基于選擇信號分析揭示豬終端父本群體間性狀趨同的關(guān)鍵基因

李望嬌，彭 夏，宋 徽，董文君，李新云，趙書紅，馬云龍

(華中農(nóng)業(yè)大學，農(nóng)業(yè)動物遺傳育種與繁殖教育部重點實驗室,武漢 430070)

中國地方豬種質(zhì)資源十分豐富，約占世界總數(shù)的30%，且具有抗逆性強、耐粗飼和性成熟早等特點，然而多數(shù)品種存在脂肪含量高、飼料利用率低等缺點[1]。隨著中國居民消費習慣的變化，瘦肉型豬的市場需求日益增長，在20世紀70年代至20世紀80年代，中國逐漸開始引入皮特蘭豬和杜洛克豬等瘦肉型豬種在生豬繁育體系中作為終端父本使用[2-3]。在生豬生產(chǎn)中，皮特蘭豬與杜洛克豬作為終端父本，其生長速度和飼料利用率長期受到高強度人工選擇作用，且選育方向相似。人工選擇作用在基因組上留下的特征痕跡稱之為選擇信號(selection signature)[4]，針對商業(yè)豬種進行選擇信號檢測，可以篩選出與豬重要經(jīng)濟性狀相關(guān)的分子標記和候選基因，為豬重要經(jīng)濟性狀遺傳改良提供一定的參考依據(jù)。目前，在豬上進行選擇信號檢測的研究報道了一系列重要的選擇信號候選區(qū)域，在不同的繁殖力群體中ESR、AREG、PRLP等多個基因受到了不同程度的選擇作用[5-6]；BARX2基因作為肌肉生長、再生和維護的重要調(diào)節(jié)基因，在約克夏豬與長白豬中均受到選擇[7]；影響豬椎骨數(shù)及體長的多個基因(如NR6A1、PLAG1、LCORL)在歐洲商業(yè)豬和大多數(shù)歐洲地方豬群體中受到了強烈選擇[8]；ADAMTS12、SIM1和NOS1基因顯示了藏豬自然選擇的特征，可能與高海拔適應(yīng)性相關(guān)，在具有帶型毛色的中國地方豬EDNRB基因位點上發(fā)現(xiàn)了強烈的定向選擇信號，表明EDNRB基因是中國地方豬白色帶型的潛在候選基因[9]。

隨著畜禽選擇信號研究的深入，近年來群體間平行選擇(parallel selection)信號的檢測逐漸成為群體遺傳學領(lǐng)域研究趨同遺傳基礎(chǔ)的重要方向[10]。Rehkamper等[11]研究發(fā)現(xiàn)，鳥類與哺乳動物大腦組織在結(jié)構(gòu)和功能上具有大量相似性，主要表現(xiàn)于端腦中多模態(tài)信息融合能力方面，揭示了脊椎動物間發(fā)生了平行進化。此外，在人、三刺魚及秀麗隱桿線蟲等物種中也發(fā)現(xiàn)諸多關(guān)于平行選擇的證據(jù)[12-14]。在畜禽相關(guān)研究方面，在蛋雞和肉雞群體中檢測到多個與體型外貌、生產(chǎn)性能相關(guān)的平行選擇候選基因，包括WWP1、BCDO2、TSHR、AGTR2和OPG等[[15-16]；在杜洛克豬和大白豬群體間檢測到67個平行選擇區(qū)域，并挖掘出多個調(diào)節(jié)豬生長發(fā)育、體型大小等性狀的候選基因[17]。

本研究擬通過對皮特蘭豬、杜洛克豬2個商業(yè)豬種進行選擇信號檢測，揭示其作為終端父本時重要經(jīng)濟性狀在人工選擇作用下的基因組變化特征，利用檢測到的群體間平行選擇候選區(qū)域，結(jié)合生物信息學分析揭示表型趨同的功能候選基因，為進一步解析皮特蘭豬、杜洛克豬2個品種重要經(jīng)濟性狀的遺傳基礎(chǔ)，探討表型趨同的遺傳機制以及商業(yè)豬重要經(jīng)濟性狀的遺傳改良提供一定的參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

