穿心蓮內(nèi)酯對人肝癌HepG2細(xì)胞增殖、凋亡和遷移的影響*

徐 輝，焦響樂，鄭玉寬，楊 靜，郭 慧，李曉天

(1.鄭州大學(xué)第五附屬醫(yī)院，河南 鄭州 450052；2.鄭州大學(xué)藥學(xué)院，河南 鄭州 450066)

穿心蓮內(nèi)酯屬于二萜內(nèi)酯類化合物，是穿心蓮的主要效用成分之一，味苦性寒，主要功效是清熱解毒消腫。一般將穿心蓮干燥的地上部分作為藥用，并在采摘后曬干[1]?，F(xiàn)有研究表明,已從穿心蓮中分離出的有效化合物主要是二萜內(nèi)酯類和黃酮類，其中的代表物質(zhì)就是穿心蓮內(nèi)酯[2]。臨床已將其用于炎癥和病毒性疾病的治療，常與抗生素聯(lián)用[3-4]。近幾年,還發(fā)現(xiàn)了其更多的功效，如解熱、抗心腦血管疾病、免疫調(diào)節(jié)作用、保肝、降血糖、保護(hù)神經(jīng)等[5-9]，但是關(guān)于其抗肝癌的作用研究較少。中醫(yī)治療肝癌的藥物有丹參、藏紅花，藥物成分有姜黃素、大果山楂總黃酮、銀杏葉提取物、苦參素、甘草甜素、茶多酚，復(fù)方制劑有柴胡湯、棗杞湯、解毒膠囊等。這些藥物通過抑制腫瘤增殖及轉(zhuǎn)移、調(diào)控肝細(xì)胞自噬、防止肝細(xì)胞變性壞死、減少膠原纖維產(chǎn)生、增強膠原酶的活性、改善肝臟微循環(huán)等途徑對肝癌進(jìn)行防治[10-14]。也有學(xué)者認(rèn)為肝癌發(fā)病與氣滯、血瘀、濕熱等病理因素瘀滯肝絡(luò)所形成的癌毒有關(guān)。現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，清熱解毒中藥治療肝癌能改善患者臨床癥狀及體征,其機(jī)制與抑制腫瘤增殖及轉(zhuǎn)移、聯(lián)合化療藥物增強療效、減輕化療藥物不良反應(yīng)等有關(guān)[15-17]。本文研究穿心蓮內(nèi)酯對人肝癌HepG2細(xì)胞增殖、凋亡和遷移的影響，以期為穿心蓮內(nèi)酯應(yīng)用于肝癌治療提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞株

人肝癌細(xì)胞HepG2購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫。

1.2 藥品、試劑與儀器

穿心蓮內(nèi)酯，大連美侖生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品，批號D1225A。DMEM培養(yǎng)基，北京索萊寶科技有限公司產(chǎn)品，批號12100-500；胎牛血清，北京賽默飛世爾生物化學(xué)制品有限公司產(chǎn)品，批號SV30087.01；無血清細(xì)胞凍存液，蘇州新賽美生物科技有限公司產(chǎn)品，批號C40010；胰蛋白酶消化液，上海碧云天生物科技有限公司產(chǎn)品，批號C020；Annexin V-FITC/PI雙染細(xì)胞凋亡檢測試劑盒，江蘇凱基生物技術(shù)股份有限公司產(chǎn)品，批號KGA107。Cell Counting Kit-8(CCK-8)，美國安諾倫生物公司產(chǎn)品，批號K1018；結(jié)晶紫染色溶液，北京雷根生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品，批號1109A20；多聚甲醛溶液，北京蘭杰柯科技有限公司產(chǎn)品，批號70071800。微量移液槍，德國艾本德公司產(chǎn)品；MiLLiPORE超純水機(jī)，上海樂楓生物科技有限公司產(chǎn)品；Spectra Mr型全波長酶標(biāo)儀，美國丹耐克斯公司產(chǎn)品；TS2-S-SM型光學(xué)電子顯微鏡，日本尼康公司產(chǎn)品；HH-4恒溫水浴鍋，江蘇金壇市環(huán)宇科學(xué)儀器廠產(chǎn)品;88600V63型-80 ℃冰箱;318564-4236型細(xì)胞CO2培養(yǎng)箱，美國賽默飛世爾科技公司產(chǎn)品。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng)與處理

