bvfA基因?qū)Σ剪斒暇鶶19株生物學(xué)特性及睪丸支持細(xì)胞影響的研究

賈 芳，王 鑫，王玉炯，劉 軍*，周學(xué)章

（1.寧夏大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院/西部特色生物資源保護(hù)與利用教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，寧夏 銀川 750021；2.內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院內(nèi)蒙古自治區(qū)分子生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010110；3.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院長(zhǎng)春獸醫(yī)研究所，吉林 長(zhǎng)春 130122）

布魯氏菌是一種胞內(nèi)寄生的革蘭陰性小桿菌，無莢膜、芽孢等細(xì)菌毒力物質(zhì)，其毒力主要體現(xiàn)于其在專職和非專職吞噬細(xì)胞中生存和增殖能力[1]。布魯氏菌感染巨噬細(xì)胞后，在巨噬細(xì)胞內(nèi)破壞囊泡運(yùn)輸并創(chuàng)造一個(gè)獨(dú)特的細(xì)胞內(nèi)復(fù)制環(huán)境供其增殖[2]。

布魯氏菌在胞內(nèi)生存與其毒力因子有關(guān)，包括外膜蛋白[3-4]、脂多糖[5]、二元調(diào)控系統(tǒng)[6]、Ⅳ型分泌系統(tǒng)（T4SS）[7]等，其中virB 操縱子調(diào)控的T4SS 分泌系統(tǒng)在布魯氏菌胞內(nèi)的生存、復(fù)制中發(fā)揮重要作用，因此T4SS 分泌系統(tǒng)受到廣泛關(guān)注。bvfA布魯氏菌毒力因子A（Brucellavirulence factor A）是在研究T4SS 分泌系統(tǒng)時(shí)發(fā)現(xiàn)的一個(gè)新的毒力基因，也是布魯氏菌屬特有的一種基因， 研究發(fā)現(xiàn)豬布魯氏菌B. suis1330bvfA::kan突 變 體 在THP1 細(xì) 胞、J774 細(xì) 胞和HeLa細(xì)胞內(nèi)增殖顯著低于親本株，同時(shí)該研究發(fā)現(xiàn)B.suis1330bvfA::kan突變體感染小鼠第4 周和8 周時(shí)，脾臟中的布魯氏菌數(shù)量顯著少于親本株[8]。B. suis1330bvfA::kan突變體在體內(nèi)和體外模型中毒力均高度減弱，表明bvfA基因在布魯氏菌體內(nèi)外生存中起重要作用。然而，bvfA基因是否對(duì)布魯氏菌的生長(zhǎng)和對(duì)適應(yīng)宿主內(nèi)環(huán)境的影響未見報(bào)道。另外，布魯氏菌感染常引起動(dòng)物生殖器官疾病，雄性動(dòng)物感染布魯氏菌常引起睪丸炎和附睪炎。睪丸支持細(xì)胞能為生殖細(xì)胞的分化提供營(yíng)養(yǎng)和支持，能吞噬、消化精子形成過程中腔內(nèi)殘留的細(xì)胞質(zhì)和發(fā)育中部分退化的生精細(xì)胞，以維持穩(wěn)定的微環(huán)境，最終實(shí)現(xiàn)精子發(fā)生[9]。而bvfA基因是否影響布魯氏菌對(duì)睪丸支持細(xì)胞的侵入和增殖未見報(bào)道。

因此，本研究分析了bvfA基因?qū)Σ剪斒暇鶶19 菌株生物學(xué)特性及睪丸支持細(xì)胞影響的研究，證實(shí)bv-fA基因參與調(diào)控布魯氏菌S19 菌株對(duì)環(huán)境的適應(yīng)性，揭示bvfA基因?qū)Σ剪斒暇c細(xì)胞共存以維持細(xì)菌的增殖起重要的作用，為布魯氏菌致病機(jī)制和bvfA基因的功能解析提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 菌株、細(xì)胞系及實(shí)驗(yàn)動(dòng)物布魯氏菌S19 菌株（親本株）、 S19ΔbvfA（缺失株）和S19ΔbvfA/bvfA（回補(bǔ)株）均在長(zhǎng)春獸醫(yī)研究所P3 實(shí)驗(yàn)室完成構(gòu)建；小鼠睪丸支持細(xì)胞（TM4 細(xì)胞）購(gòu)自國(guó)家實(shí)驗(yàn)細(xì)胞資源共享服務(wù)平臺(tái)（http://www.cellresource.cn/）；5 周齡SPF級(jí)雌性BALB/c 小鼠（進(jìn)實(shí)驗(yàn)室適應(yīng)1 周開始實(shí)驗(yàn)）、墊料和鼠糧購(gòu)自北京斯貝福公司。小鼠飼養(yǎng)在P3 實(shí)驗(yàn)室小鼠隔離籠系統(tǒng)Isocage TM 中（意大利，Tecni-plast）。

