趨化因子CCL26 C端截短肽的抗菌活性及抗生物被膜作用的研究

張會(huì)會(huì)，昝亞楠，金明潔，梁思宇，劉思國(guó)，謝 芳

（中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所獸醫(yī)生物技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/動(dòng)物細(xì)菌病研究創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)，黑龍江 哈爾濱 150069）

耐藥性致病菌的流行會(huì)嚴(yán)重影響?zhàn)B殖業(yè)的正常運(yùn)轉(zhuǎn)，給食品安全和生態(tài)環(huán)境帶來嚴(yán)重危害，從而威脅人類的健康，制約經(jīng)濟(jì)的可持續(xù)發(fā)展[1-3]。因此，迫切需要研究和開發(fā)出針對(duì)耐藥菌感染的抗菌治療藥物，來對(duì)抗日益流行的細(xì)菌耐藥現(xiàn)象。趨化因子是一類參與多種免疫功能的低分子量蛋白質(zhì)。近年來發(fā)現(xiàn)，許多趨化因子具有抗菌活性。趨化因子CXCL9、CXCL10 和CXCL11 能有效地殺死大腸桿菌和單核細(xì)胞增生李斯特菌[4]。隨后，Yang 等對(duì)人源趨化因子進(jìn)行了系統(tǒng)的篩選，發(fā)現(xiàn)45 種人源趨化因子中，有23 種（10 種CXC 型和13 種CC 型趨化因子）表現(xiàn)出抗菌活性[5]。其中趨化因子CCL26 具有抗菌肽在中性pH 中帶正電（pI=10.85）的特性，此外其二級(jí)結(jié)構(gòu)由N 端的無規(guī)則卷曲，反平行的β-鏈和C端的α-螺旋組成，這與抗菌肽中防御素的結(jié)構(gòu)非常相似，甚至其C 末端結(jié)構(gòu)域也與抗菌肽LL-37 具有高度的結(jié)構(gòu)相似性[6]。研究發(fā)現(xiàn)，CCL26 在低鹽濃度下對(duì)耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（MASA）能夠達(dá)到80%抑菌效果[7]。因此，本研究以人源抗菌趨化因子CCL26 完整序列為模板，合成具有與傳統(tǒng)抗菌肽結(jié)構(gòu)高度相似的C 末端區(qū)域的截短肽26C 作為研究對(duì)象，探究26C 的體外生物學(xué)活性，以期為新型抗菌肽的研發(fā)提供思路，為治療耐藥菌感染的臨床用藥奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 主要實(shí)驗(yàn)材料腸道外致病性大腸桿菌K1 為耐多粘菌素B（PxB）的臨床分離菌株，銅綠假單胞菌ATCC 27853、人表皮角質(zhì)形成細(xì)胞HaCaT 由本實(shí)驗(yàn)室保存；CCL26 C 端截短肽（26C，KKWVQKYISLLK-TPKQL），由上海吉爾生化有限公司合成，經(jīng)過高效液相色譜純化后純度>98%；LB 固體和液體培養(yǎng)基購(gòu)自美國(guó)BD 公司；胰蛋白大豆肉湯培養(yǎng)基（TSB）和胰蛋白大豆瓊脂培養(yǎng)基（TSA）購(gòu)自英國(guó)OXOID 公司；磷酸鹽緩沖液（PBS）購(gòu)自北京Coolaber 公司；MEM 培養(yǎng)基、胰蛋白酶、胎牛血清（FBS）、鏈霉素和青霉素購(gòu)自美國(guó)Gibco 公司；結(jié)晶紫、DMSO、3-（4, 5-二甲基噻唑-2）-2, 5-二苯基四氮唑溴鹽（MTT）購(gòu)自哈爾濱市牧樂生物試劑有限公司；1-N-苯基萘胺（NPN）、PxB 購(gòu)自上海麥克林生化科技有限公司；細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)劑（CCCP，50 mmol/L）購(gòu)自北京索萊寶生物科技有限公司；Triton X-100、HEPES、Adenosine 5'-triphosphate（ATP）Bioluminescent Assay Kit 購(gòu) 自 美國(guó)Sigma-Aldrich 公司。