HepG2細(xì)胞株采用含有100 mL/L胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，培養(yǎng)于37℃、50 mL/L CO2恒溫培養(yǎng)箱中。當(dāng)細(xì)胞融合達(dá)到75%～85%，用胰蛋白酶消化傳代，取對數(shù)生長期細(xì)胞用于后續(xù)實驗。

1.4 檢測指標(biāo)

1.4.1 HepG2肝癌細(xì)胞增殖活性

采用CCK-8法檢測穿心蓮內(nèi)酯對HepG2肝癌細(xì)胞增殖活性的抑制作用。實驗原理：電子載體1-Methoxy PMS存在時，CCK-8中的WST-8被還原為橙黃色甲瓚產(chǎn)物，440 nm波長處用酶標(biāo)儀測定吸光度(OD)值，活細(xì)胞的數(shù)量與OD值成正線性關(guān)系。在96孔板的實驗孔中滴加100 μL(約5×103個)細(xì)胞懸液，置于CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。實驗孔加入不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)(0、5、10、20、30、40、50、60 mg/L)的穿心蓮內(nèi)酯溶液，每個質(zhì)量分?jǐn)?shù)設(shè)置3個復(fù)孔，放置于培養(yǎng)箱中孵育24、48、72 h，每孔加入CCK-8溶液10 μL，在培養(yǎng)箱中孵育1～4 h，取出在440 nm用酶標(biāo)儀測量吸光度。細(xì)胞抑制率(%)=[(Ac-As)/(Ac-Ab)]×100

其中As為實驗組吸光度，Ab為空白組(含有CCK-8和培養(yǎng)基)吸光度，Ac為對照組(含有細(xì)胞、培養(yǎng)基和CCK-8)吸光度。

1.4.2 HepG2肝癌細(xì)胞凋亡

采用Annexin V-碘化丙啶(PI)雙染法。被FITC標(biāo)記的Annexin V可與凋亡細(xì)胞結(jié)合，用于區(qū)分正常細(xì)胞與凋亡細(xì)胞；PI是能區(qū)分死細(xì)胞和凋亡晚期細(xì)胞的核酸染料。故Annexin V-FITC和PI聯(lián)用可將凋亡早期與凋亡晚期細(xì)胞區(qū)分。收集HepG2細(xì)胞并接種于6孔板中，24 h后棄去培養(yǎng)基，換用不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)(0、5、10、25 mg/L)含藥穿心蓮內(nèi)酯培養(yǎng)基,繼續(xù)培養(yǎng)24 h。然后,胰酶消化細(xì)胞并加入完全培養(yǎng)基，混勻后轉(zhuǎn)移至離心管中；以105 mm為離心半徑，以1 000 r/min轉(zhuǎn)速離心5 min；吸除離心管內(nèi)的上清；用1 mL 4 ℃預(yù)冷的PBS溶液輕輕地重懸細(xì)胞，并計數(shù)；按以上條件再次離心并吸除上清，重懸細(xì)胞，離心，吸除管內(nèi)上清。用 250 μL 稀釋過的結(jié)合緩沖液重新懸浮細(xì)胞，調(diào)節(jié)其濃度為 1×106/mL；取5 mL流式細(xì)胞管，將細(xì)胞懸液100 μL和Annexin V-FITC溶液5 μL加入其中，混合均勻；置室溫(20～25 ℃)避光孵育 10 min；向流式管中加入10 μL PI溶液，并輕輕混勻；重懸細(xì)胞,在避光環(huán)境中保存，用流式細(xì)胞儀立即檢測細(xì)胞凋亡率。顯示為綠色熒光的是Annexin V-FITC，顯示為紅色熒光的是PI。

