中藥化學(xué)教研實(shí)踐體會商榷
——以土牛膝物質(zhì)基礎(chǔ)研究為例

歐陽文，張 恒，王玉鳳，韓 越，王雄龍，裴 剛，何桂霞

（1.湖南中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，湖南 長沙 410208；2.瀏陽市中醫(yī)醫(yī)院，湖南 瀏陽 410300；3.湖南時(shí)代陽光博士后科研流動站協(xié)作研發(fā)中心，湖南 永州 410116）

“中藥化學(xué)”是指在中醫(yī)藥理論指導(dǎo)下，結(jié)合臨床用藥經(jīng)驗(yàn)，運(yùn)用現(xiàn)代的科學(xué)理論和技術(shù)研究中藥化學(xué)成分的學(xué)科[1]。 該學(xué)科通過研究中藥藥效物質(zhì)基礎(chǔ)來探索中藥發(fā)揮藥效的化學(xué)成分，從而構(gòu)建中醫(yī)藥與現(xiàn)代醫(yī)學(xué)的橋梁，加快推進(jìn)中醫(yī)藥現(xiàn)代化[2]。

在中藥化學(xué)的教學(xué)過程中，有部分師生對該課程還存在一定的理解誤區(qū)，容易導(dǎo)致錯誤的思維定式。 因此，不論是教師還是學(xué)生，僅掌握書本理論是遠(yuǎn)遠(yuǎn)不夠的，必須不斷學(xué)習(xí)該領(lǐng)域的新發(fā)展、新動態(tài)，通過科研工作積累的知識和經(jīng)驗(yàn)，補(bǔ)充和豐富該課程的教學(xué)內(nèi)容，從而能更好地教好該門課程。 課題組在土牛膝的物質(zhì)基礎(chǔ)研究實(shí)踐中獲得了很多有意義的知識，并成功將科研成果運(yùn)用到中藥化學(xué)的理論教學(xué)之中，取得了較好成效，現(xiàn)從成分提取、分離、鑒定等方面進(jìn)行交流。

1 成分提取的教研體會

中藥化學(xué)的提取方法有多種，在平時(shí)提取中運(yùn)用最多的方法仍然是溶劑提取法，該方法運(yùn)用的是“相似相溶”的原理，即成分與溶劑兩者的極性越相近，則溶解度更大[3]。 如提取皂苷類化合物，因極性較大，一般推薦采用甲醇或70%乙醇進(jìn)行提取。

土牛膝主要的物質(zhì)基礎(chǔ)是皂苷類，然而在實(shí)踐中發(fā)現(xiàn)采用100%乙醇提取、70%乙醇提取或熱水煎煮，很難有效提取出總皂苷，通過實(shí)踐發(fā)現(xiàn)，30%～50%乙醇提取的總皂苷提取率可達(dá)到2%。 另外，因土牛膝主要為酸性皂苷，含醇溶劑中加入適當(dāng)?shù)臍溲趸浀葔A性物質(zhì)，提取效率更高。 在提取、濃縮時(shí)，土牛膝皂苷類成分很容易析出，析出物若再采用30%～50%乙醇進(jìn)行溶解時(shí)則難以溶解，在實(shí)踐中探索發(fā)現(xiàn)，正丁醇-甲醇-水系統(tǒng)具有較好的溶解能力。 本文擬通過該案例說明，將科研實(shí)踐知識與教科書理論相結(jié)合，探索出最優(yōu)的提取條件。

2 化合物分離的教研體會

2.1 結(jié)晶的化合物可能是混合物

結(jié)晶和重結(jié)晶是利用溫度或溶劑不同引起化合物溶解度的改變，通過析出晶體，從而達(dá)到分離純化物質(zhì)的目的，是中藥有效成分分離最重要的一種方法[4-5]。 在實(shí)踐教學(xué)中，有相當(dāng)多的同學(xué)誤認(rèn)為結(jié)晶就是純化合物，應(yīng)該指明的是，結(jié)晶雖一般是同種分子定向排列，但也可以是同類分子的定向排列，因此，析出的晶體仍然有可能是混合物。

