輪狀病毒感染宿主的Toll樣受體信號(hào)通路研究進(jìn)展

葉麗萍，胡靜濤，石春衛(wèi)

（吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院/吉林省動(dòng)物微生態(tài)制劑工程研究中心，吉林 長春 130118）

輪狀病毒（Rotavirus，RV）屬于呼腸孤病毒科（Reoviridae）輪狀病毒屬的雙鏈RNA 病毒，是引起嬰幼兒和其他幼齡動(dòng)物病毒性腹瀉的主要病原之一。RV 感染主要侵入腸道絨毛上皮細(xì)胞從而導(dǎo)致細(xì)胞空泡變性、小腸絨毛萎縮脫落和腸壁變薄等癥狀以致腹瀉發(fā)生。RV 感染宿主腸上皮細(xì)胞可被不同的模式識(shí)別受體（Pattern recognition receptor，PRR）特異性識(shí)別，而Toll 樣受體（Toll-like receptors，TLRs）作為宿主免疫系統(tǒng)中重要的PRR，其在RV 感染并誘導(dǎo)樹突狀細(xì)胞（Dendritic cells，DCs）成熟及激活固有免疫應(yīng)答的過程中發(fā)揮重要作用。本文較全面探究了RV 感染與宿主TLRs 信號(hào)通路的互作機(jī)制，將有助于了解宿主抗RV 感染的固有免疫反應(yīng)，為RV 感染的防控和治療提供新思路。

1 與RV 感染相關(guān)的TLRs

TLRs 是免疫細(xì)胞中主要的跨膜蛋白，在病毒和細(xì)菌的感染與識(shí)別中具有重要作用，是連接機(jī)體固有免疫和獲得性免疫反應(yīng)的橋梁[1]。目前在哺乳動(dòng)物中共發(fā)現(xiàn)了15 個(gè)TLRs（TLR1～TLR15），其中人類共有11 個(gè)TLRs[2]。不同的TLRs 識(shí)別不同的病原體相關(guān)模式分子（Pathogen-associated molecular patterns，PAMP）[3]，如TLR1 識(shí)別細(xì)菌脂蛋白和三酰脂質(zhì)肽；TLR2 識(shí)別革蘭氏陽性菌糖肽；TLR5 識(shí)別鞭毛蛋白；而TLR3 能特異性識(shí)別病毒感染的中間產(chǎn)物dsRNA[4]和poly(I:C)，促進(jìn)炎性細(xì)胞因子和I 型干擾素的產(chǎn)生。在 眾 多 的TLRs 中，TLR2、TLR3、TLR4、TLR7、TLR8 和TLR9 參與識(shí)別病毒和抗病毒感染的固有免疫反應(yīng)，其中TLR2 和TLR4 位于細(xì)胞膜表面參與識(shí)別病毒糖蛋白，TLR3、TLR7、TLR8 和TLR9 位于細(xì)胞內(nèi)參與識(shí)別病毒核酸，誘導(dǎo)宿主產(chǎn)生I 型干擾素[5]。

