SARS-CoV-2病毒E蛋白誘發(fā)A549細(xì)胞炎癥反應(yīng)研究

夏 雯，殷云良，焦玉東，付士祥

(1. 鎮(zhèn)江高等?？茖W(xué)校 醫(yī)藥技術(shù)學(xué)院，江蘇 鎮(zhèn)江 212028； 2. 鎮(zhèn)江新區(qū)生態(tài)環(huán)境和應(yīng)急管理局 應(yīng)急管理科，江蘇 鎮(zhèn)江 212132；3. 揚(yáng)州市第三人民醫(yī)院 呼吸科，江蘇 揚(yáng)州 225000)

自2019年底開始在全球流行的新型冠狀病毒(SARS-CoV-2，簡稱新冠病毒)屬于有包膜的β屬冠狀病毒，與蝙蝠體內(nèi)分離的SARS病毒基因同源性高達(dá)85%，但尚無任何直接證據(jù)證實(shí)其來源于蝙蝠[1]。SARS-CoV-2主要依靠呼吸道飛沫傳播，受感染者會(huì)出現(xiàn)發(fā)熱、乏力和干咳等早期癥狀，并迅速蔓延至下呼吸道，出現(xiàn)新型冠狀病毒肺炎(COVID-19)癥狀，嚴(yán)重者還會(huì)出現(xiàn)急性呼吸窘迫綜合征和多臟器功能障礙綜合征甚至死亡[2]?，F(xiàn)有研究表明，“細(xì)胞因子風(fēng)暴”(cytokine storm)可能是SARS-CoV-2誘發(fā)急性呼吸窘迫綜合征的重要因素。免疫系統(tǒng)調(diào)控失衡使得大量促炎細(xì)胞因子爆發(fā)性釋放，對機(jī)體的損害遠(yuǎn)大于病毒本身，但目前對于SARS-CoV-2誘發(fā)“細(xì)胞因子風(fēng)暴”的確切機(jī)制仍不清楚[3]。E蛋白是冠狀病毒最小的結(jié)構(gòu)蛋白，屬于跨膜整合蛋白[4]。E蛋白不僅參與子代病毒的組裝和釋放，還與其致病能力密切相關(guān)。因此，針對E蛋白通道活性的阻滯劑，可阻斷病毒復(fù)制、組裝出芽及致病[5]。筆者通過優(yōu)化最適條件表達(dá)E蛋白，其純化后可被新冠病毒感染治愈患者體內(nèi)的E蛋白抗體所識別，為SARS-CoV-2抗原蛋白檢測提供支持。同時(shí)研究E蛋白激活人肺泡上皮細(xì)胞來源的A549細(xì)胞炎癥反應(yīng)，旨在深入了解該病毒的致病機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 材料

大腸埃希菌BL21(DE3)株由江蘇大學(xué)醫(yī)學(xué)院臨床檢驗(yàn)診斷學(xué)研究所保存，人肺腺癌(A549)細(xì)胞購自中科院上海細(xì)胞庫。胎牛血清、RPMI1640培養(yǎng)液購自美國Gbico公司。異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)、Ni-NTA介質(zhì)購自德國Qiagen公司。辣根過氧化物酶(horseradish peroxidase，HRP)標(biāo)記的山羊抗人IgG購自武漢博士德公司。PVDF膜(0.45 μm)購自Millipore公司。質(zhì)粒小量提取試劑盒、DNA marker和蛋白質(zhì)相對分子質(zhì)量(Mr)marker購自上海捷瑞公司。PCR儀、蛋白電泳轉(zhuǎn)印套件及凝膠成像儀均購自Bio-Rad公司。PCR引物由蘇州金唯智公司合成。液相去內(nèi)毒素試劑盒購自北京天恩澤公司。硫酸卡那霉素購自上海阿拉丁公司。細(xì)胞/組織總RNA提取試劑盒(TRIzol法)、BCA蛋白定量試劑盒購自南京諾唯贊公司。

1.2 方法

1.2.1 重組E蛋白(rE protein)原核表達(dá)載體構(gòu)建

由武漢金開瑞生物工程有限公司合成SARS-CoV-2(SARS-CoV-2/human/TUN/TUN-20211890/2021株)E蛋白基因(MW463889.1)，并通過EcoR V/Nco I定向克隆至 pET28a載體上，并經(jīng)過限制性內(nèi)切酶酶切和DNA測序驗(yàn)證，保證插入序列完全正確。

