王 冰,吳紅霞,李 淼,高 瑩,袁夢淇,仇華吉,孫 元
(中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所獸醫(yī)生物技術(shù)國家重點實驗室,黑龍江 哈爾濱 150069)
偽狂犬?。≒seudorabies,PR)是由PR 病毒(PRV)引起[1]。PRV 是皰疹病毒科α 皰疹病毒亞科的成員,病毒粒子直徑為150 nm~180 nm,由內(nèi)至外分別為病毒基因組(Genome)、衣殼(Capsid)、基質(zhì)(Tegu-ment)和囊膜(Envelope)[2]。PRV 的天然宿主是豬,但是也能夠感染其他哺乳動物[3],包括感染人[4]。PRV感染動物后能夠在外周神經(jīng)系統(tǒng)(Peripheral nervous system,PNS)神經(jīng)元的軸突末梢進(jìn)行吸附、內(nèi)化,并沿軸突逆向傳導(dǎo)至神經(jīng)胞體,從而完成病毒復(fù)制或潛伏感染[5]。研究發(fā)現(xiàn),PRV 感染小鼠后會激活其機(jī)體的天然免疫反應(yīng),同時誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生嚴(yán)重的神經(jīng)癥狀和神經(jīng)炎癥,但是其具體機(jī)制仍未知[6]。小鼠的背根神經(jīng)節(jié)(Dorsal root ganglia,DRG)位于脊柱內(nèi)脊髓兩側(cè),是初級傳入神經(jīng)元胞體所在的位置,屬于外周神經(jīng)元[7],并且PRV 能夠在小鼠DRG 內(nèi)復(fù)制并建立潛伏感染[5]。因此,研究感染PRV 后小鼠外周神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi),尤其DRG 內(nèi)基因表達(dá)水平變化,有助于深入研究PRV 的致病機(jī)制。
近年來,轉(zhuǎn)錄組測序(RNA-seq)技術(shù)已經(jīng)廣泛應(yīng)用于多種皰疹病毒與宿主的相互作用研究,如研究人員通過對山羊皰疹病毒1 型(Caprine herpesvirus 1,CpHV-1)感染的MDBK 細(xì)胞進(jìn)行RNA-seq,發(fā)現(xiàn)細(xì)胞內(nèi)多種與天然免疫反應(yīng)相關(guān)的基因轉(zhuǎn)錄水平發(fā)生了變化,如IFIT1、IFIT2和IFIT5[8];通過對愛潑斯坦-巴爾病毒(Epstein-Barr virus,EBV)感染后不同時間的原代B 淋巴細(xì)胞進(jìn)行RNA-seq,同樣發(fā)現(xiàn)了大量轉(zhuǎn)錄水平發(fā)生改變的基因,這為深入研究EBV的致瘤機(jī)制奠定了基礎(chǔ)[9]。為了探究PRV 感染小鼠的外周神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)基因轉(zhuǎn)錄水平的變化,本研究將PRV 接種小鼠后,在其瀕死期分離DRG,進(jìn)行RNAseq,并對差異轉(zhuǎn)錄基因進(jìn)行分析,為深入研究PRV的致病機(jī)制提供線索。
1.1 主要實驗材料PRV TJ 株由本實驗室分離、鑒定和保存;6 周齡的BALB/c 小鼠購自遼寧長生生物技術(shù)有限公司。DMEM 培養(yǎng)基購自Sigma 公司;TRIzol 試 劑 購 自Invitrogen 公 司;HiScript II Q RT Su-perMix for qPCR(+gDNA wiper)、2×ChamQ SYBR qP-CR Master Mix 均 購 自Vazyme 公 司。
1.2 小鼠感染實驗將6 只6 周齡健康BALB/c 小鼠隨機(jī)分為2 組(n=3),其中實驗組接種100 μL 107pfu/mL PRV,對照組接種100 μL DMEM,接種途徑均為左腿肌肉注射,每組各作3 個重復(fù)(TJ-1~TJ-3、Mock-1~Mock-3)。本實驗室前期研究結(jié)果顯示,小鼠在接種PRV TJ 株后56 h 進(jìn)入瀕死期,臨床癥狀也最嚴(yán)重,因此本研究選擇接種病毒56 h 后迫殺小鼠,參照文獻(xiàn)[10]方法分離DRG,-80 ℃保存于200 μL TRIzol 試劑中待用。