哪種或哪幾種TLRs 參與RV 感染后的病毒識(shí)別及抗病毒的固有免疫應(yīng)答，目前尚無定論。RV 感染后單核細(xì)胞所表達(dá)的TLRs 識(shí)別dsRNA，激活NF-κB和干擾素途徑，進(jìn)而導(dǎo)致多種細(xì)胞因子及輔助刺激分子的分泌，以調(diào)節(jié)機(jī)體非特異性免疫應(yīng)答[6]。Xu等研究RV 嚴(yán)重感染的腹瀉兒童的外周血單核細(xì)胞發(fā)現(xiàn)，發(fā)病3 d 內(nèi)有41% 的患者體內(nèi)TLR2～TLR4、TLR7和TLR8的mRNA 轉(zhuǎn)錄水平升高；3 d 后只有TLR3和TLR8基因mRNA 轉(zhuǎn)錄水平保持較高水平[7]。RV 感染人腸上皮細(xì)胞（HT29）細(xì)胞24 h～48 h 只有TLR4基因轉(zhuǎn)錄水平輕微上調(diào)，而TLR2、TLR3、TLR7和TLR8基因的轉(zhuǎn)錄水平則隨著感染時(shí)間的延長而顯著升高，提示TLR4 在RV 感染的免疫應(yīng)答中并未起主要作用[8]。Pott 等的研究表明，RV 感染導(dǎo)致小鼠腸上皮細(xì)胞中TLR3基因的轉(zhuǎn)錄水平明顯升高，而TLR3缺失成年小鼠的腸上皮細(xì)胞分泌抗病毒或促炎性細(xì)胞因子則明顯減少[9]。Lopez-Guerrero 等則認(rèn)為病毒感染后TLR3、TLR7 和TLR9 可能參與了宿主的固有免疫應(yīng)答[10]。恒河猴輪狀病毒（Rhesus monkey rotavirus，RRV）刺激非肥胖糖尿病（Non obese diabe-tes，NOD）小鼠的脾細(xì)胞，可誘導(dǎo)抗原遞呈細(xì)胞（An-tigen presenting cell，APC）和B 細(xì)胞的活化，從而干擾TLR7 或干擾素α 受體（Interferon alpha receptor，IF-NAR）的信號(hào)通路；而感染RRV 的NOD 小鼠的漿細(xì)胞樣樹突狀細(xì)胞（Plasmacytoid dendritic cells，pDCs）則能夠觸發(fā)TLR7 信號(hào)通路的活化[11]。Vlasova 等用鼠李糖乳桿菌GG 株免疫SPF 仔豬，再進(jìn)行RV 攻毒試驗(yàn)的結(jié)果顯示，攻毒后小鼠的TLR3基因轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)，而TLR2和TLR4基因的轉(zhuǎn)錄水平下調(diào)[12]。本研究室檢測豬輪狀病毒（PRV）感染的小鼠骨髓樹突狀細(xì)胞（Murine bone marrow-derived DCs，BMDCs）發(fā)現(xiàn)，其中的TLR2和TLR3基因的轉(zhuǎn)錄水平均隨作用時(shí)間的延長而上調(diào)，而TLR4和TLR8基因的轉(zhuǎn)錄水平均低于對(duì)照組，表明TLR2 和TLR3 可能參與PRV 感染BMDCs 的免疫應(yīng)答，而TLR4 和TLR8 在PRV 感染后并未起主要作用[13]。

2 與RV 感染相關(guān)的TLRs 途徑

TLRs 通過病原體相關(guān)分子模式（Pathogen-associ-ated molecular patterns，PAMP）與β 干擾素TIR 結(jié)構(gòu)域銜接蛋白（TIR domain-containing adaptor inducing interferon-β，TRIF）、TLRs 接頭蛋白髓樣分化因子88（Myeloid differentiation factor 88，MyD88）、TIR 結(jié)構(gòu)域銜接蛋白（TIR domain-containing adaptor protein，TIRAP）、TIR 結(jié)構(gòu)域銜接分子2（TIR domain-contain-ing adaptor molecule 2，TICAM2）等結(jié)合，激活下游NF-κB 和干擾素調(diào)節(jié)因子3（Interferon regulatory fac-tors，IFR3）等參與宿主的固有免疫應(yīng)答[14]。MyD88和TRIF 是TLRs 信號(hào)通路中2 個(gè)重要的接頭蛋白，TLRs 通過MyD88 依賴/非依賴型信號(hào)途徑活化NFκB，并分泌多種炎癥因子產(chǎn)生抗病毒的免疫應(yīng)答。