1.2 26C 對(duì)大腸桿菌K1 的濃度-殺菌曲線的測(cè)定待大腸桿菌K1 株培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期時(shí)收集菌體，用PBS 清洗3 次并調(diào)整為2×105cfu/mL，加入終濃度分別為0、1 μmol/L、2 μmol/L、4 μmol/L 的26C，置于37 ℃孵育3 h。取100 μL 菌液，10 倍倍比稀釋后涂板。待干燥后倒置放入37 ℃孵育24 h 后，參照De Breij 等的方法測(cè)定26C 在不同濃度下對(duì)大腸桿菌K1的殺菌效率[8]，繪制濃度-殺菌曲線。

1.3 26C 對(duì)大腸桿菌外膜通透性影響的測(cè)定將培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期的大腸桿菌K1 重懸于含有5 μmol/L CCCP、5 mmol/L 葡萄糖的HEPES 緩沖液中，調(diào)整OD600nm約為0.5 后，于96 孔板中每孔加入100 μL 菌液，然后加入10 μmol/L NPN 平衡30 s，再加入終濃度為2 μmol/L的26C，在37 ℃條件下使用多功能酶標(biāo)儀每隔30 min檢測(cè)一次熒光強(qiáng)度，以相同濃度的PxB 作為陽性對(duì)照，采用NPN 測(cè)定26C 對(duì)細(xì)菌外膜的通透性[9]。試驗(yàn)重復(fù)3次，根據(jù)多功能酶標(biāo)儀測(cè)定的熒光值繪圖。

1.4 26C對(duì)大腸桿菌ATP泄露影響的測(cè)定取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的大腸桿菌K1，收集菌體后用PBS 和50 mmol/L的HEPES各洗一遍，采用HEPES重懸至OD600nm約為1，加入0.2%的glucose 活化10 min，立即用26C 處理細(xì)菌懸液，每孔加入100 μL的ATP檢測(cè)液，靜置3 min，將80 μL DMSO 透化加入20 μL 上述細(xì)菌懸液，稀釋于4.9 mL 無菌水中，利用ATP Bioluminescent Assay Kit檢測(cè)ATP 總量；同時(shí)將80 μL 無菌水加入20 μL 大腸桿菌K1 細(xì)菌懸液中后稀釋于4.9 mL 無菌水中，利用ATP Bioluminescent Assay Kit 測(cè)定胞外ATP（ATP EC）的含量，通過多功能酶標(biāo)儀讀取熒光值，并計(jì)算胞內(nèi)ATP（ATP IC）的含量，胞內(nèi)ATP=ATP 總量-胞外ATP，通過比較胞外ATP 和胞內(nèi)ATP 的差異繪圖。

1.5 通過透射電鏡觀察26C 對(duì)大腸桿菌細(xì)胞膜的影響細(xì)菌處理方法如1.2，將重懸菌液與2 μmol/L 的26C 作用，37 ℃孵育1 h 后用PBS 洗滌2 次后離心棄上清，收集菌體，2.5%戊二醛4 ℃靜止過夜。PBS 緩沖液沖洗3 次。2%的四氧化二鋨固定2 h，PBS 緩沖液沖洗2 次。分別利用50%、70%、90%和100%乙醇各脫水10 min。100%丙酮處理20 min，再用丙酮（1：1）樹脂（1：3）混合液處理1 h 后用純樹脂包埋過夜。將其制成超薄切片并用醋酸鈾酰和檸檬酸鉛染色，以不加26C 的大腸桿菌為對(duì)照室溫干燥后采用透射電鏡觀察26C 對(duì)大腸桿菌細(xì)胞膜的影響并拍照。

