納米佐劑N-2-HACC/CMCS對雞新城疫病毒和H9禽流感病毒二聯(lián)滅活疫苗免疫效果的評價

趙 志，高 遠，舒建洪，孫德君，金 政，趙 凱,6*

（1.黑龍江大學農(nóng)業(yè)微生物技術教育部工程研究中心，黑龍江 哈爾濱 150500；2.黑龍江大學生命科學學院黑龍江省普通高校微生物重點實驗室，黑龍江 哈爾濱 150080；3.臺州學院生命科學學院/納米生物材料與免疫學研究所，浙江 臺州 318000；4.浙江理工大學生命科學與醫(yī)藥學院，浙江 杭州 310018；5.哈藥集團生物疫苗有限公司，黑龍江 哈爾濱 150069；6.浙江洪晟生物科技股份有限公司，浙江 紹興 312366）

雞新城疫（Newcastle disease，ND）是由ND 病毒（NDV）引起雞的呼吸道疾病。NDV 可以感染各生長階段的雞。該病發(fā)病率較高，但根據(jù)雞日齡不同表現(xiàn)的臨床癥狀略有不同，通常的臨床表現(xiàn)為腹瀉、呼吸困難、倒提可流出酸臭味液體，甚至大量死 亡[1]。禽 流 感（Avian influenza，AI）是 由AI 病 毒（AIV）引起雞的一類高度傳染性疾病，根據(jù)其致病性可分為高致病性和低致病性AIV，H9 亞型屬于低致病性AIV[2]。H9 AIV 具有隱性傳播的特點，發(fā)病雞臨床癥狀表現(xiàn)不明顯，可以導致雞產(chǎn)蛋量大幅下降并且更易繼發(fā)其它疾病，同時發(fā)病雞的糞口均會排出大量病毒，迅速感染周圍禽類，給養(yǎng)禽業(yè)造成了重大經(jīng)濟損失[3]。

疫苗接種是防制ND 和AI 等疾病的主要措施。滅活疫苗具有安全性高、副作用小等特點，但存在抗體產(chǎn)生較慢、抗體水平較低等問題，而在疫苗中添加免疫佐劑可以顯著提高滅活疫苗的免疫效果[4]。殼聚糖具有良好的生物相容性、生物降解性和佐劑活性，但其存在水溶性差等問題[5]。針對殼聚糖水溶性差的問題，本研究團隊通過將2-羥丙基三甲基氯化銨取代殼聚糖氨基中的氫原子合成了水溶性好且性能更優(yōu)異的N-2-羥丙基三甲基氯化銨殼聚糖（N-2-HACC），其不但具有殼聚糖的優(yōu)良特性同時還易溶于水[6]。N,O-羧甲基殼聚糖（CMCS）不僅對細胞無毒性，且具有生物相容性好等特點，由于羧基的引入，羧甲基殼聚糖的水溶性良好，且保留了殼聚糖的生物相容性和生物可降解性等優(yōu)點。但由于CMCS 帶負電荷，不利于其與疫苗抗原的結合，因此，多采用CMCS 與其他殼聚糖衍生物交聯(lián)制備成微球或納米?；蛩z[7]。本研究將N-2-HACC 和CMCS 交聯(lián)合成了N-2-HACC/CMCS納米粒，并以N-2-HACC/CMCS 為佐劑制備了NDV 和H9 AIV 二聯(lián)滅活疫苗，并利用雞體內免疫實驗評估了該二聯(lián)滅活疫苗的免疫原性，為N-2-HACC/CMCS 納米粒在疫苗佐劑中的應用奠定實驗基礎。

1 材料與方法

1.1 主要實驗材料60 只3 日齡SPF 雞由哈藥集團生物疫苗有限公司提供并飼養(yǎng)；NDV La Sota 株（病毒含量108.5EID50/0.1 mL）、H9 亞型AIV HZ 株（病毒含量107.5EID50/0.1 mL）、NDV+H9 AIV 商品二聯(lián)滅活疫苗（生產(chǎn)批號202042）、1%雞紅細胞懸液，均由哈藥集團生物疫苗有限公司提供；血凝抑制（HI）試驗用的雞NDV、H9 亞型AIV 抗原，購自哈爾濱維科生物技術有限公司；雞γ 干擾素（IFN-γ）、白細胞介素2（IL-2）、白細胞介素4（IL-4）ELISA 檢測試劑盒，購自上海酶聯(lián)生物科技有限公司；白油（Marcol-52）購自美孚石油公司；N-2-HACC 由本實驗室合成；CMCS 購 自Sigma 公 司。