2.1 MyD88 依賴型TLRs 信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的通路MyD88包含N 端DD、中間結(jié)構(gòu)域ID 和C 端Toll/IL-1 受體結(jié)構(gòu)域，其通過C 端結(jié)構(gòu)域與TLRs 結(jié)合，激活NF-κB和促分裂素原活化蛋白激酶（Mitogen-activated pro-tein kinases，MAPK）信號(hào)通路，誘導(dǎo)促炎性細(xì)胞因子的分泌，該途徑屬于MyD88 依賴型TLRs 信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路[15]。TLR-MyD88/IRAK-NF-κB 誘導(dǎo)激酶（NIK）/NF-κB 和TLR-MyD88/IRAK-MAPK 信號(hào)途徑，均能夠促進(jìn)DCs 分泌MHC I 和MHC II 類分子，從而誘導(dǎo)促炎性細(xì)胞因子（如TNF、IL-6、IL-1 等）和趨化因子（如CCL4）等的表達(dá)[16]。

MyD88缺失小鼠的小腸上皮細(xì)胞對(duì)RV 易感，導(dǎo)致RV 的傳播能力增強(qiáng)，機(jī)體的免疫應(yīng)答水平降低，IL-β 和IL-18 的轉(zhuǎn)錄水平無明顯變化，表明RV 感染后小鼠的MyD88 信號(hào)通路是參與其固有免疫反應(yīng)的關(guān)鍵[17]。Walther 等的研究結(jié)果顯示， RRV 感染MyD88缺失的小鼠，小鼠全部死亡，其肝臟中IFNγ 和腫瘤壞死因子α（Tumor necrosis factor-α，TNFα）的轉(zhuǎn)錄水平與對(duì)照組無明顯差異，表明其免疫應(yīng)答水平較低[18]。RRV 感染小鼠的膽管細(xì)胞能分泌高水平的遷移率族蛋白B1（High mobility group protein box-1，HMGB1），HMGB1 通過TLR2 和TLR4 可以誘導(dǎo)活化NK 細(xì)胞，與野生B6 小鼠比較，TLR基因缺失的成年小鼠可通過HMGB1-TLRs-MAPK 信號(hào)通路升高CD69、TNF-α 和IFN-γ 的基因轉(zhuǎn)錄水平[19]。上述結(jié)果表明，MyD88基因缺失小鼠對(duì)RV 感染的敏感性可能增加，這可能與小鼠機(jī)體內(nèi)的微生物群與RV感染復(fù)雜的相互作用有關(guān)[20]。RV 感染后，宿主MyD88 介導(dǎo)的TLRs 信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路能夠抑制病毒的感染與傳播，但MyD88基因缺失小鼠能否直接識(shí)別RV的成分尚不清楚。

2.2 MyD88 非依賴型TLRs 信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的通路MyD88非依賴型TLR 信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路又稱TRIF（IFN-β）依賴型信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。與TLR2、TLR7、TLR8 均屬于MyD88依賴型信號(hào)通路不同，TLR3屬于TRIF依賴型的TLRs/NF-κB 信號(hào)通路，誘導(dǎo)NF-κB 的活化。而TLR4 卻有MyD88 依賴型和TRIF 依賴型兩種信號(hào)通路[21]。

TLR3 被蛋白酪氨酸激酶磷酸化后募集TRIF，活化的TRIF 從TLR3 中分離出來，通過與腫瘤壞死因子受體作用因子3（TNF receptor associated factors 3，TRAF3）和TRAF6 相互作用并向下游傳遞信號(hào)，誘導(dǎo)IRF3 和NF-κB 的活化，促進(jìn)炎性細(xì)胞因子的表達(dá)。TLR3 募集TRIF 有兩條信號(hào)通路：一是TRIF 的氨基端與TRAF6 的梭基端結(jié)合，再與受體蛋白激酶1（Receptor interacting protein kinase 1，RIPK-1）相互作用，從而誘導(dǎo)NF-κB 的活化；二是磷酸化的TRAF3、二聚化的Kappa B 抑制因子激酶（Inhibitor of kappa B kinase，IKK）與IRF3 結(jié)合，誘導(dǎo)I 型干擾素基因的表達(dá)[22]。