1.6 26C 對(duì)銅綠假單胞菌生物被膜（BF）形成影響的測(cè)定于96 孔板中分別加入濃度為8 μmol/L、4 μmol/L、2 μmol/L、1 μmol/L、0 的26C 后，各孔分別 加 入50 μL 濃 度 為2×106cfu/mL 銅 綠 假 單 胞 菌 菌液，混勻后置于37 ℃孵育36 h，棄去浮游細(xì)菌，PBS 洗3 遍，甲醇固定晾干后加150 μL 結(jié)晶紫，作用5 min，純水洗3 遍，晾干后加150 μL 33%冰醋酸溶液溶解，輕輕混勻，測(cè)定OD490nm值，參考Rajasek-aran 等的方法測(cè)定26C 對(duì)細(xì)菌BF 形成的影響[10]。

同時(shí)將500 μL 濃度為2×106cfu/mL 銅綠假單胞菌菌液加入共聚焦小皿，加入26C 使其終濃度為2 μmol/L、1 μmol/L、0，37 ℃靜置培養(yǎng)36 h，PBS 洗滌2 次后，利用細(xì)菌活力檢測(cè)試劑盒染色，通過激光共聚焦顯微鏡觀察26C 對(duì)BF 形成的影響。

1.7 26C 對(duì)紅細(xì)胞溶血活性影響的測(cè)定靜脈采集人的新鮮血液，制備成4%的人紅細(xì)胞懸液。將200 μL 濃度分別為2 μmol/L、4 μmol/L、8 μmol/L、16 μmol/L、32 μmol/L、64 μmol/L 和128 μmol/L 的26C 或0.2% Triton X-100 與200 μL 的 紅 細(xì) 胞 懸 液 在37 ℃孵育1 h后，室溫800 r/min離心10 min，取100 μL上清測(cè)定OD415nm值。設(shè)等體積的PBS（pH7.4）處理組作為陰性對(duì)照，以0.2% Triton X-100 處理組作為陽性對(duì)照。根據(jù)式（1）計(jì)算溶血率后作圖。

式（1）：%溶血率=100×[(A-A0)]/[(AT-A0)]，式中：A 為加肽樣品OD415nm值；A0和AT分別代表陰性值和陽性值。

1.8 26C對(duì)HaCaT細(xì)胞毒性的測(cè)定HaCaT細(xì)胞采用1 μmol/L、2 μmol/L、4 μmol/L、8 μmol/L、16 μmol/L、32 μmol/L、64 μmol/L 的26C 在MEM 培養(yǎng)基中37 ℃、5%CO2孵育24 h后，采用MTT法評(píng)價(jià)26C的細(xì)胞毒性[9]。試驗(yàn)以無肽處理的細(xì)胞作為空白對(duì)照組，并按式（2）計(jì)算抑制率后作圖。式（2）抑制率（%）=（對(duì)照組OD570nm均值-給藥組OD570nm均值）/對(duì)照組OD570nm均值×100%。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用GraphPad Prism 8.0 軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)，采用t檢驗(yàn)法進(jìn)行組間顯著性分析并作圖，P>0.05 為差異不顯著；P≤0.05 為差異顯著。

2 結(jié) 果

2.1 26C 濃度-殺菌曲線的測(cè)定結(jié)果為探究26C在不同濃度下的殺菌能力，本研究將不同濃度的26C與大腸桿菌菌株K1 共同孵育3 h，根據(jù)殺菌效果繪制濃度-殺菌曲線。結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，1 μmol/L 的26C 與K1 菌株作用3 h 具有一定的殺菌效果（P<0.05），2 μmol/L 和4 μmol/L 的26C 與K1 菌株作用3 h 后可以有效地殺滅細(xì)菌（P<0.001），抗菌效果呈劑量依賴性，且在4 μmol/L 時(shí)即可完全殺滅細(xì)菌，使得細(xì)菌活菌數(shù)降低4log（圖1）。結(jié)果表明，26C 在不同濃度下均可有效殺滅細(xì)菌。

圖1 26C對(duì)E.coli 菌株K1的濃度-殺菌曲線Fig.1 Concentration-kill curve of 26C to E.coli K1