1.2 納米佐劑N-2-HACC/CMCS 的合成及物理性狀檢測按照本實驗室建立的方法合成N-2-HACC/CMCS[8]。通過透射電子顯微鏡觀察N-2-HACC/CMCS的形態(tài)，通過激光粒度儀測定N-2-HACC/CMCS 的粒徑大小和Zeta 電位。

1.3 N-2-HACC/CMCS NDV+H9 AIV 二聯(lián)滅活疫苗的制備及檢測將NDV La Sota 株和H9 AIV HZ 株滅活病毒液按體積比1：1 混合后，加入N-2-HACC/CMCS（按0.5 mg/mL 病毒混合液的劑量添加），與白油（添加量為病毒液總量的1.3 倍）在12 000 r/min 乳化5 min 后制成N-2-HACC/CMCS NDV+H9 AIV 二聯(lián)滅活疫苗（簡稱為佐劑二聯(lián)滅活疫苗）。根據(jù)現(xiàn)行《中國獸藥典》要求對制備的疫苗進行外觀、劑型、穩(wěn)定性、無菌和安全性檢測[9]。將10 mL 佐劑二聯(lián)滅活疫苗3 000 r/min 離心15 min，測量離心管底部析出的水相體積，將該疫苗在37 ℃放置21 d 后觀察是否破乳，以檢測其穩(wěn)定性；將10 只3 日齡SPF 雞于頸部皮下接種0.6 mL 佐劑二聯(lián)滅活疫苗，在14 d 的觀察期，觀察雞的生長、精神狀態(tài)、飲食、注射部位等有無變化，以評價佐劑二聯(lián)滅活疫苗的安全性。

1.4 疫苗的免疫及免疫后的NDV 和AIV HI 抗體的檢測將50 只3 日齡SPF 雞平均分為5 組，分別于頸部皮下注射佐劑二聯(lián)滅活疫苗0.2 mL/只、商品二聯(lián)滅活疫苗0.2 mL/只、佐劑二聯(lián)滅活疫苗0.3 mL/只、商品二聯(lián)疫苗0.3 mL/只及空白對照組。在免疫后7 d、14 d 和21 d 分別經(jīng)翅靜脈采血，分離血清，按照現(xiàn)行《中國獸藥典》附錄3404 HI 試驗（微量法）測定免疫雞血清中NDV 和AIV 的HI 抗體效價，并分析免疫劑量與血清中HI 抗體水平的相關性。NDV HI 抗體效價≥4.0log2 判定為免疫合格，AIV HI 抗體效價≥6.5log2 判定為免疫合格[9]。

1.5 疫苗免疫后血清中細胞因子的檢測利用ELI-SA 試劑盒檢測1.4 中收集的各免疫組各時間點血清中IFN-γ、IL-2和IL-4含量。具體操作方法見試劑盒說明書。

2 結 果

2.1 N-2-HACC/CMCS 的物理性狀分析通過透射電鏡與激光粒度儀檢測N-2-HACC/CMCS 的形態(tài)、粒徑大小和電位，結果顯示，N-2-HACC/CMCS 形態(tài)呈圓形，粒徑大小較為均一（圖1A），平均粒徑大小為162.6±16.0 nm（圖1B），Zeta 電位為32.83±4.24 mV（圖1C）。表明，制備的N-2-HACC/CMCS 形態(tài)規(guī)則、分散性好可用于后續(xù)實驗。

圖1 N-2-HACC/CMCS的形態(tài)（A）、粒徑（B）及電位（C）分析Fig.1 Analysis of morphology(A),particle size(B)and potential(C)of N-2-HACC/CMCS

2.2 N-2-HACC/CMCS NDV+H9 AIV 二聯(lián)滅活疫苗的性狀檢測按照《中國獸藥典》要求對佐劑二聯(lián)滅活疫苗的性狀進行檢測[9]，結果顯示，制備的二聯(lián)滅活疫苗外觀呈乳白色均勻乳劑，劑型為油包水型；將10 mL 二聯(lián)滅活疫苗3 000 r/min 離心15 min，離心管底部未見水相析出；在37 ℃下放置21 d 未出現(xiàn)破乳，無菌檢驗符合規(guī)定；安全性檢驗結果顯示，10只雞均健活且注射部位和全身無不良反應。