1.2 主要試劑DMEM 高糖培養(yǎng)基（SH30022.01B）購(gòu)自Hyclone 公司；胎牛血清（04-001-1A）購(gòu)自Bio-logical Industrial 公司；胰酪胨大豆肉湯培養(yǎng)基（TSB）和胰蛋白胨大豆瓊脂培養(yǎng)基（TSA）購(gòu)自青島海博生物技術(shù)有限公司；CCK-8（CK04-1000T）購(gòu)自日本Dojindo；乳酸脫氫酶檢測(cè)試劑盒（LDH Assay Kit，C0017）購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司。

1.3 各菌株生長(zhǎng)曲線的測(cè)定將S19、S19ΔbvfA和S19 ΔbvfA/bvfA菌株分別接種于TSA 平板，37 ℃培養(yǎng)60 h后挑取單菌落接種到TSB 培養(yǎng)基中，置于37 ℃，120 r/min 震蕩培養(yǎng)，每隔2 h 測(cè)其吸光值（OD600nm），每組3 個(gè)重復(fù)，以O(shè)D600nm平均值為縱坐標(biāo)，時(shí)間為橫坐標(biāo)繪制生長(zhǎng)曲線。

1.4 各菌株體外應(yīng)激水平的檢測(cè)將生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)期的3 株菌以1：100 的比例分別接種于高熱（42 ℃40 min）、高鹽（1.5 mol/L NaCl，37 ℃，40 min）、高滲（0.5 mol/L山梨醇，37 ℃，40 min）、氧化壓力（0.003% H2O2，37 ℃，40 min）、酸（pH 4.0，37 ℃，10 min）和含抗菌素（0.5 mol/L多粘菌素B，37 ℃，40 min）的TSB培養(yǎng)基讓其適應(yīng)后，取菌液10 倍倍比稀釋取100 μL 涂布于TSA 平板，37 ℃培養(yǎng)72 h 后進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)，取對(duì)數(shù)，比較各組菌落數(shù)，每組3個(gè)重復(fù)，檢測(cè)其應(yīng)激水平。

1.5 各菌株侵入TM4 細(xì)胞能力的測(cè)定將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞按1.0×105/孔接種于12 孔板，于37 ℃5% CO2條件下培養(yǎng)12 h，棄上清，PBS 洗滌3 次，3 株菌分別以MOI 100 感染TM4 細(xì)胞，培養(yǎng)3 h、12 h、24 h和48 h 后棄上清，每孔加1 mL 含100 μg/mL 慶大霉素的DMEM 高糖培養(yǎng)基培養(yǎng)2 h 以殺死細(xì)胞外粘附的布魯氏菌。收集細(xì)胞加入500 μL 0.1%Triton X-100 于4 ℃靜置20 min 裂解細(xì)胞。10 倍倍比稀釋后取100 μL裂解液涂布于TSA 平板，置于37 ℃培養(yǎng)72 h 后菌落計(jì)數(shù)，取對(duì)數(shù)，計(jì)算每組菌落形成數(shù)（cfu/孔）。

1.6 各菌株對(duì)TM4 細(xì)胞活性影響的檢測(cè)將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞按1×104個(gè)/孔接種于96 孔板，3 株菌分別以MOI 100 感染TM4 細(xì)胞，37 ℃5%CO2培養(yǎng)3 h、12 h、24 h、48 h 后棄上清。PBS洗滌3次，每乳加入110 μL DMEM細(xì)胞培養(yǎng)原液（含10 μL CCK-8），繼續(xù)孵育4 h，測(cè)OD450nm值。按照說明書公式計(jì)算TM4細(xì)胞存活率（SR）=[（AsOD450nm值-AbOD450nm值）/（AcOD450nm值-AbOD450nm值）]×100%，其中Ab 為空白對(duì)照組（不含細(xì)胞）、Ac為陰性對(duì)照組（僅含細(xì)胞）、As為實(shí)驗(yàn)組（含細(xì)胞并分別感染3株菌），每組設(shè)6個(gè)重復(fù)。