TRIF基因缺失小鼠的信號(hào)通路研究中，TLR4 激活I(lǐng)RF3 和產(chǎn)生IFN-β 的能力減弱，炎性細(xì)胞因子的分泌減少；而脂多糖刺激TRIF和MyD88基因雙缺失的巨噬細(xì)胞，NF-κB 的活化和炎癥細(xì)胞因子的表達(dá)均受到抑制[23]。Bagchi 等研究牛RV 與HT29 細(xì)胞的相互作用機(jī)制發(fā)現(xiàn)，RV 感染4 h 即可在HT29 細(xì)胞中檢測到腫瘤壞死因子受體作用因子2（TRAF2）的降解，但在非結(jié)構(gòu)性蛋白質(zhì)1（Nonstructural protein 1，NSP1）突變株感染RV 的HT29 細(xì)胞中并未檢測到TRAF2 的降解，表明NSP1 通過降解TRAF2 的作用，抑制NF-κB 的活化和IFN 的表達(dá)，導(dǎo)致RV 的增殖且逃避宿主的固有免疫反應(yīng)[24]。本研究室檢測PRV 感染48 h 的TRIF基因缺失小鼠腸系膜淋巴結(jié)（Mesenter-ic lymph node，MLN）中MyD88、NF-κB、TRAF3和TRAF6基因的轉(zhuǎn)錄水平，結(jié)果顯示TRIF基因缺失抑制了NF-κB和TRAF3基因的轉(zhuǎn)錄水平，但對(duì)MyD88和TRAF6基因的轉(zhuǎn)錄水平影響較小，減弱了MLN 中DCs 向不同亞群分化的能力，抑制MHC II 類分子和共刺激分子CD40、CD80 和CD86 的表達(dá)[25]。綜上所述，TRIF基因缺失對(duì)TRAF3/NF-κB 信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路有抑制作用，TRIF 及其介導(dǎo)的信號(hào)通路在抗RV 的感染中發(fā)揮重要作用。

2.3 與RV 感染相關(guān)的干擾素途徑病毒感染可通過TLRs 和維甲酸誘導(dǎo)基因I 受體（RIG-I like recep-tors，RLR）通路啟動(dòng)IRFs，表達(dá)I 型IFN（IFN-α 和IFN-β）或II 型IFN（IFN-γ）參與抗病毒反應(yīng)。RV 能促進(jìn)鼠胚胎成纖維細(xì)胞和BMDCs 的活化，上調(diào)表達(dá)細(xì)胞表面標(biāo)志，促進(jìn)I 型IFNs 的產(chǎn)生。RRV 感染IRF3缺失小鼠的BMDCs 后，可通過IRF3 依賴途徑調(diào)節(jié)I 型IFN 的表達(dá)，而TLR3和MyD88基因均缺失小鼠的BMDCs 表達(dá)的I 型IFNs 與對(duì)照組相同，表明這些反應(yīng)不依賴TLRs 信號(hào)通路[26]。Hakim 等利用英夫利昔單抗阻斷TNF-α 發(fā)揮作用，結(jié)果導(dǎo)致IFN-α 和IFN-β1 的表達(dá)量均降低，進(jìn)一步研究表明TNF-α 具有潛在的抗RV 效應(yīng)，而該效應(yīng)是通過NF-κB 信號(hào)通路實(shí)現(xiàn)的[27]。不同RV 的NSP1 蛋白可降解不同的IRFs，人RV 的NSP1 主要通過降解IRF5 和IRF7 來抑制IFN 信號(hào)通路，而動(dòng)物RV 的NSP1 主要通過降解IRF3、IRF5 和IRF7 來抑制IFN-β 的產(chǎn)生。與高劑量的IFN-γ 單刺激相比，IL-22 和低劑量的IFN-γ聯(lián)合刺激誘導(dǎo)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄激活因子1（Signal transducerand activator of transcription 1，STAT1）磷酸化的能力較強(qiáng)，表明IL-22 和IFN-λ 協(xié)作能夠促進(jìn)STAT1 的活化，從而抑制RV 的復(fù)制[28]。以上研究表明，III 型IFNs 在抗RV 感染的固有免疫反應(yīng)中也起重要作用。