2.2 26C 對(duì)大腸桿菌外膜通透性影響的測(cè)定結(jié)果疏水探針NPN 在非極性或疏水環(huán)境中會(huì)發(fā)出強(qiáng)烈的熒光，因此常用來檢測(cè)細(xì)胞膜的完整性。本研究通過NPN 攝取量檢測(cè)26C 對(duì)細(xì)菌的損傷程度，并以對(duì)大多數(shù)革蘭氏陰性桿菌具有殺菌作用的多肽分子PxB作為研究細(xì)菌外膜通透性的陽性對(duì)照。結(jié)果顯示，與陽性對(duì)照組相比，26C 作用細(xì)菌30 min 后觀察到熒光強(qiáng)度顯著增加（P<0.01），在作用后60 min～240 min內(nèi)熒光強(qiáng)度極顯著增加（P<0.001），并且隨著26C 作用時(shí)間延長(zhǎng)，NPN 的熒光強(qiáng)度逐漸增加，說明細(xì)菌外膜的通透性逐漸變大，且呈現(xiàn)時(shí)間依賴性。陽性對(duì)照PxB 也改變了細(xì)菌外膜通透性，但其效果明顯不如26C（圖2）。結(jié)果表明，隨著作用時(shí)間的延長(zhǎng)，26C 可有效改變大腸桿菌細(xì)胞膜的通透性。

圖2 26C對(duì)大腸桿菌的外膜通透性影響的檢測(cè)結(jié)果Fig.2 The effect of 26C on the permeability of the outer membrane of E.coli

2.3 26C 對(duì)大腸桿菌ATP 泄露影響的測(cè)定結(jié)果當(dāng)細(xì)菌細(xì)胞膜損傷后，會(huì)導(dǎo)致菌體內(nèi)容物泄露，繼而殺死細(xì)菌。因此，ATP 泄漏分析可用于評(píng)估26C干擾細(xì)菌的能力。本研究利用ATP 泄露實(shí)驗(yàn)測(cè)定了26C對(duì)大腸桿菌的干擾能力，結(jié)果顯示，在2 μmol/L時(shí)大腸桿菌胞外ATP 顯著增加（P<0.05），4 μmol/L 時(shí)胞外ATP 極顯著增加（P<0.001），說明細(xì)胞膜被嚴(yán)重破壞，導(dǎo)致菌體內(nèi)容物及代謝產(chǎn)物泄露；在較低濃度時(shí)（1 μmol/L），觀察到胞外ATP的泄露有限，說明細(xì)胞膜未被完全破壞或存在其他作用靶標(biāo)（圖3）。結(jié)果表明，2 μmol/L 的26C 作用于大腸桿菌即可顯著破壞細(xì)菌細(xì)胞膜，導(dǎo)致菌體內(nèi)ATP外泄，降低細(xì)菌存活率。

圖3 26C處理細(xì)菌細(xì)胞后細(xì)胞內(nèi)（IC）和細(xì)胞外（EC）ATP的測(cè)定Fig.3 Measurement of intracellular(IC)and extracellular(EC)of level ATP after 26C treatment

2.4 26C 對(duì)細(xì)菌細(xì)胞膜的損傷作用將2 μmol/L 26C 與大腸桿菌共孵育1 h 后，制成超薄切片并在透射電子顯微鏡下觀察細(xì)菌細(xì)胞膜形態(tài)。結(jié)果顯示，對(duì)照組菌體保持完好的細(xì)胞形態(tài)，胞質(zhì)均勻，內(nèi)容物充實(shí)，無胞漿外泄現(xiàn)象。經(jīng)26C 作用后，菌體出現(xiàn)明顯的質(zhì)壁分離并伴有不同程度的膜損傷（箭頭所示），導(dǎo)致菌體內(nèi)容物泄露（圖4）。結(jié)果表明，26C可破壞細(xì)菌細(xì)胞膜，從而有效地殺傷細(xì)菌。

圖4 透射電鏡觀察26C對(duì)細(xì)菌細(xì)胞膜的損傷作用Fig.4 Effects of 26C on bacterial cell membrane by TEM

