柴胡皂苷A通過LKB1-AMPK通路干預(yù)高脂血癥大鼠的作用機(jī)制研究*

杜昊炎，張 敏，李閃閃，張明昊，春 花，吳宗耀

(1.商丘市中醫(yī)院，河南 商丘 476000；2.河南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，河南 鄭州 450000；3.河南中醫(yī)藥大學(xué)，河南 鄭州 450046；4.西藏藏醫(yī)藥大學(xué)，西藏 拉薩 850000)

高脂血癥是一種體內(nèi)脂肪代謝異常導(dǎo)致的疾病，其主要臨床特征是血液中總膽固醇(TC)、甘油三酯(TG)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)水平升高或高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)水平降低[1]。根據(jù)流行病學(xué)調(diào)查，美國約33.5%的成年人血清總膽固醇水平升高(≥2.40 g/L)[2]，亞洲大多數(shù)國家因血脂水平升高并發(fā)的慢性病導(dǎo)致死亡率也在逐年上升，在中國血脂異常發(fā)生人數(shù)高達(dá)1.6億[3]。目前越來越多的研究證實(shí)，高脂血癥是動脈粥樣硬化[4]、腦血栓[5]、冠心病[6]、心肌梗死[7]等心腦血管疾病的重要危險(xiǎn)因素，故調(diào)節(jié)血脂水平能有效降低多種慢性疾病的發(fā)生[8]。目前，世界上應(yīng)用最廣泛的降血脂藥物是他汀類藥物，其不僅能有效調(diào)節(jié)肝臟中膽固醇合成3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A還原酶(HMGCR)中的限速酶來降低膽固醇水平，還能促進(jìn)血脂代謝，但長期使用會造成肝腎功能、肌肉損害，并且還有誘發(fā)糖尿病的風(fēng)險(xiǎn)，停藥后還會出現(xiàn)血脂水平反跳等不良反應(yīng)[9]，嚴(yán)重影響疾病的治療，導(dǎo)致心腦血管疾病等多種并發(fā)癥的發(fā)生，給生命健康帶來危害。中藥治療高脂血癥療效顯著，無明顯不良反應(yīng)[10]。已經(jīng)證實(shí)小柴胡湯[11]、大柴胡湯[12]等含柴胡的中藥復(fù)方有較好的降血脂作用，但中藥復(fù)方成分復(fù)雜、分子機(jī)制不清嚴(yán)重阻礙了疾病的治療。柴胡皂苷A是柴胡的主要有效成分,能通過調(diào)節(jié)脂代謝來調(diào)節(jié)血脂水平，而肝激酶B1(LKB1)/單磷酸腺苷活化蛋白激酶(AMPK)通路已經(jīng)被多項(xiàng)研究[13]證實(shí)與脂肪代謝密切相關(guān)。AMPK是一種進(jìn)化保守的絲氨酸/蘇氨酸激酶，能維持細(xì)胞能量穩(wěn)態(tài)，參與細(xì)胞能量代謝，調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝。LKB1作為AMPK上游主要激酶，能磷酸化激活A(yù)MPK參與脂肪的能量代謝。因此，本研究對柴胡皂苷A的降血脂作用及機(jī)制展開研究，為臨床應(yīng)用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動 物

雄性SD大鼠60只，體質(zhì)量180～200 g，鼠齡8周，由鄭州市惠濟(jì)區(qū)華興實(shí)驗(yàn)動物養(yǎng)殖場提供，許可證號SCXK(豫)2019-0002，動物使用許可證號SYXK(豫)2020-0004。本研究經(jīng)河南中醫(yī)藥大學(xué)動物倫理委員會批準(zhǔn)，批準(zhǔn)號DWLL20180018。