1.3 RNA-seq 及差異轉(zhuǎn)錄基因的功能分析各組小鼠DRG 樣品由華大基因公司使用BGISEQ 平臺進(jìn)行RNA-seq,獲得測序原始數(shù)據(jù),去除其中低質(zhì)量、接頭污染以及未知堿基含量過高的reads,獲得clean reads,利用HISAT 軟件將過濾后的基因序列與小鼠參考序列比對。采用華大基因多組學(xué)系統(tǒng)(https://biosys.bgi.com/#/report/project/projectList)進(jìn)行生物信息學(xué)和差異轉(zhuǎn)錄基因的功能分析。本研究利用DESeq2軟件比較對照組與感染組小鼠DRG 內(nèi)基因的轉(zhuǎn)錄水平,并利用clusterProfiler R 軟件進(jìn)行轉(zhuǎn)錄差異基因的基因本體論數(shù)據(jù)庫(Gene Ontology,GO)功能富集分析、京都基因與基因組百科全書(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,KEGG)通路富集分析。
1.4 差異轉(zhuǎn)錄基因的熒光定量PCR(RT-qPCR)驗證根據(jù)測序結(jié)果隨機(jī)選擇10 條轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)或下調(diào)的基因,利用TRIzol 試劑提取各組DRG 樣品總RNA,反轉(zhuǎn)錄為cDNA 后為模板,采用Premier 6.0 設(shè)計引物(表1),進(jìn)行qPCR 檢測,驗證各基因的轉(zhuǎn)錄情況。PCR 反應(yīng)程序為:95 ℃5 min;95 ℃10 s、60 ℃30 s、72 ℃1 min,共40 個循環(huán);95 ℃1 min,55 ℃30 s,95 ℃30 s,共1 個循環(huán)。以GAPDH 為內(nèi)參,采用2-ΔΔCt法計算各基因的相對轉(zhuǎn)錄水平。
表1 RT-qPCR所用的引物Table 1 Primers for RT-qPCR
2.1 PRV 感染小鼠后DRG 的轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析根據(jù)小鼠DRG 的RNA-seq 結(jié)果,對PRV 感染組小鼠和對照組小鼠DRG 內(nèi)mRNA 水平進(jìn)行聚類分析(圖1),計算PRV 感染組與對照組小鼠基因思轉(zhuǎn)錄水平的差異倍數(shù)(Fold change,F(xiàn)C),并繪制火山圖(圖2)。結(jié)果顯示,對照組(Mock-1、2、3)和感染組(TJ-1、2、3)被聚為兩大類(圖1),符合感染組和非感染組的差異轉(zhuǎn)錄基因水平預(yù)期,表明PRV-TJ 感染后可引起小鼠DRG 內(nèi)大量基因的差異轉(zhuǎn)錄。FC>2 且P≤0.05的差異轉(zhuǎn)錄基因共有6 502 條。其中,相對于對照組,PRV 感染組小鼠DRG 內(nèi)有3 703 條基因轉(zhuǎn)錄水平升高,2 799 條基因轉(zhuǎn)錄水平降低(圖2)。表明PRV 感染可導(dǎo)致小鼠DRG 的大量基因轉(zhuǎn)錄水平異常。
圖2 PRV感染小鼠DRG內(nèi)差異轉(zhuǎn)錄基因的火山圖分析Fig.2 Volcano plot of differentially transcribed genes in DRG from the PRV-infected mice