1.4.3 HepG2肝癌細(xì)胞遷移能力

采用Transwell細(xì)胞遷移實驗。先將小室活化,向24孔板中加入200 μL的含100 mL/L血清的DMEM培養(yǎng)基；再將Transwell皿放入24孔板中,浸透小室的底部；并將24孔板置于37 ℃環(huán)境中孵育1 h；分別取200 μL 質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0、4、8、10 mg/L的細(xì)胞懸液鋪于上室,置于適宜環(huán)境的培養(yǎng)箱中,孵育48 h；取400 μL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為40 g/L的多聚甲醛固定細(xì)胞30 min，用PBS溶液清洗3遍；取1個24孔板，滴加400 μL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1g/L的結(jié)晶紫染色液，染色10 min；將上室中的細(xì)胞用潔凈的棉簽擦凈，于電子顯微鏡下拍照。

1.5 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié) 果

2.1 穿心蓮內(nèi)酯對HepG2肝癌細(xì)胞增殖活性的影響

隨著穿心蓮內(nèi)酯質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增加及作用時間的延長，HepG2肝癌細(xì)胞活性逐漸下降。與0 mg/L穿心蓮內(nèi)酯對比，各穿心蓮內(nèi)酯組的吸光度降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)果表明，穿心蓮內(nèi)酯能抑制HepG2肝癌細(xì)胞的增殖活性，且具有時間和濃度依賴性。見表1。

表1 兩組不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)的穿心蓮內(nèi)酯對HepG2肝癌細(xì)胞增殖活性的影響

2.2 穿心蓮內(nèi)酯對HepG2肝癌細(xì)胞凋亡的影響

在穿心蓮內(nèi)酯質(zhì)量分?jǐn)?shù)0～25 mg/L范圍內(nèi)，隨著質(zhì)量分?jǐn)?shù)增加，HepG2肝癌細(xì)胞凋亡率(Q2+Q3)不斷增加。在穿心蓮內(nèi)酯質(zhì)量分?jǐn)?shù)為 25 mg/L時，凋亡率達(dá)到(12.70±1.78)%。見圖1。結(jié)果表明，穿心蓮內(nèi)酯可以促進(jìn)HepG2肝癌細(xì)胞的凋亡。

2.3 穿心蓮內(nèi)酯對HepG2肝癌細(xì)胞遷移的影響

經(jīng)過穿心蓮內(nèi)酯作用48 h，0 mg/L穿心蓮內(nèi)酯組的HepG2肝癌細(xì)胞穿過半透膜進(jìn)入下室的細(xì)胞數(shù)量明顯多于其他各給藥組。與低劑量組對比，高劑量組HepG2肝癌細(xì)胞穿過半透膜進(jìn)入下室的數(shù)量明顯減少。結(jié)果表明，隨著穿心蓮內(nèi)酯質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增高，穿心蓮內(nèi)酯抑制HepG2肝癌細(xì)胞遷移的能力增強。見圖2。

3 討 論

肝癌分為原發(fā)性肝癌和轉(zhuǎn)移性肝癌，較為常見的是原發(fā)性肝癌。因肝臟富含血管等原因，肝癌的惡性化程度極高。手術(shù)治療、放射治療、化學(xué)藥物治療、肝臟切除或肝臟移植治療是治療肝癌的主要方式。肝癌的早期確診比較困難，晚期時的手術(shù)治療僅對符合身體條件的少數(shù)人適用；放射治療易對正常肝細(xì)胞造成較大損傷從而影響其正常功能[18]；而化學(xué)藥物治療常伴隨耐藥性等相關(guān)問題。目前，已明確的水源污染、食物中的毒素、吸煙酗酒，甚至肥胖和糖尿病等均為誘發(fā)肝癌的重要因素[19]。從細(xì)胞增殖、細(xì)胞凋亡、細(xì)胞侵襲遷移或分子水平探討肝癌的發(fā)生機(jī)制是當(dāng)今肝癌研究的熱點、重點和難點。

