人工神經(jīng)紅蛋白的亞硝酸鹽還原酶活性研究

董 碩,董 鑰,孔祥君,林英武,杜可杰

(南華大學(xué) 化學(xué)化工學(xué)院,湖南 衡陽(yáng) 421001)

0 引 言

一氧化氮(NO)在哺乳動(dòng)物各種生理和病理過(guò)程中起著關(guān)鍵作用，這些過(guò)程大多涉及細(xì)胞間信號(hào)傳導(dǎo)和細(xì)胞-母體響應(yīng)[1-2]。在體內(nèi)主要由NO合成酶進(jìn)行合成[3]。對(duì)于哺乳動(dòng)物來(lái)說(shuō)，在缺氧條件下，NO合成酶活性下降，則依賴亞硝酸鹽還原酶(nitrite reductase,NIR)將亞硝酸鹽還原為一氧化氮(NO)[4-7]。NIR廣泛存在自然界中，天然的NIR主要分為銅類亞硝酸鹽還原酶(CuNIR)和血紅素類亞硝酸鹽還原酶(cd1NIR)兩大類[8-9]，其中，血紅素類蛋白中血紅蛋白(Haemoglobin)、肌紅蛋白(Myoglobin)、細(xì)胞色素c(Cytochromec)、細(xì)胞色素bc1(Cytochromebc1)以及線粒體電子傳遞鏈的細(xì)胞色素c氧化酶(Cytochromecoxidase)等都有相關(guān)亞硝酸鹽還原酶活性的報(bào)道[10-11]。例如在人體中，通過(guò)血紅蛋白的亞硝酸鹽還原來(lái)調(diào)節(jié)血壓、缺氧血管舒張、血小板活化和細(xì)胞對(duì)缺氧狀態(tài)的適應(yīng)等[12-13]。

人的神經(jīng)紅蛋白(neuroglobin,Ngb)是本世紀(jì)初由德國(guó)科學(xué)家T.Burmester等人[14]發(fā)現(xiàn)，作為一種典型的血紅素蛋白，近年來(lái)其體外生物活性研究得到廣泛關(guān)注[4,15]。該蛋白擁有六配位b型血紅素，軸向配位為His64/His96，其中His64可以被NO、O2等小分子取代，因此展現(xiàn)一些如亞硝酸鹽等生物活性。M.T.Gladwin等人[10]發(fā)現(xiàn)Ngb血紅素配位情況的改變會(huì)調(diào)控NIR活性，蛋白中心血紅素位點(diǎn)空腔的變化會(huì)直接關(guān)系到NIR活性強(qiáng)弱，通過(guò)對(duì)46位點(diǎn)和55位點(diǎn)的人工設(shè)計(jì)形成穩(wěn)定的五配位血紅素中心，其NIR活性比野生型六配位活性中心的神經(jīng)紅蛋白要快近2 000倍。隨后，該課題組對(duì)神經(jīng)紅蛋白突變體進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)[12]，將64位點(diǎn)進(jìn)行突變?yōu)楸彼幔玫骄哂懈蠡钚钥涨坏奈迮湮谎t素中心的Ngb，其NIR活性遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于之前報(bào)道過(guò)的Ngb。因此，Ngb的血紅素中心的配位構(gòu)型及其活性空腔對(duì)其生物活性起了較大的影響。通過(guò)理性設(shè)計(jì)將Ngb的64位點(diǎn)的組氨酸(His64)突變?yōu)榧琢虬彼?Met64)得到五配位Ngb[16]，同時(shí)為了減少Ngb分子間的二聚，將120位點(diǎn)突變?yōu)榘腚装彼?Cys)，最終突變得到H64M/C120S Ngb，并對(duì)其亞硝酸鹽還原活性進(jìn)行了研究。結(jié)果表明，突變體H64M/C120SNgb在低氧條件下同樣表現(xiàn)出比WT Ngb更優(yōu)秀的NIR活性。

1 材料和方法

1.1 試劑和儀器

試劑：BL21(DE3)大腸桿菌、XL10 Gold菌質(zhì)粒提取試劑盒(QIAGEN，德國(guó))、連二亞硫酸鈉(阿拉丁，上海)、亞硝酸鈉(阿拉丁，上海)。實(shí)驗(yàn)所用試劑均為分析純。

儀器：紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)(UV-Vis，Aglient 8453)、液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀(LC-MS，Waters Xevo G2-XS QTof)、電子順磁共振波譜儀(EPR，Bruker A300)等。

