑的逐漸增加，果膠得率先增大后減小。由于果膠在水中的溶解度較小，當(dāng)提取溶劑用量較小時(shí)，果膠分子不能很好的擴(kuò)散溶出，導(dǎo)致果膠得率不高；而提取溶劑用量過(guò)多，增加后續(xù)濃縮時(shí)間，醇沉成本，綜合考慮，選擇料液比1∶20（g/mL），進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

2.1.4 提取溫度對(duì)果膠得率的影響

提取溫度對(duì)果膠得率的影響結(jié)果如圖4所示。

圖4 提取溫度對(duì)果膠得率的影響Fig.4 Effect of extraction temperature on the yield of pectin

由圖4可知，隨著提取溫度的升高，果膠產(chǎn)率先降低后增大最后降低，當(dāng)提取溫度升高至90℃時(shí)，果膠的產(chǎn)率最高，為5.73% 。提取溫度影響物質(zhì)的擴(kuò)散系數(shù)、大分子溶液的黏度以及某些物質(zhì)的溶解度，較高的提取溫度可以降低體系的黏度，加快傳質(zhì)速率，提高果膠多糖的溶解度，從而提高果膠的得率。但是過(guò)高的提取溫度，又會(huì)導(dǎo)致糖苷鍵水解，故選擇提取溫度90℃進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

2.1.5 提取時(shí)間對(duì)果膠得率的影響

提取時(shí)間對(duì)果膠得率的影響如圖5所示。

圖5 提取時(shí)間對(duì)果膠得率的影響Fig.5 Effect of extraction time on the yield of pectin

由圖5可知，隨著提取時(shí)間不斷延長(zhǎng)，果膠產(chǎn)率先降低后增加再降低?？赡苁怯捎谔崛r(shí)間過(guò)長(zhǎng)，將果膠溶解為更小的分子而被過(guò)濾，使果膠的產(chǎn)率降低。因此選提取時(shí)間80 min進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

2.2 正交試驗(yàn)結(jié)果

西蘭花莖果膠提取工藝正交試驗(yàn)結(jié)果如表2所示。

表2 正交試驗(yàn)結(jié)果Table 2 Orthogonal test results

由表2可知，由極差R分析得到4個(gè)因素中，影響果膠得率的順序是提取溫度＞提取時(shí)間＞pH值＞料液比。由K值得到最佳的工藝組合為A1B3C3D2，即最佳工藝條件：pH1.5，料液比 1∶25（g/mL），提取溫度 90℃，提取時(shí)間80 min。在最佳提取條件下對(duì)西蘭花莖果膠得率進(jìn)行驗(yàn)證，平均果膠得率為9.42% 。

2.3 西蘭花莖果膠的理化性質(zhì)

西蘭花莖果膠的理化性質(zhì)如表3所示。

表3 西蘭花莖果膠的理化性質(zhì)Table 3 Physical and chemical properties of pectin extracted from broccoli stalk

由表3可知，采用酸水法提取的西蘭花莖果膠的溶解度、半乳糖醛酸含量，符合GB 25533—2010《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品添加劑果膠》的有關(guān)規(guī)定。所提取果膠的酯化度為46.70% ，屬于低酯化果膠（DE＜50% ）。低酯果膠形成凝膠時(shí)不受體系pH值和可溶性固形物含量影響，可以用于低糖、無(wú)糖食品的增稠劑[24]。與COR相比，pH值、灰分和酸不溶物含量指標(biāo)差距較大，推斷是西蘭花莖中無(wú)機(jī)物的含量較高或粗果膠提取純化工藝有待改進(jìn)。

2.4 西蘭花莖果膠的掃描電鏡圖

果膠樣品的掃描電鏡圖見(jiàn)圖6。

圖6 果膠樣品的掃描電鏡圖Fig.6 Scanning electron microscopy（SEM）of pectin samples

由圖6可知，13 000倍電鏡下西蘭花莖果膠（Brassica oleracea L.pectin，BOP）與商品橘子皮果膠（commercial orange pectin，COR）相對(duì)照，可以看出西蘭花莖果膠和商品果膠均為片狀結(jié)構(gòu)，但商品果膠排列的更加緊密、縫隙小，西蘭花莖果膠的片層相比于商品果膠更大，排列也不緊密，有較多的縫隙。果膠來(lái)源、提取方法以及后期處理方法的不同都會(huì)造成其表觀顆粒形態(tài)的差異。

2.5 紅外光譜

FTIR測(cè)定結(jié)果如圖7所示。果膠的得率為9.42% ；所得果膠為低酯果膠，其半乳糖醛酸含量，溶解度達(dá)到國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)，灰分和酸性不溶物質(zhì)含量較高，且有待進(jìn)一步純化。

圖7 果膠樣品FTIR譜圖Fig.7 The FTIR spectrum of pectin

由圖7可知，兩種果膠在4 000 cm-1～400 cm-1處輪廓基本一致，均有糖類[25]的特征吸收峰，說(shuō)明兩種果膠多糖的類型基本相同。3 422 cm-1處峰來(lái)自—OH的伸縮振動(dòng)，在2 918 cm-1處是—CH2的吸收峰，為C—H伸縮振動(dòng)，在2 350 cm-1處為CO2雜質(zhì)的吸收峰。在1 740 cm-1吸收峰是酯化的羧基官能團(tuán)（—COOR）C—O的伸縮振動(dòng)，1 648 cm-1附近的吸收峰為自由羧基官能團(tuán)（—COO）CO的非對(duì)稱伸縮運(yùn)動(dòng)，這兩個(gè)吸收峰是果膠多糖特征峰，說(shuō)明提取多糖為果膠多糖[26]。BOP在1 740 cm-1處左右處的吸收峰低于1 648 cm-1左右處的吸收峰[27]，代表著此樣品是低酯果膠。兩種果膠在800 cm-1～1 300 cm-1處的吸收峰有差異，表明兩種果膠在結(jié)構(gòu)和單糖組成上有差異。

3 結(jié)論

本研究采用傳統(tǒng)酸提醇沉法獲取西蘭花廢棄莖果膠，并初步探究其理化性質(zhì)。首先以西蘭花莖果膠的得率為指標(biāo)，考察酸的種類、pH值、料液比、提取溫度、提取時(shí)間等因素對(duì)其的影響，并在此基礎(chǔ)上進(jìn)行正交試驗(yàn)，得出最佳工藝條件：pH1.5，料液比 1∶25（g/mL），提取溫度90℃，提取時(shí)間80 min，此條件下驗(yàn)證試驗(yàn)