本研究共選取2 165頭豬作為研究對象，樣本分別來自中國南方2個生豬企業(yè)的4個群體，包括來自A豬場的376頭皮特蘭群體(PP)和451頭杜洛克品系Ⅰ群體(DDⅠ)，以及來自B豬場的841頭杜洛克品系Ⅱ群體(DDⅡ)和497頭杜洛克品系Ⅲ群體(DDⅢ)。對每頭豬采集耳組織樣，-20 ℃保存，用于提取全基因組DNA。

1.2 方法

1.2.1 質(zhì)量控制及基因型填充 使用全基因組芯片進行基因分型，獲得4個群體的50K SNP芯片數(shù)據(jù)。使用Plink軟件[18]對50K SNP芯片數(shù)據(jù)進行質(zhì)量控制，條件為：①SNP檢出率(call rate)>90%；②樣本的檢出率>90%；③最小等位基因頻率(minor allele frequency，MAF)為0.01。利用Beagle軟件[19]對缺失的基因型進行填充，對填充后的群體計算個體間的親緣關(guān)系系數(shù)(PI_HAT)，并質(zhì)控掉親緣關(guān)系較近(PI_HAT>0.5)的個體。

1.2.2 選擇信號檢測 利用綜合單倍型評分(iHS)[20]與等位基因頻率差(△AF)2種方法分別進行群體內(nèi)及群體間選擇信號檢測，△AF定義為2個群體間等位基因頻率差的絕對值。研究利用R語言中的REHH包[21]及Plink軟件，按照100 kb窗口、50 kb步長在全基因組范圍內(nèi)劃分窗口進行選擇信號檢測，對窗口統(tǒng)計量平均值進行秩排序，取其前5%的窗口作為選擇信號顯著候選區(qū)域。

1.2.3 平行選擇信號候選區(qū)域鑒定 結(jié)合iHS和△AF進行皮特蘭豬和杜洛克豬群體間的平行選擇信號檢測。4個群體兩兩組合，以PP、DDⅠ群體為例，利用bedtools軟件將iHS、△AF 2種統(tǒng)計量所對應(yīng)的選擇信號候選區(qū)域按照窗口左右200 kb的范圍進行合并。提取iHSPP和iHSDDⅠ重疊區(qū)域，再提取iHSPP_iHSDDⅠ與△AFPP-DDⅠ的重疊區(qū)域，所得區(qū)域即定義為PP和DDⅠ 2個群體間的平行選擇候選區(qū)域。

1.2.4 選擇信號候選區(qū)域注釋 基于定位到的平行選擇候選區(qū)域，利用Ensembl[22]平臺的BioMart(http:∥www.biomart.org)軟件進行基因挖掘；使用DAVID[23]開展基因集進行富集分析，顯著富集條目定義為P<0.05；基于Ensembl注釋的基因，通過NCBI數(shù)據(jù)庫對其進行功能注釋，挖掘與豬繁殖、生長和肉質(zhì)等性狀相關(guān)的候選基因。

2 結(jié) 果

2.1 數(shù)據(jù)質(zhì)量控制

皮特蘭豬和杜洛克豬4個群體的SNP數(shù)據(jù)質(zhì)量控制結(jié)果見表1。由表1可知，質(zhì)控后DDⅠ群體獲得的SNPs數(shù)目最多(44 056個)，DDⅢ群體獲得的SNP數(shù)目最少(37 323個)。2 165個樣本中通過樣本檢出率的個體共2 140個，對其經(jīng)親緣關(guān)系系數(shù)過濾(PI_HAT>0.5)后，最終得到1 003個親緣關(guān)系較遠個體。