2.4 RV 感染后宿主的T 細(xì)胞、B 細(xì)胞免疫反應(yīng)TLRs 可通過激活NF-κB 和IRF3 等誘導(dǎo)多種抗炎細(xì)胞因子分泌和I 型IFN 表達(dá)，激活固有免疫反應(yīng)。嬰幼兒急性RV 感染的血清中IL-6、IL-10 和IFN-γ 表達(dá)量明顯增加，Th1 和Th2 類細(xì)胞因子均參與了宿主的免疫應(yīng)答[29]，RV 感染通過MyD88 信號(hào)通路能夠誘導(dǎo)宿主Th1 反應(yīng)，MyD88基因缺失不能阻斷IL-1β 和IL-18 信號(hào)的產(chǎn)生，導(dǎo)致RV 特異性IgA、IgG2 和IgG1的分泌減少[30]。細(xì)菌鞭毛蛋白能夠預(yù)防小鼠感染RV，這是因?yàn)楸廾鞍啄軌蛲ㄟ^DCs 表達(dá)TLR5/NL-RC4 途徑，調(diào)節(jié)IL-22 和IL-18 的分泌[31]。RV 與人外周血單核細(xì)胞（Peripheral blood mononuclear cells，PBMC）相互作用時(shí)，PBMC 中的pDCs 減少了91%，結(jié)果導(dǎo)致IFN-α 的分泌量減少95%，IFN-γ 的分泌量也相應(yīng)減少，表明pDCs 在刺激宿主產(chǎn)生RV 特異記憶性T 細(xì)胞中起重要作用[32]。

RV 感染小鼠小腸的pDCs 通過分泌I 型IFN（IFN-α 和IFN-β）調(diào)節(jié)B 細(xì)胞活化并參與免疫應(yīng)答反應(yīng)，利于RV 的清除[33]。RRV 能刺激宿主B 細(xì)胞的活化， 誘 導(dǎo)CD69 的 表 達(dá)， 但B 細(xì) 胞 的 活 化 需CD11c+DCs 的參與[34]。阻斷TRIF 信號(hào)通路的傳導(dǎo)或TRIF基因的缺失，細(xì)胞因子IL-6、IL-10、IL-12 和IFN-γ 的分泌量降低，DCs 分泌細(xì)胞因子和刺激T 淋巴細(xì)胞增殖的能力減弱[25]。上述結(jié)果表明，RV 感染時(shí)Th1 和Th2 型細(xì)胞因子均發(fā)揮作用，且急性感染后期以Th1 型細(xì)胞反應(yīng)為主。

3 小結(jié)與展望

RV 通過影響與宿主TLRs 信號(hào)通路轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)基因的表達(dá)，刺激宿主炎性細(xì)胞的分泌造成黏膜損傷，其NSP1 可通過降解宿主IRFs 來拮抗IFN-β 的產(chǎn)生，從而抑制STAT1、STAT2 和NF-κB 的表達(dá)，逃避宿主抗病毒的固有免疫反應(yīng)。TLRs 下游基因的缺失也將影響RV 感染后宿主DCs 所誘導(dǎo)的黏膜免疫分子機(jī)制。阻斷TRIF 信號(hào)可抑制TRAF3 和TRAF6 的泛素化過程，使NF-κB 的活化受阻，促炎細(xì)胞因子分泌的減少。本研究室利用TRIF 阻斷劑（Pepinh-TRIF）阻斷TLRs 關(guān)鍵接頭分子的TRIF 信號(hào)后發(fā)現(xiàn)，PRV 感染小鼠BMDCs 的表型分化、基因轉(zhuǎn)錄以及細(xì)胞因子的分泌均受到影響，且抑制了TRAF3/NF-κB 信號(hào)通路的轉(zhuǎn)導(dǎo)，表明TRIF 信號(hào)通路在抗PRV 感染中發(fā)揮重要作用（數(shù)據(jù)未發(fā)表）。進(jìn)一步探究缺失MyD88基因或雙阻斷TRIF 和MyD88 信號(hào)通路后，RV 感染宿主DCs所介導(dǎo)的TLRs 信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的變化，對(duì)了解宿主抗RV 感染的固有免疫機(jī)制，促進(jìn)RV 疫苗的研究有重要意義。