1.2 藥品、試劑與儀器

柴胡皂苷A，上海源葉生物科技有限公司產(chǎn)品，批號S25577；辛伐他汀片，華潤雙鶴利民藥業(yè)(濟(jì)南)有限公司，產(chǎn)品批號1810409，10 mg/片。氨基甲酸乙酯，天津百倫斯生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品，批號20200326；TG測定試劑盒、T-C測定試劑盒、HDL-C測定試劑盒、LDL-C測定試劑盒，均為南京建成生物工程研究所產(chǎn)品，批號分別為A110-1-1、A111-1-1、A112-1-1、A113-1-1；兔SP試劑盒、DAB顯色試劑盒，北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品，批號分別為SP-9001、ZLI-9018；BCA蛋白定量檢測試劑盒、SDS-PAGE凝膠制備試劑盒，武漢賽維爾生物科技有限公司產(chǎn)品，批號分別為G2026、G2003；兔抗大鼠AMPK、磷酸化腺苷酸活化蛋白激酶(p-AMPK)、LKB1、HMGCR抗體，均為北京博奧森生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品，批號分別為bs-10344R、bs-12972R、bs-3948R、bs-5068R。BS110S型電子天平，北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司產(chǎn)品；MR-96TB酶標(biāo)儀，騁克儀器(上海)有限公司產(chǎn)品；RM2235石蠟切片機(jī)，德國徠卡公司產(chǎn)品；D3024R型臺式高速冷凍型微量離心機(jī)，大龍興創(chuàng)實(shí)驗(yàn)儀器(北京)有限公司產(chǎn)品；YD-6D型組織包埋機(jī)、YD-A型組織攤片機(jī)、YD-B型組織烤片機(jī)，均為金華市科迪儀器設(shè)備有限公司產(chǎn)品；CX23光學(xué)顯微鏡，日本奧林巴斯公司產(chǎn)品；CFX型熒光定量PCR儀，美國伯樂公司產(chǎn)品；Nano Drop 2000型超微量分光光度計(jì)，賽默飛世爾科技公司產(chǎn)品。

1.3 動物分組、模型的建立與給藥

將60只雄性SD大鼠按體質(zhì)量隨機(jī)分為正常組、模型組、辛伐他汀組和柴胡皂苷低、中、高劑量組，每組10只。適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，除正常組外，其他各組飼喂高脂飼料(白糖占10%、豬油占10%、蛋黃粉占10%、膽固醇占2%、基礎(chǔ)飼料占68%)，正常組大鼠常規(guī)飼養(yǎng)，連續(xù)喂養(yǎng)4周。造模同時(shí)，辛伐他汀組大鼠按9 μg/g給藥，柴胡皂苷低、中、高劑量組分別按5、10、20 μg/g給藥，灌胃體積均為10 μL/g；正常組和模型組給予等體積生理鹽水。各組均1次/d，連續(xù)4周。

1.4 檢測指標(biāo)

末次給藥后，各組大鼠禁食不禁水12 h，以氨基甲酸乙酯1 g/kg體質(zhì)量腹腔注射麻醉，腹主動脈取血，解剖取肝臟。

1.4.1 TC、TG、HDL-C、LDL-C

4 ℃下，離心半徑10 cm，3 000 r/min轉(zhuǎn)速離心10 min，分離大鼠血清，按照試劑盒操作步驟檢測血清中TC、TG、HDL-C、LDL-C水平。

1.4.2 肝組織病理學(xué)形態(tài)

取大鼠同位置肝組織，以質(zhì)量分?jǐn)?shù)40 g/L多聚甲醛溶液固定，石蠟包埋，切片，蘇木素-伊紅(HE)染色，顯微鏡下觀察肝組織病理學(xué)形態(tài)。