1.7 各菌株對(duì)TM4 細(xì)胞損傷性的測(cè)定將TM4 細(xì)胞以1×104個(gè)/孔鋪于96 孔板中，3 株菌分別以MOI 100 感染TM4 細(xì)胞，感染后培養(yǎng)至12 h、24 h、48 h后離心取上清120 μL 到另一96 孔板中，各孔均加入60 μL LDH 檢測(cè)工作液，混勻，室溫避光孵育30 min后測(cè)OD490nm值。按照說明書公式計(jì)算細(xì)胞死亡率（%）=（處理樣品吸光值-樣品對(duì)照OD490nm值）/（細(xì)胞最大酶活性O(shè)D490nm值-樣品對(duì)照OD490nm值）×100，其中測(cè)得的各組吸光值均應(yīng)減去背景空白對(duì)照組吸光值，樣品對(duì)照組為未感染菌株的TM4 細(xì)胞。每組設(shè)6 個(gè)重復(fù)。

1.8 各菌株對(duì)小鼠毒力的測(cè)定將S19 和S19ΔbvfA菌株以1×106cfu/mL/只的劑量分別腹腔注射BALB/c 雌性小鼠，對(duì)照組為注射等體積生理鹽水組（100 μL/只），每組3只。在注射1周、2周、3周和4周后頸部脫臼迫殺小鼠稱重后取脾臟，稱脾重以計(jì)算脾指數(shù)，脾指數(shù)=脾臟重量（g）/體質(zhì)量（g）×100%[10]。將脾加入1 mL 0.1%Tri-ton X-100[11]勻漿（Tissuelyser-24L，上海凈信科技），取勻漿液作10倍倍比稀釋，取合適的稀釋度100 μL涂布于TSA 培養(yǎng)基上，37 ℃培養(yǎng)72 h 后進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)并取其對(duì)數(shù)，計(jì)算脾分離菌量（logcfu/脾）。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用平均值（-x）±標(biāo)準(zhǔn)差（s）或百分率%表示。計(jì)量資料多個(gè)樣本比較采用方差分析，兩兩比較用Student-Newman-Keuls 和Dun-nett 法。計(jì)數(shù)資料樣本間的比較用χ2檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1 各菌株生長(zhǎng)曲線的測(cè)定結(jié)果通過測(cè)定不同時(shí)間段細(xì)菌培養(yǎng)液的吸光值并繪制細(xì)菌生長(zhǎng)曲線，結(jié)果顯示：3 株菌均在12 h～30 h 處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，親本株和回補(bǔ)株在30 h～60 h 逐漸進(jìn)入平臺(tái)期，60 h后進(jìn)入衰亡期。而缺失株在大多數(shù)時(shí)間點(diǎn)較親本株和回補(bǔ)株生長(zhǎng)緩慢（P<0.05、P<0.01），且在30 h 后進(jìn)入衰亡期（圖1）。結(jié)果表明：bvfA基因缺失會(huì)減弱菌株體外增殖活性，與缺失株相比，S19ΔbvfA/bvfA菌株在基因組上回補(bǔ)了bvfA基因后增加了布魯氏菌的體外增殖能力。

圖1 布魯氏菌的生長(zhǎng)曲線Fig.1 Growth curves of B.abortus strains

2.2 各菌株體外應(yīng)激水平的檢測(cè)結(jié)果模擬環(huán)境因素檢測(cè)菌株的體外應(yīng)激能力，結(jié)果顯示：與親本株相比，缺失株在高熱（P<0.01）、高鹽（P<0.05）、高滲（P<0.05）、強(qiáng)酸和多粘菌素B壓力下（P<0.001）生長(zhǎng)均受到抑制，而在氧化壓力下生長(zhǎng)狀況良好（P<0.001）。而回補(bǔ)株在高熱（P<0.05）、高鹽（P<0.01）、高滲（P<0.05）和強(qiáng)酸壓力下（P<0.001）生長(zhǎng)均好于缺失株，但并未提高其對(duì)氧化應(yīng)激和抗菌素的適應(yīng)能力（P>0.05）（圖2）。結(jié)果表明，bvfA基因?qū)Σ剪斒暇m應(yīng)環(huán)境起到了顯著的調(diào)控作用。