2.2 差異轉(zhuǎn)錄基因的功能分析為了探究PRV 感染小鼠后可能造成的影響,本研究將差異轉(zhuǎn)錄的基因進(jìn)行了GO 注釋。結(jié)果顯示,轉(zhuǎn)錄水平發(fā)生改變的基因廣泛存在于細(xì)胞各組分中,如細(xì)胞質(zhì)、胞外基質(zhì)和軸突等(圖3)。其中,細(xì)胞膜和細(xì)胞質(zhì)中差異轉(zhuǎn)錄的基因數(shù)量最多。進(jìn)一步對差異轉(zhuǎn)錄基因進(jìn)行KEGG 富集分析,結(jié)果顯示,差異轉(zhuǎn)錄的基因被富集到20 種KEGG 信號通路中(圖4),表明PRV 感染小鼠會對其DRG 內(nèi)多種生理過程產(chǎn)生影響。對上述結(jié)果匯總發(fā)現(xiàn)差異轉(zhuǎn)錄基因存在數(shù)量最多的5 條抗病毒信號通路分別為絲裂原活化蛋白激酶(Mitogenactivated protein kinase,MAPK)信號通路、核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域樣受體(Nucleotide-binding oligomer-zation domain-like receptor,NLR)信號通路、腫瘤壞死因子(Tumor necrosis factor,TNF)信號通路、細(xì)胞凋亡(Apoptosis)信號通路和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活因子(Signal transducers and activators of transcription,JAK -STAT)信號通路。
圖3 GO分析PRV感染小鼠DRG內(nèi)差異轉(zhuǎn)錄基因的定位Fig.3 GO analysis for the location of differentially transcribed genes in DRGs from the PRV-infected mice
圖4 PRV感染小鼠DRG內(nèi)差異轉(zhuǎn)錄基因參與的信號通路的KEGG分析Fig.4 KEGG analysis for signaling pathways participated by differentially transcribed genes in DRG from the PRV-infected mice
2.2.1 MAPK 信號通路 MAPK 信號通路是細(xì)胞內(nèi)重要的信號傳遞通路[11]。本研究對兩組小鼠DRG 參與MAPK 信號通路的分子進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組分析,結(jié)果顯示,實驗組小鼠DRG 內(nèi)在MAPK 信號通路中有124 個基因發(fā)生了差異轉(zhuǎn)錄,其中有53 個基因與天然免疫反應(yīng)有關(guān),其中轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)及下調(diào)倍數(shù)最大的各5個基因,見表2。該結(jié)果表明,PRV 感染小鼠后可能通過調(diào)控MAPK 信號通路而影響機(jī)體炎癥反應(yīng),且TNF、NTF5等基因的表達(dá)產(chǎn)物可能是影響該信號通路的關(guān)鍵接頭分子。
表2 PRV感染小鼠的MAPK信號通路中轉(zhuǎn)錄水平升高及降低的各5條基因Table 2 Five relatively highly and lowly-transcribed genes in the MAPK signaling pathway in the PRV-infected mice
2.2.2 NOD 樣受體信號通路 NOD 樣受體信號通路在機(jī)體內(nèi)受到廣泛調(diào)控[12]。本研究對兩組小鼠DRG內(nèi)涉及NOD 信號通路分子的編碼基因進(jìn)行分析,結(jié)果顯示,共有99 個基因差異轉(zhuǎn)錄,數(shù)量略低于MAPK 信號通路中差異轉(zhuǎn)錄的基因,其中轉(zhuǎn)錄上調(diào)及下調(diào)倍數(shù)最大的各5 個基因,見表3。該結(jié)果表明,PRV 感染小鼠后,可能通過NOD 樣受體信號通路影響其體內(nèi)各種信號調(diào)節(jié)因子的分泌,其中CXCL2、CCL5等可能是PRV 影響該信號通路的關(guān)鍵基因。
表3 PRV感染小鼠的NOD樣受體信號通路中轉(zhuǎn)錄水平升高及降低的5條基因Table 3 Five relatively highly and lowly transcribed genes in the NLR signaling pathway in the PRV-infected mice