1.2.2 重組E蛋白表達(dá)純化

將已構(gòu)建的pET28a-rE protein重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入大腸桿菌BL21(DE3)株，挑取單個(gè)菌落接種于含50 mg·mL-1卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基，37 ℃振搖培養(yǎng)至培養(yǎng)液A600=0.6，溫度降至30 ℃，分別加入終濃度為0.4 mmol·L-1和1 mmol·L-1的IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，在2 h，4 h，6 h，8 h，10 h收集菌體，使用SDS-PAGE分析重組蛋白表達(dá)情況以確定最佳誘導(dǎo)條件。按最佳誘導(dǎo)條件，大量擴(kuò)增細(xì)菌，收集菌體，采用Ni-NTA介質(zhì)純化重組E蛋白，并去除內(nèi)毒素后用于細(xì)胞實(shí)驗(yàn)。

1.2.3 重組E蛋白濃度測定

采用BCA法測定重組E蛋白濃度。將標(biāo)準(zhǔn)品倍比稀釋，繪制成標(biāo)準(zhǔn)曲線，洗脫液調(diào)零。按說明書推薦，A ∶B = 50 ∶1制成AB混合液。每個(gè)樣本2個(gè)復(fù)孔，每孔加入10 μL蛋白和200 μL AB混合液。37 ℃避光顯色30 min，使用多功能酶標(biāo)儀讀取562 nm處的光密度。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算相應(yīng)濃度。

1.2.4 重組E蛋白與新冠病毒感染治愈患者血清反應(yīng)

選取3名揚(yáng)州市第三人民醫(yī)院收治的臨床確診新冠病毒感染患者，于治愈出院時(shí)采集血清樣本，以健康者血清為對照。采用Western blotting法進(jìn)行檢測，具體方法如下：取0.1 mg重組E蛋白與5×SDS上樣緩沖液混勻，煮沸10 min后進(jìn)行SDS-PAGE；將目的蛋白以300 mA，90 min條件下轉(zhuǎn)印到PVDF膜上，50 g·L-1脫脂奶粉室溫封閉60 min，以健康者血清和新冠病毒感染患者血清(1 ∶200)為一抗，4 ℃過夜孵育，TBST洗滌3次，以HRP標(biāo)記的山羊抗人IgG(1 ∶1000)作為二抗，室溫孵育1 h；TBST緩沖液洗滌3次后加入ECL顯色，觀察結(jié)果。

1.2.5 NLRP3炎癥復(fù)合體mRNA表達(dá)量檢測

A549細(xì)胞以每孔1×106的數(shù)目接種6孔細(xì)胞培養(yǎng)板，分別以10 μg·L-1和100 μg·L-1重組E蛋白處理A549細(xì)胞1 h。實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)收集細(xì)胞并提取細(xì)胞總RNA，用于實(shí)時(shí)定量PCR法檢測。具體方法為：以TRIzol法提取細(xì)胞總RNA，以HiScript Q RT SuperMix for qPCR(+gDNA wiper)試劑盒去除總RNA中基因組DNA并逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，采用AceQ qPCR SYBR Green Master Mix試劑盒檢測NLRP3，Caspase-1和IL-1β的mRNA表達(dá)量。引物序列及反應(yīng)條件參考文獻(xiàn)[5]。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 重組E蛋白表達(dá)純化

攜帶pET28a-rE protein重組質(zhì)粒的BL21菌，在30 ℃，1 mmol·L-1IPTG誘導(dǎo)8 h可獲得最大表達(dá)量。經(jīng)Ni-NTA介質(zhì)純化后，SDS-PAGE分析可見Mr 83 00處有特異蛋白條帶，與預(yù)期SARS-CoV-2病毒E蛋白相對分子量大小一致，表明E蛋白表達(dá)成功。結(jié)果見圖1。

圖1 重組E蛋白表達(dá)純化

2.2 重組E蛋白與新冠病毒感染治愈患者血清反應(yīng)

Western blotting實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，當(dāng)以HRP標(biāo)記的山羊抗人IgG為二抗時(shí)，新冠病毒感染治愈患者體內(nèi)E蛋白抗體能被檢出，而健康者血清樣品未被檢出，說明重組E蛋白能夠被新冠病毒感染治愈患者血清中E蛋白抗體所識別。結(jié)果見圖2。