2.3 免疫雞血清中NDV 和AIV HI 抗體的測定結果分別在各劑量疫苗免疫后不同時間采血分離血清，通過HI 試驗檢測血清中NDV 和AIV HI 抗體效價，結果顯示，在免疫劑量為0.2 mL 時，佐劑二聯(lián)滅活疫苗免疫雞血清中NDV HI 抗體效價均在免疫后7 d、14 d、21 d分別為6.8log2、8.0log2和8.0log2，其中免疫后7 d 和14 d 的HI 抗體效價均極顯著高于商品二聯(lián)滅活疫苗組雞血清中的NDV HI 抗體效價（4.0log2、5.8log2 和8.0log2）（圖2A）（P<0.01）；佐劑二聯(lián)滅活疫苗免疫雞血清中AIV HI 抗體效價在免疫后7 d、14 d和21 d 分別為5.8log2、7.6log2 和10.8log2，均極顯著高于商品二聯(lián)滅活疫苗組雞血清中AIV HI 抗體效價（3.0log2、6.8log2、8.5log2）（圖2B）（P<0.01）。

免疫劑量為0.3 mL 時，佐劑二聯(lián)滅活疫苗免疫雞血清中的NDV HI 抗體效價在免疫后7 d 、14 d 和21 d 分別為7.0log2、8.0log2 和8.5log2，其中免疫后7 d 和14 d 雞血清中的HI 抗體效價均極顯著高于商品二聯(lián)滅活疫苗免疫雞（5.0log2、6.6log2 和8.4log2）（圖2A）（P<0.01）；佐劑二聯(lián)滅活疫苗免疫雞血清中AIV HI 抗體效價在免疫后7 d、14 d 和21 d 分別為6.0log2、8.0log2 和10.8log2，均極顯著高于商品二聯(lián)滅活疫苗雞血清中的AIV HI 抗體效價（4.0log2、8.0log2、9.0log2）（圖2B）（P<0.01）。空白對照組雞血清中AIV 和NDV 的HI 抗體效價在免疫后7 d、14 d和21 d 均為0。

上述結果表明，以N-2-HACC/CMCS 為佐劑制備的NDV+AIV 二聯(lián)疫苗誘導免疫雞產(chǎn)生的NDV 和AIV HI抗體效價均顯著高于商品二聯(lián)滅活疫苗，免疫原較強性。

2.4 免疫劑量與免疫雞血清中HI 抗體水平的相關性分析免疫后7 d 和14 d 時，0.3 mL 商品二聯(lián)疫苗免疫雞血清中NDV HI 抗體效價均極顯著高于0.2 mL商品二聯(lián)疫苗免疫雞（P<0.01），而在免疫后21 d 時，0.3 mL 與0.2 mL 商品二聯(lián)疫苗免疫雞血清中NDV HI抗體效價差異不顯著（P>0.05）；佐劑二聯(lián)滅活疫苗免疫雞后7 d、14 d 和21 d 時，0.3 mL 和0.2 mL 免疫雞血清中NDV HI 抗體效價差異也不顯著（P>0.05）（圖2）。

圖2 免疫雞血清中NDV（A）與AIV（B）HI抗體水平的測定Fig.2 Determination of NDV(A)and AIV(B)HI antibody levels in serum of immunized chickens

商品二聯(lián)疫苗免疫雞后7 d、14 d 和21 d 時，0.3 mL 免疫組雞血清中的AIV HI 抗體效價均極顯著高于0.2 mL 免疫劑量組雞（P<0.01）；佐劑二聯(lián)滅活疫苗免疫雞在免疫后7 d、14 d 和21 d 時，0.3 mL 免疫雞與0.2 mL 免疫雞血清中的AIV HI 抗體效價差異不顯著（P>0.05）。

綜上，免疫0.3 mL 商品二聯(lián)滅活疫苗雞產(chǎn)生的NDV 和AIV HI 抗體效價較免疫0.2 mL 該疫苗雞產(chǎn)生的NDV 和AIV HI 抗體效價更高，免疫劑量和抗體效價呈正相關；而分別免疫0.3 mL 和0.2 mL 佐劑二聯(lián)滅活疫苗免疫雞產(chǎn)生的NDV 和AIV HI 抗體效價基本相近，且抗體效價均較高，免疫劑量和抗體效價無相關性，且佐劑二聯(lián)滅活疫苗免疫雞比商品二聯(lián)滅活疫苗免疫雞產(chǎn)生了更高的NDV 和AIV HI 抗體效價。表明N-2-HACC/CMCS 不僅可以提高免疫雞血清中NDV 和AIV HI 抗體效價，而且還可以減少疫苗制備中的抗原用量。