表1 皮特蘭豬和杜洛克豬群體質(zhì)量控制結(jié)果

2.2 群體內(nèi)選擇信號候選區(qū)域檢測

基于iHS方法群體內(nèi)選擇信號檢測發(fā)現(xiàn)，在PP群體的25 091個iHS統(tǒng)計量中有1 254個統(tǒng)計量達到顯著水平，長度為119.59 Mb，約占全基因組總長的4.94%；在DDⅠ群體的27 195個iHS統(tǒng)計量中有1 359個統(tǒng)計量達到顯著水平，長度為129.60 Mb，約占全基因組總長的5.35%；在DDⅡ群體的27 582個iHS統(tǒng)計量中有1 379個統(tǒng)計量達到顯著水平，長度為131.51 Mb，約占全基因組總長的5.43%；在DDⅢ群體的22 398個iHS統(tǒng)計量中有1 120個統(tǒng)計量達到顯著水平，長度為106.81 Mb，約占全基因組總長的4.41%(圖1)。

A～D，PP、DDⅠ、DDⅡ、DDⅢ群體A-D，PP，DDⅠ，DDⅡ and DDⅢ populations,respectively圖1 皮特蘭豬和不同品系杜洛克豬群體內(nèi)信號檢測結(jié)果Fig.1 Ingroup selection signature detection results of Pietrain pigs and different strains of Duroc pigs

2.3 群體間選擇信號候選區(qū)域鑒定

由表2可知，基于△AF方法群體間選擇信號顯著候選區(qū)域共有9 579個，總長度為913.50 Mb，其中，PP-DDⅠ、PP-DDⅡ、PP-DDⅢ、DDⅠ-DDⅡ、DDⅠ-DDⅢ、DDⅡ-DDⅢ群體對分別檢測到1 648、1 541、1 467、1 689、1 616和1 618個基因組候選區(qū)域，分別約占基因組總長的6.49%、6.07%、5.78%、6.65%、6.38%和6.38%。

表2 皮特蘭豬和不同品系杜洛克豬群體間選擇信號檢測結(jié)果

2.4 平行選擇候選區(qū)域鑒定

將iHS統(tǒng)計量按照窗口左右各200 kb的范圍進行合并處理，共檢測出1 591個群體內(nèi)選擇信號候選區(qū)域，其中PP群體390個，長度為99.75 Mb；DDⅠ群體460個，長度為110.82 Mb；DDⅡ群體400個，長度為106.86 Mb；DDⅢ群體341個，長度為86.93 Mb(表3)。

表3 群體內(nèi)選擇信號候選區(qū)域

將△AF統(tǒng)計量按照窗口左右各200 kb的范圍進行合并處理，共發(fā)現(xiàn)3 466個群體間選擇信號候選區(qū)域，其中PP-DDⅠ群體間有851個候選區(qū)域，長度為136.14 Mb；PP-DDⅡ群體間有795個，長度為127.28 Mb；PP-DDⅢ群體間有733個，長度為121.74 Mb；DDⅠ-DDⅡ群體間有798個，長度為137.66 Mb；DDⅠ-DDⅢ群體間有744個，長度為136.42 Mb；DDⅡ-DDⅢ群體間的候選區(qū)域有678個，長度為127.36 Mb(表4)。

表4 群體間選擇信號候選區(qū)域

利用bedtools軟件在4個群體中共挖掘到52個平行選擇候選區(qū)域(54個區(qū)域中包含2個重復(fù)區(qū)域)，其長度約為4.67 Mb，值得注意的是，在DDⅠ-DDⅢ群體間檢測到的5個平行選擇候選區(qū)域中，位于11及14號染色體的2個區(qū)域分別在PP-DDⅢ、DDⅠ-DDⅡ群體間被檢測到，長度均約為0.095 Mb(圖2)。