2.2.3 腫瘤壞死因子(Tumor necrosis factor,TNF)信號通路 TNF 在炎癥發(fā)生、細(xì)胞增殖和細(xì)胞凋亡方面具有重要作用[13]。本研究對兩組小鼠DRG 內(nèi)TNF受體通路中的差異轉(zhuǎn)錄基因分析,結(jié)果列舉了轉(zhuǎn)錄上調(diào)及下調(diào)最顯著的各5 個基因,見表4。表明PRV可能通過上述基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物調(diào)控TNF 信號通路影響機(jī)體的炎癥發(fā)生、細(xì)胞增殖和細(xì)胞凋亡過程。
表4 PRV感染小鼠的TNF信號通路中轉(zhuǎn)錄水平升高及降低的5條基因Table 4 Five relatively highly and lowly transcribed genes in TNF signaling pathway in the PRV-infected mice
2.2.4 細(xì)胞凋亡信號通路 凋亡是一種細(xì)胞的程序性死亡,分為內(nèi)源性凋亡和外源性凋亡[14]。本研究結(jié)果顯示,PRV 感染小鼠DRG 內(nèi)該通路轉(zhuǎn)錄水平變化的基因共有73 個,其中轉(zhuǎn)錄上調(diào)或下調(diào)最顯著的各5 個基因,見表5。該結(jié)果表明,PRV 感染小鼠后可能通過影響上述基因的轉(zhuǎn)錄而影響其細(xì)胞凋亡信號通路的應(yīng)答。
表5 PRV感染小鼠的細(xì)胞凋亡信號通路中轉(zhuǎn)錄水平升高及降低的5條基因Table 5 Five relatively highly and lowly transcribed genes in the apoptosis signaling pathway in the PRV-infected mice
2.2.5 JAK-STAT 信號通路 JAK-STAT 信號通路與炎癥和自身免疫性疾病的產(chǎn)生有關(guān)[15]。本研究結(jié)果顯示,PRV 感染小鼠后,其DRG 內(nèi)JAK-STAT 通路內(nèi)存在66 個基因轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)或者下調(diào),上調(diào)或下調(diào)轉(zhuǎn)錄水平最顯著的各5 個基因,見表6。該結(jié)果表明,PRV 感染小鼠后,可能通過上述基因作為靶標(biāo)而影響JAK-STAT 信號通路,進(jìn)而影響其炎癥反應(yīng)。
表6 PRV感染小鼠的JAK-STAT信號通路中轉(zhuǎn)錄水平升高及降低的5條基因Table 6 Five relatively highly and lowly-transcribed genes in JAK-STAT signaling pathway in the PRV-infected mice
2.3 差異轉(zhuǎn)錄基因驗證根據(jù)RNA-seq 的結(jié)果,隨機(jī)選取10 條差異轉(zhuǎn)錄的基因進(jìn)行RT-qPCR 驗證分析。結(jié)果顯示,與對照組比較,在PRV 感染后的DRG 內(nèi)CXCL1、CXCL2、CXCL9、LY6A、IFIT1、IFI44、OAS1A、MS4A6D的mRNA 轉(zhuǎn)錄水平上調(diào),CRABP1、GKN3的mRNA 轉(zhuǎn)錄水平下調(diào),變化趨勢與轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析結(jié)果一致(圖5)。表明本研究RNA-seq 測序數(shù)據(jù)具有較高的準(zhǔn)確性和可信度。
圖5 差異轉(zhuǎn)錄基因的RT-qPCR驗證Fig.5 Verification of differentially transcribed genes by RT-qPCR