在近期研究中，本課題組對土牛膝中低極性組分進(jìn)行分離，獲得了菠菜甾醇類混合結(jié)晶。 通過對該晶體進(jìn)行高效液相色譜分析，可見3 個不同保留時(shí)間的色譜峰，進(jìn)一步經(jīng)過制備液相色譜分離和核磁共振波譜法鑒定，3 個峰分別鑒定為菠菜甾醇、7，8-二氫菠菜甾醇、22，23-二氫菠菜甾醇，具體結(jié)構(gòu)如圖1 所示。 從結(jié)構(gòu)上看，3 種菠菜甾醇分子的結(jié)構(gòu)極其類似，僅存在雙鍵位置和數(shù)量的差異，容易共同析出結(jié)晶。

圖1 3 種菠菜甾醇結(jié)構(gòu)

2.2 低極性化合物宜采用反相色譜分離

一般極性偏小的化合物或中極性的化合物，中藥化學(xué)教材推薦采用硅膠或氧化鋁吸附層析法分離，原理是利用化合物的極性差異，選擇合適的洗脫溶劑，讓被分離成分在流動相和固定相之間進(jìn)行連續(xù)多次的吸附與解析吸附，從而達(dá)到分離目的[6]。 通過實(shí)踐發(fā)現(xiàn)，能夠被固定相保留是能否使用該種方法分離的最重要依據(jù)。 硅膠和氧化鋁均為極性吸附劑，對極性很小的化合物沒有保留差異，因此分離效果并不理想。

仍以圖1 中3 種菠菜甾醇混合結(jié)晶的分離為例。在實(shí)踐中采用硅膠柱層析分離，無論硅膠是否活化及采用哪種溶劑系統(tǒng)洗脫分離，3 種物質(zhì)之間均沒有保留差異，因此沒有明顯分離效果。相反，C18反向色譜柱對小極性化合物的吸附能力較強(qiáng)[7]，上述3種菠菜甾醇混合結(jié)晶可以被C18反向填料牢牢吸附，雖然用純甲醇或純乙腈都很難洗脫下來，但通過摸索，在乙腈或甲醇中添加少許異丙醇（具體見后續(xù)制備液相色譜條件），3 種菠菜甾醇混合結(jié)晶的分離度明顯得到優(yōu)化，達(dá)到滿意的分離效果。

2.3 極性較大的皂苷類化合物宜采用正相硅膠色譜分離

皂苷是一類極性偏大的化合物，教材所介紹的具體分離方法包括反相色譜、正相硅膠柱色譜等，尤其現(xiàn)代研究認(rèn)識到反相色譜因其具有分離效率高、重現(xiàn)性好等優(yōu)點(diǎn)，在皂苷的分離分析方面應(yīng)用廣泛[8-9]。

課題組分離土牛膝皂苷類化合物時(shí)，首先采用了反相硅膠柱色譜進(jìn)行分離，雖然可以達(dá)到一定的分離效果，卻存在著吸附力不牢固、易串點(diǎn)、分離度差等缺點(diǎn)。 根據(jù)被分離化合物能否被固定相保留這一依據(jù)，改用正相硅膠柱色譜來分離，因硅膠是強(qiáng)極性吸附劑，皂苷類化合物的極性也比較大，因此應(yīng)增大洗脫劑極性，通過摸索取得了一定研究進(jìn)展，以土牛膝酸性皂苷竹節(jié)參皂苷Ⅳa 為例，最終確定分離條件為正相硅膠柱層析分離，乙酸乙酯∶88%甲酸水溶液（體積比為20∶1），通過兩次硅膠柱分離，從皂苷混合物中獲得了竹節(jié)參皂苷Ⅳa 的針狀結(jié)晶。