2.5 平行選擇信號候選區(qū)域基因功能注釋

利用BioMart軟件挖掘平行選擇區(qū)域的基因，注釋到88個平行選擇候選基因。DAVID數(shù)據(jù)庫中GO功能富集結(jié)果顯示，DDⅠ-DDⅡ群體間的平行候選基因LIPA、LIPM參與脂質(zhì)分解過程；PP-DD Ⅰ群體間平行選擇候選區(qū)域功能注釋結(jié)果見表5，挖掘出多個與生殖系統(tǒng)發(fā)育(HSD17B4、FAM170A、AXDND1)、調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝和脂肪酸代謝(HSD17B4、SOAT1、COMMD6、CDCP1、ACSL5)、參與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)修飾(ZDHHC6)等生物過程相關(guān)的候選基因；PP-DDⅡ群體間注釋到4個平行選擇候選基因(GALNT18、FER、LDLRAD4、PLCB4)，參與調(diào)節(jié)機體生長發(fā)育及細胞增殖等；PP-DDⅢ群體間挖掘出多個與脂肪沉積相關(guān)的基因(KLHDC3、MEA1、GPC6)；DDⅠ-DDⅡ群體間挖掘到33個平行選擇候選基因；DDⅠ-DDⅢ群體間挖掘到8個候選基因；DDⅡ-DDⅢ群體間挖掘到11個候選基因，主要調(diào)控豬的胴體性狀(ACOXL、ZNF638、GCP6、SUPV3L1、LIPN、LIPM、ACTA2、LIPA、FFAR4、PDE6C、SMARCD1、SNCG)以及繁殖性狀(TMEM132D、VPS26A、RBP4、GDNF、SPACA3、BMPR1A)。

A～F，PP-DDⅠ、PP-DDⅡ、PP-DDⅢ、DDⅠ-DDⅡ、DDⅠ-DDⅢ和DDⅡ-DDⅢA-F，PP-DDⅠ，PP-DDⅡ，PP-DDⅢ，DDⅠ-DDⅡ，DDⅠ-DDⅢ and DDⅡ-DDⅢ,respectively圖2 群體間平行選擇候選區(qū)域數(shù)目Fig.2 Number of candidate regions for intergroup parallel selection

表5 PP-DDⅠ群體間平行選擇候選區(qū)域和候選基因

3 討 論

為研究皮特蘭豬和杜洛克豬作為終端父本在人工選擇作用下性狀趨同的基因組變化特征，本研究基于來自A豬場的PP、DDⅠ群體和來自B豬場的DDⅡ、DDⅢ群體的50K SNP芯片數(shù)據(jù)進行選擇信號檢測，通過整合iHS和△AF在PP、DDⅠ、DDⅡ和DDⅢ 4個群體中的選擇信號檢測結(jié)果，挑選至少在每2個群體中都存在的重疊區(qū)域，共得到52個性狀趨同的基因組區(qū)域，其中，皮特蘭豬與3個杜洛克豬群體間共檢測到21個候選區(qū)域，而3個杜洛克豬群體間共篩選出33個平行選擇的基因組候選區(qū)域，表明由于品種內(nèi)不同品系間具有更高的遺傳背景，因此性狀趨同的基因組特征一致性更高。然而，PP與DDⅠ群體間共檢測到10個候選區(qū)域，表明不同品種在相似育種方向的驅(qū)動下仍然能夠形成較高的基因組特征相似。此外，DDⅠ和DDⅡ群體間共篩選出18個候選區(qū)域，與兩群體均屬于美系杜洛克豬密切相關(guān)；盡管DDⅠ和DDⅢ群體均屬于杜洛克豬品種，但DDⅢ群體為丹系杜洛克豬且來源于B豬場，在DDⅠ和DDⅢ群體間僅檢測到5個性狀趨同候選區(qū)域，表明不同品系間杜洛克豬群體的人工選擇方向可能存在一定的差異。