1： 健康者；2～4： 3名新冠病毒感染治愈患者

2.3 重組E蛋白誘導(dǎo)A549細(xì)胞NLRP3炎性復(fù)合體活化

與對照組比較，10 μg·L-1組和100 μg·L-1組細(xì)胞的NLRP3，Caspase-1和IL-1β mRNA表達(dá)量均顯著升高(P<0.05)，且100 μg·L-1組顯著高于10 μg·L-1組(P<0.05)。結(jié)果見圖3。

*： P<0.05，與對照組比較；#： P<0.05，與10 μg·L-1組比較

3 討論

E蛋白屬于冠狀病毒膜孔蛋白家族，是一種在病毒生命周期中重要的功能性小跨膜蛋白[6]。病毒膜孔蛋白可在宿主細(xì)胞膜上多聚化，形成親水性離子通道，增加宿主細(xì)胞膜對各種離子(包括Na+、K+、Ca2+、H+、Cl-)的通透性，進(jìn)而影響病毒的入胞、基因組復(fù)制、子代病毒的組裝和出芽，因此E蛋白對于冠狀病毒的正常增殖具有重要意義并直接影響病毒致病性[7]。研究表明，敲除豬傳染性胃腸炎病毒(transmissible gastroenteritis virus)和MERS-CoV病毒基因組中E蛋白編碼基因后，病毒雖然能夠復(fù)制，但是不能感染新的細(xì)胞。敲除SARS-CoV-1病毒基因組E蛋白編碼基因后，病毒雖然也能夠在體外培養(yǎng)的Vero細(xì)胞中復(fù)制增殖，但病毒滴度較野生株下降了20～1 000倍。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究也表明，缺失E基因的SARS-CoV-1病毒毒力大大降低，其誘發(fā)宿主炎癥反應(yīng)水平也顯著降低[8]。但目前對SARS-CoV-2病毒E蛋白誘發(fā)宿主細(xì)胞炎癥反應(yīng)能力尚缺乏研究。

筆者成功純化獲得重組SARS-CoV-2病毒E蛋白，該重組蛋白能夠被新冠病毒肺炎治愈者血清中抗體所識別。最新研究表明，NLRP3炎癥復(fù)合體的過度活化可能是誘發(fā)SARS-CoV-2病毒感染者嚴(yán)重并發(fā)癥的“罪魁禍?zhǔn)住??；罨腘LRP3炎癥復(fù)合體通過細(xì)胞內(nèi)Caspase-1觸發(fā)免疫反應(yīng)，釋放大量促炎細(xì)胞因子(如IL-1β和IL-18)，并且通過在細(xì)胞膜中產(chǎn)生Gasdermin D孔通道，介導(dǎo)細(xì)胞“焦亡”發(fā)生[9]。 在感染早期，NLRP3炎癥復(fù)合體的激活以及促炎細(xì)胞因子的釋放有助于患者清除病毒，但隨著體內(nèi)病毒數(shù)量增多，NLRP3炎癥復(fù)合體活化的增加以及大量促炎細(xì)胞因子釋放，在殺傷SARS-CoV-2病毒的同時(shí)，也造成了“細(xì)胞因子風(fēng)暴”，患者正常組織和細(xì)胞也因過度炎癥反應(yīng)而受損[10]。此外，SARS-CoV-2病毒不僅可以活化患者體內(nèi)巨噬細(xì)胞和黏膜上皮細(xì)胞內(nèi)NLRP3炎癥復(fù)合體，甚至可以通過造血干/祖細(xì)胞(HSPCS)表面血管緊張素轉(zhuǎn)換酶2受體(ACE2)進(jìn)入HSPCS細(xì)胞內(nèi)，激活此類細(xì)胞的NLRP3炎癥復(fù)合體，進(jìn)而誘發(fā)“細(xì)胞因子風(fēng)暴”[10]。

4 結(jié)束語

SARS-CoV-2病毒E蛋白作用于A549細(xì)胞1 h時(shí)，在感染早期即可誘發(fā)黏膜上皮細(xì)胞炎癥反應(yīng)，促使細(xì)胞釋放活性氧和促炎細(xì)胞因子，加重患者炎癥損傷，進(jìn)而加重病情。尋找改善患者炎癥損傷的方法則有待更多研究。