穿心蓮內(nèi)酯及其衍生物對腫瘤具有一定治療作用，其機(jī)制可能是使淋巴細(xì)胞抗癌活性提高，對腫瘤細(xì)胞增殖進(jìn)行抑制，誘導(dǎo)了腫瘤細(xì)胞凋亡等，可用于各種腫瘤的治療。李曙光等[20]的研究表明，穿心蓮內(nèi)酯對BGC-823細(xì)胞的增殖具有明顯的抑制作用，可以使細(xì)胞分裂停滯在G0/G1期，并能促進(jìn)該細(xì)胞的凋亡過程，具有極強的抗癌作用。許洪彬等[21]為了探究穿心蓮內(nèi)酯潛在的作用機(jī)制，利用反向分子對接技術(shù)和網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析方法，創(chuàng)建穿心蓮內(nèi)酯抗腫瘤作用的靶標(biāo)-通路網(wǎng)絡(luò)，經(jīng)PharmMapper預(yù)測和篩選、KEGG富集析等分析得知，穿心蓮內(nèi)酯主要作用于肝細(xì)胞癌、前列腺癌、非小細(xì)胞癌等癌癥，其通路主要有PIK3R1、SRC、BRAF、EGFR、MMP2、CASP3等靶蛋白，尤其對肝細(xì)胞癌專一性高、作用最強。有學(xué)者[22]也證明了穿心蓮內(nèi)酯有促進(jìn)細(xì)胞凋亡的作用，可用于治療肝癌。

人HepG2肝癌細(xì)胞是研究體外外源性物質(zhì)代謝和肝臟惡性腫瘤的良好模型，因為HepG2肝癌細(xì)胞所含的生物轉(zhuǎn)化酶與人正常肝實質(zhì)細(xì)胞具有同源性，分化程度較高，并且保留了較完整且活性穩(wěn)定的生物轉(zhuǎn)化代謝酶[23]。

細(xì)胞增殖與凋亡過程的紊亂與腫瘤的發(fā)生發(fā)展有一定關(guān)系。凋亡最開始的表現(xiàn)是細(xì)胞皺縮，又稱凋亡性細(xì)胞容積減少，是細(xì)胞凋亡過程中的重要環(huán)節(jié)[19，24]。在生物機(jī)體細(xì)胞的生長和繁殖過程中，細(xì)胞凋亡具有十分重要的作用，體現(xiàn)了組織修復(fù)的重要功能。細(xì)胞凋亡是細(xì)胞自主性程序死亡，是細(xì)胞的主要死亡方式之一，其受多基因嚴(yán)格調(diào)控。誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞凋亡在肝癌治療中十分重要[25]。誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡不會對機(jī)體正常細(xì)胞造成損害，也不會導(dǎo)致炎癥的發(fā)生，是一種不同于細(xì)胞壞死的良性自殺行為[26]。因此，通過細(xì)胞凋亡的途徑來判斷藥物對肝癌細(xì)胞凋亡的影響是篩選抗肝癌藥物的一個重要方法。此外，肝癌的難以治愈不僅表現(xiàn)在癌細(xì)胞的無限制生長，容易躲避免疫細(xì)胞的殺傷；也表現(xiàn)在可能轉(zhuǎn)移到身體其他部位定位生長而生成轉(zhuǎn)移瘤；因此，在抑制腫瘤生長、促使癌細(xì)胞凋亡的同時，限制癌細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移顯得格外的重要。

本課題以人HepG2肝癌細(xì)胞株為主要研究對象，初步研究了穿心蓮內(nèi)酯對其增殖、凋亡和遷移的影響。研究結(jié)果表明，穿心蓮內(nèi)酯能抑制HepG2肝癌細(xì)胞的增殖活性，且對藥物質(zhì)量分?jǐn)?shù)和作用時間有依賴性；對HepG2肝癌細(xì)胞的凋亡有促進(jìn)作用；能抑制HepG2肝癌細(xì)胞的遷移。此為穿心蓮內(nèi)酯治療肝癌的機(jī)制研究提供了新思路、新方法，同時也為后續(xù)的作用機(jī)制研究提供更可靠的依據(jù)。