本研究對52個性狀趨同區(qū)域進行基因注釋，共挖掘出88個受選擇的候選基因，主要參與調(diào)節(jié)脂肪沉積、生長發(fā)育、繁殖、免疫等性狀。GO功能富集到脂質(zhì)分解過程，涉及LIPA、LIPM2個候選基因。研究表明，小鼠酸性脂肪酶基因受組織mRNA表達差異的影響，LIPA基因表現(xiàn)為廣泛的組織表達，而LIPM基因表達受限，僅在表皮組織中表達[24-25]；ZNF638、FFAR4、PDE6C基因共同參與調(diào)節(jié)脂肪細胞的發(fā)育和分化[26-28]；ACOXL、ACSL5、CDCP1、COMMD6、HSD17B4、SOAT1、PPP2R5D、KLHDC3和ACTA2基因通過調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝影響豬的脂肪沉積，進而影響豬的肌內(nèi)脂肪含量[29-36]；GNMT基因通過利用和分配營養(yǎng)素影響肉質(zhì)性狀[37]；PTPRM基因可調(diào)節(jié)肌肉生長發(fā)育[38]；SLC16A12基因參與肌酸的轉(zhuǎn)運，從而調(diào)節(jié)機體肌肉的生長發(fā)育[39]。豬的肉質(zhì)與肌內(nèi)脂肪含量和肌肉密切相關(guān)，因此上述基因在4個群體中受到趨同選擇。豬的生長速度與瘦肉率長期以來一直受到養(yǎng)殖戶和企業(yè)的關(guān)注，SUPV3L1基因是一種重要的發(fā)育調(diào)控基因，可調(diào)節(jié)機體的生長發(fā)育，SUPV3L1基因的表達始于囊胚期，在所有胎兒組織和細胞類型中廣泛表達，成年小鼠中敲除SUPV3L1基因會導(dǎo)致早衰，包括肌肉、脂肪組織的損失和嚴重的皮膚異常[40]；PLCB4基因能調(diào)節(jié)豬的生長和骨架，從而影響豬體重和身體構(gòu)象性狀[41]；CUL7基因?qū)ωi四肢和蹄筋堅固性起著重要作用[42]。

皮特蘭豬和杜洛克豬作為終端父本，盡管其在總產(chǎn)仔數(shù)性狀上選擇強度始終較低，然而精液品質(zhì)始終是重點關(guān)注的性狀類型。研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)AM170A基因可能通過調(diào)節(jié)其他基因的表達來介導(dǎo)其對精子細胞頭形和精子形成的影響[43]；AXDND1基因僅在人和小鼠的圓形和細長的精子細胞中表達，可能通過調(diào)節(jié)精子管的動力學、精子頭的形狀和精子鞭毛的組裝對精子發(fā)生和雄性生育起著重要作用[44]；KLHDC3與MEA1基因在人與小鼠中的同源基因均被證明與精子生成相關(guān)[45]；GDNF基因被證明與精原干細胞的維持密切相關(guān)[46]；SPACA3基因與精子頂體相關(guān)，直接影響精子和卵子結(jié)合過程，從而影響母畜受胎率[47]；SNCAIP和VPS26A基因調(diào)節(jié)胚胎發(fā)育，可間接影響產(chǎn)仔數(shù)；RBP4基因可影響豬繁殖性狀，相較于純合子個體，在雜合子個體中表現(xiàn)出較高的產(chǎn)仔數(shù)[48]。因此，在生產(chǎn)過程中，終端父本的繁殖性狀同第一母本一樣一直受到長時間、高強度的人工選擇，這些基因的發(fā)現(xiàn)可為繁殖性狀的遺傳標記提供一定參考。

此外，在集約化飼養(yǎng)條件下瘦肉型豬種的抗性實質(zhì)上長期處于高強度選擇壓力之下，本研究發(fā)現(xiàn)，在豬的選育過程中CAMK4、PTCRA和IFIT5基因受到強烈的選擇作用，其中，CAMK4基因是一種多功能絲氨酸/蘇氨酸激酶，其通過激活包括T細胞和抗原呈遞細胞的各種免疫細胞中的轉(zhuǎn)錄因子來調(diào)節(jié)基因表達[49]；PTCRA基因通過編碼前T細胞抗原受體α，以在分化的不同階段調(diào)節(jié)早期T細胞發(fā)育[50]；IFIT5基因是先天免疫反應(yīng)的重要增強因子，在IFIT5基因存在的情況下，宿主細胞的抗病毒反應(yīng)顯著增加[51]。

4 結(jié) 論

皮特蘭豬和杜洛克豬各群體內(nèi)選擇信號顯著候選區(qū)域共有5 112個，群體間的選擇信號候選區(qū)域共有9 579個，在群體之間存在平行選擇的候選區(qū)域共52個，包含88個受到平行選擇的基因；基因富集及功能注釋發(fā)現(xiàn)這些基因主要與豬的肉質(zhì)、生長發(fā)育及繁殖性狀相關(guān)，表明高強度的人工選擇作用是造成繁殖力、胴體、肉質(zhì)等重要經(jīng)濟性狀表型趨同的重要因素。