1.4.3 肝組織中AMPK、p-AMPK、LKB1、HMGCR蛋白水平

采用免疫組織化學(xué)法檢測肝組織中AMPK、p-AMPK、LKB1、HMGCR蛋白表達(dá)部位及表達(dá)情況。肝組織病理切片經(jīng)脫蠟、水化后，H2O2封閉，PBS清洗，檸檬酸鹽緩沖液熱修復(fù)，山羊血清封閉，室溫孵育，分別滴加AMPK、p-AMPK、LKB1、HMGCR抗體，4 ℃孵育過夜，二抗37 ℃孵育20 min，DAB顯色，自來水沖洗，蘇木素復(fù)染3 min，鹽酸乙醇分化，自來水沖洗，脫水，透明，封片，鏡檢，采用Image-Pro Plus 6.0測定每個(gè)視野中積分光密度(IOD)值，并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。采用蛋白質(zhì)印跡法(Western blotting)檢測肝組織中AMPK、p-AMPK、LKB1、HMGCR蛋白表達(dá)水平。取肝組織，稱定質(zhì)量，加入含有質(zhì)量分?jǐn)?shù)10 g/L苯甲基磺酰氟(PMSF)的RIPA裂解液，勻漿后，4 ℃，離心半徑10 cm，3 000 r/min離心15 min，上清液采用BCA蛋白定量法測定蛋白濃度。加上樣緩沖液和RIPA制備樣品，上樣量100 μg蛋白，經(jīng)SDS-PAGE電泳后，轉(zhuǎn)移至PVDF膜，50 g/L脫脂奶粉封閉2 h，加入一抗[AMPK(1∶1 000)、p-AMPK(1∶1 000)、LKB1(1∶1 000)、HMGCR(1∶1 000)兔抗單克隆抗體、β-actin兔抗單克隆抗體(1∶3 000)]過夜、洗滌；加入二抗[辣根過氧化物酶標(biāo)記山羊抗兔IgG抗體(1∶10 000)]，室溫孵育1 h，ECL顯影并掃描。運(yùn)用Image J軟件測定蛋白條帶灰度值，通過計(jì)算目的條帶與內(nèi)參的灰度值比值來分析AMPK、p-AMPK、LKB1及HMGCR相對表達(dá)水平。

1.4.4 肝組織中AMPK、LKB1、HMGCR mRNA水平

采用實(shí)時(shí)聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)檢測。根據(jù)GenBank數(shù)據(jù)庫(登錄號NM023991、NM001108069.1、NM013134.2、NM017008.4)的AMPK、LKB1、HMGCR基因序列設(shè)計(jì)特異性引物，引物序列見表1。制備肝臟勻漿，用TriQuick試劑充分研磨勻漿后提取總RNA，檢測RNA濃度及純度。在20 μL反應(yīng)體系內(nèi)合成cDNA，以2 μL cDNA為模板，加入靶基因上下游引物于15 μL反應(yīng)體系內(nèi)進(jìn)行PCR擴(kuò)增。

表1 Real-time PCR引物序列

反應(yīng)結(jié)束后，根據(jù)擴(kuò)增曲線及溶解曲線判斷PCR反應(yīng)特異性。所得結(jié)果以GAPDH為內(nèi)參，用2-△△CT法計(jì)算目的基因相對水平。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠血清TG、TC、HDL-C、LDL-C水平對比

與正常組對比，模型組大鼠血清中TG、TC、LDL-C水平升高，HDL-C水平降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與模型組對比，4個(gè)給藥組TG、TC、LDL-C水平降低，HDL-C水平升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與辛伐他汀組對比，柴胡皂苷3個(gè)劑量組TG、TC水平升高(P<0.05)，低、中劑量組LDL-C水平升高(P<0.05)，HDL-C水平降低(P<0.05)。與柴胡皂苷低劑量組對比，中、高劑量組TG、TC、LDL-C水平降低(P<0.05)，HDL-C水平升高(P<0.05)。見表2。

表2 各組大鼠血清TG、TC、HDL-C、LDL-C水平對比

2.2 各組大鼠肝臟組織病理學(xué)形態(tài)對比

正常組大鼠肝細(xì)胞形狀規(guī)則，呈索狀分布，細(xì)胞邊界清晰，未見脂肪滴；模型組大鼠肝細(xì)胞形態(tài)不規(guī)則，邊界模糊，細(xì)胞腫脹且大小不一致，胞漿內(nèi)可見大量脂肪滴(箭頭所示)；辛伐他汀組和柴胡皂苷低、中、高劑量組大鼠肝細(xì)胞漿存在少量脂肪滴，肝組織病理學(xué)形態(tài)明顯改善。見圖1。