2.4 制備液相色譜應(yīng)用心得

制備液相色譜是指采用液相色譜技術(shù)制備純物質(zhì)，即分離收集一種或多種物質(zhì)，是中藥有效成分分離最有效的一種手段。 制備液相色譜中的“制備”這一概念指獲得一定量的單一化合物，但實(shí)驗(yàn)用制備色譜儀一次能分離的化合物量太少，因此，常規(guī)正相、反相柱色譜能分離的情況下，則不宜采用制備液相進(jìn)行分離。 且當(dāng)樣品還很復(fù)雜時(shí)，不建議直接進(jìn)行制備分離。

使用制備液相色譜時(shí)，首先需保證樣品盡可能純凈，或樣品只含兩至三個單體化合物。 另外，制備液相色譜流動相條件的摸索非常重要，由于樣品中可能存在結(jié)構(gòu)相似的化合物，因此對流動相條件的要求極其苛刻。 以土牛膝中3 種菠菜甾醇類混合結(jié)晶為例，通過不斷摸索得出最佳制備方法為：YMCPack ODS-A 半制備色譜柱（日本YMC 公司，10 mm×250 mm，5 μm 粒徑），乙腈：異丙醇（體積比為2.1∶0.9），每次進(jìn)樣0.1 mL，檢測波長205 nm。 3 種菠菜甾醇的高效液相色譜圖，如圖2 所示。

圖2 3 種菠菜甾醇混合晶體樣品的高效液相色譜圖

3 化合物結(jié)構(gòu)鑒定的教研體會

3.1 氫譜可用于化合物純度分析

核磁共振氫譜可以對化合物中不同化學(xué)環(huán)境的氫原子進(jìn)行判別，用來確定分子結(jié)構(gòu)。 值得注意的是，氫譜中峰的面積與所含氫的個數(shù)成正比關(guān)系，因此，可以通過分析氫譜來判斷化合物純度。

圖3 為前文所述的菠菜甾醇類混合結(jié)晶的氫譜圖，由圖可見，在化學(xué)位移0.80～0.90 的區(qū)間，各峰之間的峰面積比例不合理，以最高場δH0.559 3、0.574 1兩個峰為例，根據(jù)氫譜知識，該兩峰顯然各自為甲基，兩者峰面積之比為2.19∶2.65，提示分子不純。對混合結(jié)晶制備分離后的氫譜見圖4。 通過對比可以看出，分離純化之后的氫譜更加合理， 最高場之處只有1個δH0.575 2 的甲基峰，其他各峰之間的峰面積也成比例，說明化合物已經(jīng)純化。

圖3 混合結(jié)晶的氫譜圖

圖4 菠菜甾醇（分離后峰1）的氫譜圖

3.2 碳譜解析中重視類似化學(xué)結(jié)構(gòu)碳譜數(shù)據(jù)的收集

不同于化學(xué)合成分子的結(jié)構(gòu)鑒定，有機(jī)合成中，起始的原料都是已知的，還可通過反應(yīng)的原理推測最終產(chǎn)物分子的結(jié)構(gòu)，然而對于天然分子，即使是已知化合物，包括結(jié)構(gòu)類型、取代基等結(jié)構(gòu)信息仍是有限度的，因此，中藥活性成分鑒定是中藥化學(xué)教學(xué)的重點(diǎn)和難點(diǎn)。 碳譜是一種重要的結(jié)構(gòu)鑒定的波譜手段，可以給出有機(jī)化合物包括季碳在內(nèi)的“骨架”信息，以及判斷分子是否對稱，并具有分辨率高的特點(diǎn)。

碳譜中，取代基具有位移效應(yīng)，增加或減少一個取代基，一般對碳譜中α-C、β-C、γ-C 的影響較大，尤以直接相連的α-C 變化最大，但δ-C 及以上的化學(xué)位移值變化就不明顯了。換言之，取代基位移效應(yīng)主要影響的是局部碳化學(xué)位移值，因此，掌握收集更多種類似結(jié)構(gòu)的碳譜數(shù)據(jù)在碳譜解析中具有重要的意義。實(shí)踐中可將未知化合物的碳譜與相似模型化合物碳譜數(shù)據(jù)比較，數(shù)據(jù)相同部分的結(jié)構(gòu)也應(yīng)該一致，不同的碳譜數(shù)據(jù)，可能是由差異取代基所產(chǎn)生。