PRV 是一種特殊的嗜神經(jīng)性病毒[16-17],感染機(jī)體后能夠進(jìn)入外周神經(jīng)系統(tǒng)并建立潛伏感染[17-19]。但是機(jī)體感染PRV 后PNS 神經(jīng)元中基因的表達(dá)變化目前尚未可知。因此,本研究對感染PRV 小鼠的DRG進(jìn)行了RNA-seq,并對基因的轉(zhuǎn)錄水平進(jìn)行了分析。結(jié)果顯示,DRG 中發(fā)生轉(zhuǎn)錄上調(diào)或下調(diào)的基因共有6 502 條,其中轉(zhuǎn)錄上調(diào)的基因有3 703 條,轉(zhuǎn)錄下調(diào)的基因有2 799 條。這些差異轉(zhuǎn)錄基因廣泛存在于細(xì)胞膜、細(xì)胞質(zhì)及其他細(xì)胞組分中,并參與細(xì)胞內(nèi)的多種生物學(xué)過程。這說明PRV 感染宿主后,會對DRG 內(nèi)的各種生理過程產(chǎn)生廣泛影響。另外,差異轉(zhuǎn)錄的基因分布在20 種信號通路中,其中有12 條通路與天然免疫反應(yīng)有關(guān),這說明雖然PRV 的感染會對神經(jīng)系統(tǒng)造成廣泛的影響,但是主要引起天然免疫相關(guān)信號分子的變化。
天然免疫是機(jī)體抵抗外來病原侵入的第一道防線[20]。在病毒感染宿主后,機(jī)體內(nèi)的天然免疫相關(guān)通路會被激活,從而發(fā)揮抗病毒作用,以清除病原并減輕自身損傷[21]。小鼠感染PRV 后,其DRG 內(nèi)發(fā)生差異轉(zhuǎn)錄基因數(shù)量最多的前5 條天然免疫信號通路分別為MAPK 信號通路、NOD 樣受體信號通路、TNF 信號通路、細(xì)胞凋亡信號通路和JAK-STAT 信號通路。MAPK 信號通路廣泛參與細(xì)胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程,包括細(xì)胞發(fā)育、炎癥發(fā)生等;NOD 樣受體廣泛存在于細(xì)胞質(zhì)中,其在識別相應(yīng)配體后能夠激活NF-κB 信號通路并激活促炎性因子從而導(dǎo)致炎癥發(fā)生;TNF 信號通路能夠介導(dǎo)細(xì)胞凋亡;JAK-STAT 信號通路能夠參與細(xì)胞的增殖、分化、凋亡以及免疫調(diào)節(jié)等生物學(xué)過程。目前,已有較多關(guān)于PRV 與宿主天然免疫信號通路相互作用的研究,如PRV 感染細(xì)胞后,TNF-α 能夠通過活化p38 MAPK 和JNK/SAPK 信號通路而導(dǎo)致細(xì)胞發(fā)生自噬[22];另外,PRV還能通過蛋白酶體途徑降解JAK 從而抑制干擾素刺激基因的表達(dá)等[23]。本研究結(jié)果與上述研究結(jié)果一致,并且還發(fā)現(xiàn)仍有其他天然免疫通路中的基因發(fā)生差異轉(zhuǎn)錄,如NOD 樣受體信號通路??紤]到NOD樣受體在天然免疫過程中發(fā)揮的作用,該通路中的CXCL2、CCL5 和CXCL3 可能與PRV 引起的神經(jīng)炎癥有關(guān)。除此之外,本研究還新發(fā)現(xiàn)了某些轉(zhuǎn)錄水平發(fā)生差異的基因,如參與細(xì)胞凋亡信號通路的GZMB基因和參與MAPK 信號通路的NTF5基因,前者能夠調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)和修復(fù)細(xì)胞損傷[24],而后者是一種神經(jīng)保護(hù)分子[25];上述基因在PRV 感染過程中的作用還尚見報道。
在PRV 感染過程中,宿主先天性免疫應(yīng)答對于限制病毒復(fù)制和清除宿主體內(nèi)病毒十分重要。本研究采用RNA-Seq 得到PRV 感染小鼠后DRG 內(nèi)的詳細(xì)轉(zhuǎn)錄組學(xué)數(shù)據(jù),系統(tǒng)分析了PRV 感染機(jī)體后免疫相關(guān)基因參與的代謝途徑與信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑,為下一步研究機(jī)體抗PRV 反應(yīng)及機(jī)體神經(jīng)炎癥產(chǎn)生的機(jī)制提供了基礎(chǔ)。