2.5 26C 對(duì)銅綠假單胞菌BF 形成能力影響的測(cè)定銅綠假單胞菌為適應(yīng)環(huán)境所形成的BF 大大削弱了抗生素的殺菌效果，本研究測(cè)定了不同濃度水平下26C抑制BF形成的能力。通過結(jié)晶紫染色法檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，26C在1 μmol/L～2 μmol/L 可有效抑制銅綠假單胞菌BF 的形成（P<0.01），在4 μmol/L～8 μmol/L 時(shí)26C 抑制BF 形成的能力極顯著高于對(duì)照組（P<0.001）（圖5A）。采用激光共聚焦顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)，26C 在1 μmol/L 濃度下即可顯著抑制銅綠假單胞菌的BF 的形成（圖5B）。結(jié)果表明，26C 在低濃度即可顯著抑制銅綠假單胞菌BF 的形成，且抑制效果呈現(xiàn)劑量依賴性。

圖5 利用結(jié)晶紫法（A）和激光共聚焦顯微鏡（B）觀察26C抑制細(xì)菌BF形成的能力Fig.5 The antibiofilm ability of 26C was observed by crystal violet method(A)and laser confocal microscope(B)

2.6 26C 對(duì)人紅細(xì)胞的溶血活性及細(xì)胞毒性測(cè)定結(jié)果天然抗菌肽因易溶解紅細(xì)胞引起全身毒性而限制了其用于臨床治療，為測(cè)定26C對(duì)紅細(xì)胞的溶血活性，本研究將不同濃度的26C 分別與人紅細(xì)胞孵育1 h后測(cè)定上清OD415nm值，計(jì)算抗菌肽對(duì)人紅細(xì)胞的溶血活性（%）。結(jié)果顯示，與陽性對(duì)照相比，在最高濃度下，26C 對(duì)人紅細(xì)胞溶血活性極低（P<0.001），僅為0.85%（圖6）。結(jié)果表明，26C對(duì)人紅細(xì)胞無溶血活性，有作為臨床用藥開發(fā)的潛力。為明確26C對(duì)哺乳動(dòng)物細(xì)胞的毒性，采用MTT 法檢測(cè)26C 對(duì)HaCaT 的細(xì)胞毒性。結(jié)果顯示，與空白對(duì)照組相比，1 μmol/L～16 μmol/L 26C對(duì)HaCaT細(xì)胞無毒性，32 μmol/L～64 μmol/L 26C有較低的細(xì)胞毒性（P<0.05）（圖7）。此時(shí)肽濃度已遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于其殺菌濃度。結(jié)果表明，26C 對(duì)哺乳動(dòng)物細(xì)胞 無毒性，有作為臨床用藥開發(fā)的潛力。

圖6 26C對(duì)人紅細(xì)胞的溶血活性的測(cè)定Fig.6 Hemolytic activity of 26C on human red blood cells

圖7 26C對(duì)人表皮角質(zhì)形成細(xì)胞HaCaT的細(xì)胞毒性的測(cè)定Fig.7 The cytotoxicity of 26C to human epidermal keratinocyte cells HaCaT

3 討 論

過去幾十年抗生素濫用造成細(xì)菌多重耐藥菌大量出現(xiàn)[11]，而養(yǎng)殖業(yè)這種現(xiàn)象尤為嚴(yán)重。據(jù)保守估計(jì)，2010 年～2030 年我國(guó)養(yǎng)殖業(yè)抗生素的消耗量至少還將增加一倍，達(dá)到全球總量的近1/3，給公共衛(wèi)生安全帶來極大的威脅[12]。隨著我國(guó)減抗無抗政策的制定和實(shí)施，新型抗菌制劑的研制迫在眉睫。