2.5 免疫雞血清中細胞因子的測定結果通過ELISA試劑盒檢測各免疫組雞血清中IFN-γ、IL-2 和IL-4 含量。結果顯示，免疫后21 d，0.2 mL佐劑二聯(lián)滅活疫苗和商品二聯(lián)滅活疫苗免疫雞血清中的IFN-γ、IL-2、IL-4 含量均極顯著高于免疫后7 d 和14 d 相應各組雞血清中的相應細胞因子含量（P<0.01），而在免疫后21 d，0.3 mL 佐劑二聯(lián)滅活疫苗和商品二聯(lián)滅活疫苗免疫雞血清中IFN-γ、IL-2、IL-4含量與免疫后7 d和14 d相比無明顯升高（圖3）（P>0.05）。

免疫后7 d、14 d和21 d，免疫0.2 mL 佐劑二聯(lián)滅活疫苗組雞血清中IFN-γ（68.80 pg/mL、106.13 pg/mL、136.77 pg/mL）、IL-2（341.75 pg/mL、379.04 pg/mL、443.51 pg/mL）、IL-4（147.15 pg/mL、167.13 pg/mL、233.24 pg/mL）的含量均極顯著高于其他免疫組（P<0.01）（圖3），表明0.2 mL 佐劑二聯(lián)滅活疫苗即可以很好地促進免疫雞細胞因子的表達。

圖3 免疫雞血清中IL-2、IFN-γ、IL-4含量的測定Fig.3 Detection of cytokines in serum from immunized chickens

3 討 論

佐劑能夠提高抗原的免疫效果，且不同佐劑的免疫增強作用存在差異[10-11]。董浩蘇等證明了殼聚糖具有免疫增強作用[12]，與本實驗中的N-2-HACC/CMCS 作為佐劑可以提高NDV 和AIV HI 抗體效價和相應細胞因子含量的結論相同。

李新生等的研究顯示，NDV、雞傳染性支氣管炎病毒和AIV（H9）三聯(lián)滅活疫苗免疫劑量與血清HI抗體效價量呈正相關[13]。本實驗結果顯示，隨著免疫劑量的增加，商品二聯(lián)滅活疫苗免疫雞血清中的HI 抗體水平也相應增加。但王麗萍等報道，高劑量的滅活疫苗會影響雞對飼料中鈣和磷的利用率，從而對產(chǎn)蛋率產(chǎn)生不利影響[14]。本研究結果顯示N-2-HACC/CMCS 為佐劑的NDV+AIV 二聯(lián)疫苗的免疫劑量和雞的抗體效價無相關性，0.2 mL 佐劑二聯(lián)滅活疫苗免疫雞即產(chǎn)生了較好的免疫效果，可以有效避免高劑量滅活疫苗影響雞產(chǎn)蛋率這一問題。

IFN-γ 和IL-2 為Th1 型細胞因子，IL-4 為Th2 型細胞因子。本實驗中0.2 mL 的佐劑二聯(lián)滅活疫苗即可誘導雞產(chǎn)生更高水平的IFN-γ、IL-2 和IL-4，表明N-2-HACC/CMCS 能夠在誘導Th2 型免疫反應的同時更好的誘導Th1 型免疫反應。彭越等研究顯示，N-2-HACC/CMCS 可以通過激活cGAS-STING 信號通路更好的誘導細胞免疫[15]。本研究中免疫劑量為0.3 mL 時的疫苗均未能誘導更高水平的IFN-γ、IL-2和IL-4，劉海斌等同樣認為機體的免疫應答需要在一定的疫苗劑量范圍之內，這可能由于疫苗中用于病毒滅活的化學物質在高劑量時會導致機體應激水平的增強，從而產(chǎn)生免疫麻痹[16]。上述結果表明，低劑量N-2-HACC/CMCS 制備的疫苗在保證免疫效果的同時安全性更高。

綜上所述，N-2-HACC/CMCS 可以作為NDV 和AIV 滅活疫苗的有效佐劑，且制備的N-2-HACC/CMCS NDV+H9 AIV 二聯(lián)滅活疫苗免疫劑量為0.2 mL即可達到較好的免疫效果。本研究為納米佐劑在禽類滅活疫苗中的應用提供了參考依據(jù)。