圖2 布魯氏菌的體外應(yīng)激水平檢測(cè)結(jié)果Fig.2 Anti-stress level of B.abortus in vitro

2.3 各菌株侵入TM4 細(xì)胞能力的測(cè)定結(jié)果分別將感染3 株菌的TM4 細(xì)胞裂解液稀釋至10-5、10-6和10-7后，取100 μL 接 種 到TSA 平 板，培 養(yǎng)60 h 后 進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)，檢測(cè)細(xì)菌的侵襲力。結(jié)果顯示：3 h 時(shí)，僅有親本株和回補(bǔ)株侵入細(xì)胞內(nèi)，缺失株未見侵入。12 h 時(shí)，3 株菌均能侵入TM4 細(xì)胞，缺失株侵入TM4細(xì)胞富集到的菌落數(shù)顯著少于親本株（P<0.01）。24 h和48 h 時(shí)，3 株菌均能侵入TM4 細(xì)胞，且數(shù)量無顯著性差異（P>0.05）。表明缺失bvfA基因后布魯氏菌對(duì)TM4 細(xì)胞的侵入能力減弱。缺失株在侵入TM4 細(xì)胞12 h 之內(nèi)生長(zhǎng)慢于親本株（圖3），表明bvfA基因僅在感染早期影響布魯氏菌在TM4細(xì)胞中的增殖能力。

圖3 布魯氏菌對(duì)TM4細(xì)胞侵入能力影響的檢測(cè)Fig.3 Detection of the ability of B.abortus to invade in TM4 cells

2.4 各菌株對(duì)TM4 細(xì)胞活性影響的檢測(cè)結(jié)果利用CCK-8 法測(cè)定3 株菌對(duì)TM4 細(xì)胞增殖的影響，結(jié)果顯示：除了12 h 時(shí)S19ΔbvfA/bvfA菌株感染的TM4 細(xì)胞活性為63%外，在3 h、12 h、24 h 和48 h 時(shí)其他各組TM4 細(xì)胞的細(xì)胞活性均大于100%，尤其在3 h 時(shí)，各組細(xì)胞均生長(zhǎng)良好，各組在各時(shí)間點(diǎn)的活性均差異不顯著（P>0.05）（圖4）。結(jié)果表明，bvfA對(duì)TM4 細(xì)胞的活性無影響。

圖4 布魯氏菌對(duì)TM4細(xì)胞增殖活性影響的檢測(cè)Fig.4 Detection of the effects of B.abortus on T4 cell viability

2.5 各菌株對(duì)TM4 細(xì)胞損傷的測(cè)定結(jié)果利用LDH測(cè)定3 株菌對(duì)TM4 細(xì)胞的損傷，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：12 h 時(shí)，缺失株、親本株和回補(bǔ)株感染的TM4 細(xì)胞死亡率分別為13.39%、7.14%和6.53%，缺失株在12 h 時(shí)對(duì)TM4 細(xì)胞損傷大于親本株和回補(bǔ)株（P<0.001）；24 h 時(shí)缺失株、親本株和回補(bǔ)株感染的TM4 細(xì)胞死亡率分別為14.97%、12.40%和5.99%，缺失株在24 h 時(shí)對(duì)TM4細(xì)胞損傷大于親本株和回補(bǔ)株（P<0.001）； 12 h～24 h時(shí)，缺失株和親本株感染的TM4 細(xì)胞死亡率的差距在縮小，即從6.25%（13.39%～7.14%）減小到2.57%（14.97%～12.40%）。48 h 時(shí)，3 株布魯氏菌對(duì)TM4 細(xì)胞的損傷性均增大，其中缺失株和親本株對(duì)TM4 細(xì)胞的損傷無顯著差異（P>0.05）（圖5）。結(jié)果表明：bvfA基因在布魯氏菌感染的早期在和細(xì)胞共存機(jī)制中發(fā)揮重要作用。