趨化因子不僅在調(diào)節(jié)白細(xì)胞遷移方面發(fā)揮關(guān)鍵作用，而且在天然免疫和適應(yīng)性免疫反應(yīng)方面也發(fā)揮重要作用，與趨化因子相關(guān)的新功能之一是其作為抗菌藥物應(yīng)用的能力[7]。許多趨化因子的C 端結(jié)構(gòu)域與陽離子的α-螺旋抗菌肽的相似性較高，可見C末端螺旋區(qū)域是趨化因子抗菌活性的主要區(qū)域。而在某些情況下，分子內(nèi)的相互作用可能會(huì)中和帶正電的C 末端α-螺旋，掩蓋它的的抗菌活性，這表明或許需要對(duì)某些成熟的趨化因子進(jìn)行截短，才能完整的保留其抗菌活性。研究發(fā)現(xiàn)，CCL26 在低鹽濃度（10 mmol/L）下對(duì)MASA 具有一定的抗菌活性，而對(duì)其他細(xì)菌的抗菌活性還未報(bào)道[7]，因此本研究合成了抗菌趨化因子CCL26 具有α-螺旋結(jié)構(gòu)的C 端截短肽26C，并測(cè)定其對(duì)耐PxB 的大腸桿菌K1 菌株的抗菌活性，發(fā)現(xiàn)其在低濃度下即可有效殺滅大腸桿菌，表明26C 對(duì)耐PxB 的腸道外致病菌具有較強(qiáng)的殺菌活性。

抗菌肽大多具有陽離子表面和疏水表面的兩親性，這可能促進(jìn)抗菌肽與帶負(fù)電的微生物表面相互作用[13]。這種相互作用可能是通過插入脂膜和破壞細(xì)菌膜而殺死細(xì)菌，本研究NPN 和ATP 的測(cè)定結(jié)果均顯示26C 在2 μmol/L 的濃度下具有顯著干擾細(xì)菌通透性及代謝穩(wěn)定性的能力，這表明26C 可能插入到細(xì)菌細(xì)胞膜中，增加了膜的通透性導(dǎo)致細(xì)菌內(nèi)容物泄露而死亡。為了獲得更多關(guān)于26C 潛在作用機(jī)制的信息，本研究對(duì)肽作用后的細(xì)菌表面進(jìn)行透射電鏡觀察，結(jié)果顯示26C 影響大腸桿菌的表面，可能是通過靜電作用與細(xì)胞膜上帶負(fù)電荷的成分結(jié)合，引起外膜通透性改變，導(dǎo)致細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)容物的泄漏而造成損傷，最終導(dǎo)致細(xì)菌死亡，這也印證了上述NPN 和ATP 的測(cè)定結(jié)果。

BF 內(nèi)細(xì)菌對(duì)抗生素和其他藥物耐受性強(qiáng)，并能逃避宿主的免疫殺傷，抗菌肽因其獨(dú)特的膜作用殺菌機(jī)制能抑制BF 的形成或降解BF[8]。為了研究26C對(duì)細(xì)菌BF 的作用，本研究通過結(jié)晶紫染色法檢測(cè)26C 對(duì)銅綠假單胞菌BF 的影響，結(jié)果顯示26C 對(duì)銅綠假單胞菌BF 形成具有顯著抑制作用，并且隨著26C 濃度升高抑制作用也明顯增強(qiáng)，這為預(yù)防醫(yī)療器械等醫(yī)源性慢性感染提供了參考。本研究進(jìn)一步通過激光共聚焦顯微鏡觀察，結(jié)果顯示與陽性對(duì)照相比，26C 在低濃度下能夠顯著抑制BF 的形成。該結(jié)果進(jìn)一步支持本研究上述結(jié)論。此外，26C 對(duì)哺乳動(dòng)物無溶血活性，且在1 μmol/L～16 μmol/L 對(duì)哺乳動(dòng)物細(xì)胞無毒性，說明其具有作為新型抗菌肽開發(fā)的潛力。

綜上所述，本研究中趨化因子CCL26 的C 端截短肽26C 具有顯著的抗菌活性，可以有效地降低耐藥大腸桿菌菌株的存活率；并能干擾細(xì)菌外膜通透性，造成細(xì)菌嚴(yán)重?fù)p傷而死亡；同時(shí)可以抑制銅綠假單胞菌BF 的形成；無溶血活性，對(duì)哺乳動(dòng)物細(xì)胞毒性較低，具備作為臨床藥物開發(fā)的潛力。本研究為新型抗菌肽的研發(fā)提供了思路，也為趨化因子抗菌肽的臨床應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。