2.3 各組大鼠肝臟組織中AMPK、p-AMPK、LKB1、HMGCR蛋白水平對比

與正常組對比，模型組大鼠肝臟中有少量AMPK、p-AMPK、LKB1沉積，IOD值顯著減小(P<0.05)；有大量HMGCR沉積，IOD值顯著增加(P<0.05)。與模型組對比，4個(gè)給藥組大鼠肝臟中有大量AMPK、p-AMPK、LKB1沉積，IOD值顯著增加(P<0.05)；有少量HMGCR沉積，IOD值顯著減小(P<0.05)。與辛伐他汀組對比，柴胡皂苷低、中劑量組大鼠肝臟中少量AMPK沉積、IOD值顯著減小(P<0.05)，而柴胡皂苷高劑量組有大量AMPK沉積，IOD值顯著增加(P<0.05)；柴胡皂苷低、中、高劑量組有少量p-AMPK沉積、IOD值顯著減小(P<0.05)，有大量HMGCR沉積、IOD值顯著增加(P<0.05)；柴胡皂苷低劑量組有少量LKB1沉積、IOD值顯著減小(P<0.05)，柴胡皂苷中、高劑量組有大量LKB1沉積、IOD值顯著增加(P<0.05)。見圖2、表3。

表3 各組大鼠肝臟組織中AMPK、p-AMPK、LKB1、HMGCR蛋白的IOD值對比

Western blotting結(jié)果顯示：與正常組對比，模型組大鼠肝組織AMPK、p-AMPK、LKB1水平降低，灰度值減小，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與模型組對比，4個(gè)給藥組大鼠肝組織AMPK、p-AMPK、LKB1水平升高，灰度值增加(P<0.05)；HMGCR水平降低，灰度值減小(P<0.05)。與辛伐他汀組對比，柴胡皂苷3個(gè)劑量組大鼠肝組織AMPK水平顯著降低，灰度值顯著減小(P<0.05)；柴胡皂苷高劑量組大鼠肝組織LKB1水平顯著降低，灰度值顯著減小(P<0.05)；柴胡皂苷低、中、高劑量組大鼠肝組織HMGCR水平顯著升高，灰度值顯著增加(P<0.05)。與柴胡皂苷低劑量組對比，柴胡皂苷中、高劑量組AMPK水平顯著升高，灰度值顯著增加(P<0.05)；柴胡皂苷高劑量組大鼠肝組織LKB1水平顯著降低，灰度值顯著減小(P<0.05)；柴胡皂苷中劑量組大鼠肝組織HMGCR水平顯著升高，灰度值顯著增加(P<0.05)；柴胡皂苷高劑量組大鼠肝組織HMGCR水平顯著降低，灰度值顯著減小(P<0.05)。見圖3、表4。

表4 各組大鼠肝臟組織中AMPK、p-AMPK、LKB1、HMGCR蛋白的灰度值測定結(jié)果

2.4 各組大鼠肝臟組織中AMPK、LKB1、HMGCR mRNA水平對比

與正常組對比，模型組大鼠肝組織AMPK、LKB1 mRNA水平降低，HMGCR mRNA水平升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與模型組對比，4個(gè)給藥組大鼠肝組織AMPK、LKB1 mRNA水平升高，HMGCR mRNA水平降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與辛伐他汀組對比，柴胡皂苷3個(gè)劑量組大鼠肝組織AMPK、LKB1 mRNA降低(P<0.05)，柴胡皂苷低、中劑量組大鼠肝組織HMGCR mRNA水平升高(P<0.05)。與柴胡皂苷低劑量組對比，柴胡皂苷中、高劑量組大鼠肝組織AMPK、LKB1 mRNA水平顯著升高(P<0.05)，HMGCR mRNA水平顯著降低(P<0.05)。見表5。