圖5 各菌株感染后的TM4細(xì)胞死亡率Fig.5 Mortality of TM4 sertoli cells

2.6 各菌株對(duì)小鼠毒力的測(cè)定結(jié)果將S19 菌株和S19ΔbvfA菌株經(jīng)腹腔感染小鼠，結(jié)果顯示：缺失株感染小鼠4 周時(shí)脾指數(shù)分別為0.65%、1.78%、3.69%和3.36%；親本株感染小鼠4 周時(shí)脾指數(shù)分別為0.87%、2.88%、3.84%和3.34%。缺失株和親本株在感染小鼠1 周時(shí)的毒力均較弱；在2 周時(shí)，與對(duì)照組相比缺失株和親本株感染小鼠的脾指數(shù)增均極顯著增加（P<0.001），但缺失株感染小鼠的脾指數(shù)明顯低于親本株（P<0.01）。在3 周和4 周時(shí)，缺失株和親本株與對(duì)照組的脾指數(shù)差異顯著（P<0.01）， 但感染缺失株和親本株小鼠脾指數(shù)無顯著性差異（P>0.05）。另外，小鼠脾分離菌量在感染后1 周～4 周迅速增加，除3 周外，缺失株感染小鼠脾分離菌量均小于親本株感染組（P<0.05）（圖6）。上述結(jié)果表明：bvfA基因的缺失降低了布魯氏菌在脾組織中的增殖能力，進(jìn)而降低了布魯氏菌對(duì)小鼠的毒力。

圖6 布魯氏菌感染小鼠的脾指數(shù)（A）和脾分離菌量（B）的檢測(cè)Fig.6 Spleen index(A)and microbial isolated number(B)in mice infected with B.abortus

3 討 論

bvfA基因是布魯氏菌屬特有的一種毒力基因，其在布魯氏菌體內(nèi)外的生存發(fā)揮重要作用?，F(xiàn)有研究多見于對(duì)布魯氏菌bvfA基因的檢測(cè)，伊朗Fars 2005 年～2011 年間從流產(chǎn)胎兒中分離的42 株馬耳他布魯氏菌B. melitensis中有33 株含有bvfA基因（78.6%）[12]。另有報(bào)道，bvfA基因在臨床馬耳他布魯氏菌分離株中的檢出率分別是93%和92.9%[13-14]。在前期研究中對(duì)S19 菌株bvfA基因進(jìn)行核酸序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)，S19 菌株bvfA基因與豬布魯氏菌bvfA基因、馬耳他布魯氏菌bvfA基因、犬布魯氏菌bvfA基因序列同源性均為100%，將bvfA基因提交GenBank 獲得基因序列號(hào)MN651999[15]，并將bvfA基因進(jìn)行同源性BLAST 分析，結(jié)果顯示其他細(xì)菌未見相似性序列，驗(yàn)證了bvfA基因是布魯氏菌的特有基因。

前期實(shí)驗(yàn)構(gòu)建了布魯氏菌S19ΔbvfA株，本研究發(fā)現(xiàn)bvfA基因缺失株與親本株相比生長(zhǎng)較慢，表明bvfA基因缺失對(duì)布魯氏菌S19 的體外生長(zhǎng)有一定的影響。S19ΔbvfA菌株體外應(yīng)激試驗(yàn)結(jié)果顯示，該缺失株對(duì)高熱、高鹽、高滲、強(qiáng)酸和抗菌素的適應(yīng)能力減弱，但抗氧化性增強(qiáng)，表明bvfA基因參與調(diào)控布魯氏菌S19 株對(duì)環(huán)境的適應(yīng)性，對(duì)維持布魯氏菌S19 株抗氧化能力具有重要作用。有研究顯示布魯氏菌M28 株缺失tatA基因后對(duì)H2O2的敏感性增加[16]，但也有報(bào)道稱布魯氏菌S19 株中mglA基因的缺失可導(dǎo)致該菌對(duì)H2O2耐受性的增強(qiáng)[17]，表明不同布魯氏菌不同基因?qū)2O2的敏感性的不同，然而bvfA基因是否在增強(qiáng)布魯氏菌抗氧化方面與mglA基因具有相似機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