例如，土牛膝中竹節(jié)參皂苷Ⅰ、竹節(jié)參皂苷Ⅳa和竹節(jié)參皂苷Ⅳa 丁酯3 種皂苷類的化學(xué)結(jié)構(gòu)和碳譜數(shù)據(jù)分別見圖5、表1。 比較竹節(jié)參皂苷Ⅰ和竹節(jié)參皂苷Ⅳa，竹節(jié)參皂苷Ⅳa 是竹節(jié)參皂苷Ⅰ中C-3羥基葡糖糖醛酸苷化，因此，其C-3 化學(xué)位移相比竹節(jié)參皂苷Ⅰ變化較大，相鄰位點(diǎn)的C-2 和C-4 化學(xué)位移也有一定變化，其余位置碳譜數(shù)據(jù)變化不大。竹節(jié)參皂苷Ⅳa 丁酯是在竹節(jié)參皂苷Ⅳa 的Glu-6 上羧基丁酯基化，因此，其碳譜數(shù)據(jù)中Glu-6 碳的化學(xué)位移相比于竹節(jié)參皂苷Ⅳa 具有較大變化，而對其他距離取代基較遠(yuǎn)碳原子的化學(xué)位移影響較小或無。

表1 土牛膝中3 種相似皂苷譜學(xué)數(shù)據(jù)（150 MHz，δ ppm）

圖5 土牛膝中3 種皂苷類化合物的化學(xué)結(jié)構(gòu)

同種植物中次生代謝產(chǎn)物都有相似的生物合成路徑，或者不同次生代謝產(chǎn)物生物合成過程是相互關(guān)聯(lián)的，因此，在中藥活性成分結(jié)構(gòu)鑒定時(shí)，應(yīng)該重視類似結(jié)構(gòu)的收集，掌握同一植物中一些基本母核的碳譜數(shù)據(jù)，并把他們當(dāng)成模型化合物，通過取代基位移效應(yīng)，可以有效幫助鑒定未知化合物結(jié)構(gòu)。

4 生源途徑教學(xué)方面的體會

中藥有效成分一般指的是次生代謝產(chǎn)物，教學(xué)實(shí)踐中，學(xué)生掌握次生代謝產(chǎn)物的生源合成途徑有重要意義。 首先，生源合成途徑是初級代謝物和次級代謝物聯(lián)系的紐帶。 其次，生源合成途徑可以將天然產(chǎn)物復(fù)雜多變的化學(xué)結(jié)構(gòu)串聯(lián)起來，使之成為一個有機(jī)的整體。

大家熟悉的牛膝主要是指懷牛膝Achyranthes bidentata Blume 和川牛膝Cyathula officinalis Kuan的干燥根，土牛膝來源廣泛而復(fù)雜，包括莧科植物粗毛牛膝Achyranthes aspera L.、柳葉牛膝Achyranthes longifolia(Makino) Makino、鈍葉土牛膝Achyranthes aspera var. indica 及牛膝野生種Achyranthes bidentata Blume 等的干燥根及根莖[10]，課題組主要研究的是粗毛牛膝Achyranthes aspera L.。 懷牛膝、粗毛牛膝、柳葉牛膝、野生牛膝等來源于莧科牛膝屬植物，故其中應(yīng)該含有相同成分，經(jīng)過課題研究及文獻(xiàn)調(diào)研分析表明，莧科牛膝屬植物主要成分為三萜皂苷類化合物及甾酮類化合物，其主要共有甾酮類化學(xué)成分見表2[11]。 《中華人民共和國藥典》還收錄了另一種川牛膝，為莧科杯莧屬川牛膝Cyathula officinalis Kuan 的干燥根，懷牛膝與川牛膝質(zhì)量控制標(biāo)志物分別為β-蛻皮甾酮與杯莧甾酮[12]，兩者功效大致相同，但懷牛膝偏于補(bǔ)肝腎、強(qiáng)筋骨，而川牛膝偏于活血化瘀。 川牛膝中甾酮類化合物結(jié)構(gòu)與牛膝存在明顯差異，如表3 所示。