表5 各組大鼠肝臟組織中AMPK、LKB1、HMGCR mRNA水平對比

3 討 論

高脂血癥是由于脂肪代謝或功能異常導(dǎo)致血液中脂質(zhì)或脂蛋白水平異常升高的一種疾病，常因飲食失調(diào)、肥胖、家族性高膽固醇血癥等遺傳疾病或糖尿病等其他疾病引起[14]。高脂血癥以TC、TG、LDL-C升高和HDL-C降低為主要特征，其中TC是急性缺血性卒中患者卒中嚴(yán)重程度和預(yù)后不良的重要獨(dú)立預(yù)測因子。研究發(fā)現(xiàn)，中風(fēng)患者的性別和血清TC、LDL-C和HDL-C水平之間存在顯著關(guān)聯(lián)，尤其是TC指標(biāo)的變化與中風(fēng)的嚴(yán)重程度密切相關(guān)[15-16]。目前研究還關(guān)注LDL-C與心血管疾病發(fā)生的關(guān)系，LDL-C包括乳糜微粒、低密度脂蛋白、極低密度脂蛋白及其殘余物等富含甘油三酯的脂蛋白。降低LDL-C可進(jìn)一步減少心肌梗死、腦血管事件的發(fā)生，故本研究采用SD大鼠進(jìn)行模型制備高脂血癥模型大鼠。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與模型對照組對比，柴胡皂苷A低、中、高劑量組大鼠血清中TC、TG、LDL-C水平均顯著降低，HDL-C水平顯著升高?？梢姡窈碥誂可較好地降低血脂指標(biāo)。

高脂血癥的發(fā)生與脂代謝紊亂密切相關(guān)，而LKB1/AMPK信號通路已經(jīng)被證實(shí)與脂代謝相關(guān)。AMPK是一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶[17]，也是一種細(xì)胞能量傳感器，能參與機(jī)體的能量代謝調(diào)節(jié)過程，并在包括脂質(zhì)代謝在內(nèi)的多種代謝異常疾病中發(fā)揮著重要作用[18]。AMPK能通過上游LKB1在AMPKα亞基的Thr172處磷酸化而被激活[19]。在膽固醇的生物過程中，肝臟作為其主要器官，而HMGCR作為催化3-羥基3-甲基戊二酰輔酶A轉(zhuǎn)化為甲羥戊酸的限速酶，其活性降低可以減少膽固醇的合成[20]?？梢姡せ預(yù)MPK蛋白可減少脂肪生成、增加脂肪酸氧化，以調(diào)節(jié)肝臟脂質(zhì)代謝。鑒于此，本研究采用免疫組化和蛋白質(zhì)印跡法，觀察柴胡皂苷A對LKB1/AMPK通路相關(guān)蛋白的表達(dá)變化。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與正常組對比，模型組大鼠肝組織AMPK、p-AMPK、LKB1蛋白水平顯著降低，說明高脂血癥大鼠與LKB1/AMPK信號通路相關(guān)；與模型組對比，柴胡皂苷A各劑量組大鼠肝組織AMPK、p-AMPK、LKB1水平顯著升高，HMGCR水平顯著降低；柴胡皂苷A各劑量組對比，柴胡皂苷A高劑量組大鼠肝組織LKB1水平升高最明顯，HMGCR水平降低最顯著。最后，為了驗(yàn)證結(jié)果的一致性，還對AMPK、LKB1、HMGCR mRNA進(jìn)行檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)mRNA與蛋白的表達(dá)趨勢一致，進(jìn)一步驗(yàn)證柴胡皂苷A能通過LKB1/AMPK通路降低高脂血癥大鼠的血脂的分子機(jī)制。

此外，本研究還在形態(tài)學(xué)上觀察柴胡皂苷A的治療效果，采用HE染色的方法觀察各組高脂血癥大鼠肝臟的病理變化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，正常組大鼠肝細(xì)胞形狀規(guī)則，呈索狀分布，細(xì)胞邊界清晰，未見脂肪滴；而模型組大鼠肝細(xì)胞形態(tài)不規(guī)則，邊界模糊，細(xì)胞腫脹且大小不一致，胞漿內(nèi)可見大量脂肪滴；柴胡皂苷A各劑量組大鼠肝細(xì)胞漿雖存在少量脂肪滴，但有顯著改善。

綜上所述，柴胡皂苷A能改善高脂血癥大鼠的血脂水平，其作用機(jī)制是通過降低HMGCR蛋白和促進(jìn)LKB1/AMPK信號通路表達(dá)，而達(dá)到降血脂的作用。