利用bvfA基因缺失株感染小鼠TM4 細(xì)胞3 h 和12 h 時(shí)，在細(xì)胞內(nèi)富集到的菌落數(shù)均少于親本株，而在24 h 和48 h 時(shí)二者無顯著差異。有研究在比較綿羊附睪布魯氏菌B. ovisPA 及其Δcgs、ΔvirB2和ΔvjbR突變株感染人滋養(yǎng)層細(xì)胞JEG-3 和綿羊睪丸上皮細(xì)胞OA3.Ts 時(shí)發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞中的ΔvirB2和ΔvjbR突變株數(shù)量在44 h 之內(nèi)一直在減少，而Δcgs突變株和親本株在20 h之內(nèi)數(shù)量不變，20 h后數(shù)量增加，直到44 h時(shí)數(shù)量增加了1 log[18]。說明不同的基因在維持布魯氏菌胞內(nèi)復(fù)制中發(fā)揮作用的時(shí)間不同，bvfA基因主要在布魯氏菌感染宿主后12 h 之內(nèi)影響該菌在TM4 細(xì)胞中的增殖能力。

乳酸脫氫酶的釋放是細(xì)胞壞死的典型特征[19-20]，是反映細(xì)胞損傷或死亡的重要指標(biāo)[21]。采用CCK-8法無法檢測(cè)到布魯氏菌對(duì)TM4 細(xì)胞活性的影響，因此，本研究利用檢測(cè)TM4 細(xì)胞中的LDH 含量來分析細(xì)胞的死亡率，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在12 h 時(shí)感染缺失株的TM4 細(xì)胞釋放更多的乳酸脫氫酶，標(biāo)志細(xì)胞壞死率大于感染其他布魯氏菌的TM4 細(xì)胞，據(jù)此計(jì)算TM4細(xì)胞死亡率顯示，在感染后12 h 時(shí)感染缺失株的TM4 細(xì)胞比感染親本株的TM4 細(xì)胞死亡率高6.25%，24 h 時(shí)感染缺失株的TM4 細(xì)胞比感染親本株的TM4細(xì)胞死亡率高2.57%，48 h 時(shí)感染缺失株的TM4 細(xì)胞和感染親本株的TM4 細(xì)胞死亡率已無顯著差異，可見感染缺失株的TM4 細(xì)胞和感染親本株的TM4 細(xì)胞死亡率的差距隨著感染時(shí)間的延長(zhǎng)而縮小。結(jié)合本研究侵入試驗(yàn)和殺傷試驗(yàn)結(jié)果推測(cè)bvfA基因可能僅在布魯氏菌感染宿主早期發(fā)揮作用，參與維持布魯氏菌與細(xì)胞共存的作用，以便布魯氏菌感染宿主早期時(shí)在宿主細(xì)胞中增殖。

本研究發(fā)現(xiàn)布魯氏菌S19ΔbvfA缺失株感染組小鼠在2 周時(shí)脾指數(shù)小于親本株感染組小鼠，3 周和4周時(shí)感染缺失株和親本株小鼠脾指數(shù)無顯著性差異，在1 周、2 周、4 周時(shí)缺失株感染組小鼠脾分離菌量均小于親本株組，說明bvfA基因?qū)Σ剪斒暇鶶19 毒力有一定的影響。然而在3 周時(shí)感染缺失株組小鼠和感染親本株小鼠脾分離菌量無顯著差異，其原因是3周時(shí)感染布魯氏菌的小鼠正處于從感染急性期向感染慢性期過渡，這一時(shí)期脾中僅分布少量布魯氏菌，不足以比較感染缺失株組小鼠和感染親本株小鼠脾分離菌量的差異[22]。

本研究證實(shí)了bvfA基因會(huì)影響布魯氏菌S19 株的體外生長(zhǎng)，參與調(diào)控其對(duì)環(huán)境的適應(yīng)性。bvfA基因?qū)S持布魯氏菌S19 株在睪丸支持細(xì)胞中的復(fù)制及增殖起一定的作用。布魯氏菌S19ΔbvfA株毒力的減弱提示其有望成為制備新缺失株疫苗的候選株，為布魯氏菌致病機(jī)制和bvfA基因的功能解析奠定理論一定的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。