對比表2 與表3 可見，懷牛膝和川牛膝甾酮類化合物結(jié)構(gòu)中有相同點(diǎn)，如A/B 環(huán)均為順式稠合、B/C、C/D 環(huán)均為反式稠合、B 環(huán)上有α，β 不飽和酮。兩種牛膝亦存在顯著差異，如懷牛膝等在C-17 上的取代基大多是鏈狀結(jié)構(gòu)，而川牛膝的取代基則多含內(nèi)酯環(huán)狀結(jié)構(gòu)。由此可見，懷牛膝與川牛膝雖同為莧科植物，但其屬種的不同，次生代謝路徑不一致，造成了其甾酮類化合物中結(jié)構(gòu)的差異。 甾酮類化合物是懷牛膝和川牛膝的主要活性物質(zhì)之一，因此，兩者的功效差異可能與上述的結(jié)構(gòu)差異有關(guān)。

表2 莧科牛膝屬植物主要甾酮類成分

表3 莧科杯莧屬主要甾酮類成分

5 討論

教而不研則淺，研而不教則空?？蒲惺谴龠M(jìn)教師專業(yè)化發(fā)展的有效途徑，教學(xué)則是對教師知識的傳承與發(fā)展，因此科研與教學(xué)兩者密切相關(guān)。 在中藥化學(xué)的教學(xué)過程中，可以將自身的科研體會融入到日常教學(xué)當(dāng)中，不僅能提高學(xué)生對課程學(xué)習(xí)的興趣，同時(shí)教師也能借教學(xué)促進(jìn)自身的專業(yè)成長，在教與學(xué)的過程中不斷提高學(xué)術(shù)水平。 近年來，不少高校對中藥化學(xué)實(shí)驗(yàn)課程的教學(xué)進(jìn)行了改革方式的探索，以期提高中藥學(xué)專業(yè)學(xué)生綜合素質(zhì)與中藥化學(xué)教學(xué)質(zhì)量[13-16]。

結(jié)構(gòu)鑒定歷來是中藥化學(xué)教學(xué)的重點(diǎn)和難點(diǎn)，同時(shí)也是學(xué)生能否學(xué)好中藥化學(xué)的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。 中藥分子的結(jié)構(gòu)鑒定技術(shù)主要包括紫外吸收光譜、紅外吸收光譜、核磁共振光譜、質(zhì)譜和X-ray 晶體衍射等。 核磁共振碳譜中，不論是簡單的有機(jī)小分子，還是復(fù)雜的中藥分子，基于化學(xué)位移比較策略是鑒定平面結(jié)構(gòu)、相對構(gòu)型或者結(jié)構(gòu)片段的重要手段，通過與文獻(xiàn)報(bào)道的結(jié)構(gòu)或者結(jié)構(gòu)片段進(jìn)行化學(xué)位移比較，若核磁數(shù)據(jù)相同，未知化合物或者其中的結(jié)構(gòu)片段則與比較對象具有相同的結(jié)構(gòu)。 以本文所討論的土牛膝中竹節(jié)參皂苷Ⅰ、竹節(jié)參皂苷Ⅳa 和竹節(jié)參皂苷Ⅳa 丁酯3 種皂苷類的化學(xué)結(jié)構(gòu)和碳譜數(shù)據(jù)兩兩比較分析為例，與類似結(jié)構(gòu)碳譜數(shù)據(jù)比較進(jìn)行未知化合物的結(jié)構(gòu)鑒定是十分重要的一種手段，值得今后在教學(xué)和科研工作中廣泛推廣。

綜上，本課題組結(jié)合多年來在中藥化學(xué)方面實(shí)踐的內(nèi)容，對中藥化學(xué)中成分提取、化合物分離以及結(jié)構(gòu)鑒定等知識進(jìn)行了心得體會的交流，希望利用從實(shí)踐中探索出來的經(jīng)驗(yàn)加深學(xué)生對中藥化學(xué)的理解，提升中藥學(xué)專業(yè)學(xué)生的綜合素質(zhì)。