1.2 蛋白的表達(dá)與純化

野生型神經(jīng)紅蛋白(WT Ngb)通過(guò)將包含Ngb基因的pET3a質(zhì)粒導(dǎo)入到BL21(DE3)大腸桿菌中表達(dá)獲得。其突變體H64M/C120S Ngb蛋白表達(dá)過(guò)程與前面過(guò)程一致。蛋白表達(dá)和純化步驟參照之前的實(shí)驗(yàn)方法[16]，并作出適當(dāng)調(diào)整，蛋白濃度通過(guò)吸光度計(jì)算得到，WT Ngb和H64M/C120 Ngb摩爾消光系數(shù)分別為ε413=129 L/(mmol·cm)、ε405=150 L/(mmol·cm)。

1.3 質(zhì)譜表征

突變體蛋白質(zhì)譜數(shù)據(jù)在電噴霧電離質(zhì)譜儀上測(cè)得。將H64M/C120S Ngb樣品脫鹽處理后，與1%的甲酸(體積比為水∶甲酸=99∶1)混合，蛋白混合溶液轉(zhuǎn)移到樣品室，在正離子模式測(cè)量。使用軟件MaxEnt1將多電荷峰處理得到蛋白質(zhì)分子量。

1.4 NIR活性研究

通過(guò)紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)檢測(cè)在定量蛋白酶(10 μmol/L)存在并加入還原劑后的亞硝酸鹽光譜變化，來(lái)表征蛋白酶的亞硝酸鹽活性。該反應(yīng)體系在常溫(25 ℃)無(wú)氧條件下進(jìn)行，緩沖體系采用磷酸鹽緩沖液(pH=7.4, 100 mmol/L)，所有溶液使用前均充分除氧，并充入高純N2進(jìn)行保護(hù)備用。將Ngb加入密封比色皿中除氧，用密封注射器依次添加2.5 mmol/L連二亞硫酸鈉和適當(dāng)濃度梯度的亞硝酸鈉溶液，立即監(jiān)測(cè)亞硝酸鹽還原前后的光譜變化。表觀速率常數(shù)(kobs，s-1)由脫氧神經(jīng)紅蛋白Q帶的吸光度和時(shí)間擬合得到式(1)。

y=y0+ae-kt

(1)

亞硝酸鹽還原的分子速率常數(shù)(knitrite,L/(mol·s))由表觀速率常數(shù)和亞硝酸鹽濃度線性擬合得到。

1.5 電子順磁共振波譜研究

還原態(tài)下WT Ngb及其突變體H64M/C120S Ngb波譜通過(guò)Bruker A300電子順磁共振(electron paramagnetic resonance,EPR)波譜儀進(jìn)行檢測(cè)。該反應(yīng)在專用石英EPR管中進(jìn)行，將WT Ngb或H64M/C120S Ngb(0.15 mmol/L)與連二亞硫酸鈉(30 mmol/L)混合，徹底除氧后通入高純N2，再加入除氧NaNO2(15 mmol/L)，在90 K下檢測(cè)其電子順磁共振波譜圖。

2 結(jié)果與討論

2.1 突變體蛋白純化及表征

為了對(duì)突變體蛋白H64M/C120S Ngb進(jìn)行明確的表征，對(duì)其純化后的樣品進(jìn)行了質(zhì)譜測(cè)試。結(jié)果顯示其分子量為16 909.5 Da(圖1)，與脫輔基蛋白計(jì)算值相吻合，可以確定純化所得蛋白即為目標(biāo)蛋白，同時(shí)也說(shuō)明采用的純化方法適用于本突變體蛋白的純化。在之前我們組的研究中發(fā)現(xiàn)，H64M/C120S Ngb突變體蛋白相較于WT Ngb和Cyt c，64位點(diǎn)組氨酸(His)被蛋氨酸(Met)取代后自氧化形成SO-Met，并進(jìn)一步自氧化生產(chǎn)SO2-Met[16]。不同于野生型神經(jīng)紅蛋白的六配位情況，H64M/C120S Ngb由于Met的引入，形成五配位結(jié)構(gòu)，該五配位結(jié)構(gòu)形成了一定的蛋白空腔，并且為蛋白活性中心的血紅素鐵中心結(jié)合外源氧化還原試劑或底物提供了條件。

圖1 H64M/C120S Ngb質(zhì)譜圖

2.2 亞硝酸鹽還原酶活性研究

和其他血紅素蛋白一樣，神經(jīng)紅蛋白在厭氧條件下具有一定的亞硝酸鹽還原酶活性。為了研究突變體蛋白H64M/C120S Ngb構(gòu)象的改變對(duì)其亞硝酸鹽還原酶活性的影響，在準(zhǔn)一階條件下測(cè)定了不同濃度NaNO2下的蛋白NIR活性研究。在過(guò)量Na2S2O3存在下，在加入NaNO2后，蛋白將亞硝酸鹽還原，產(chǎn)生的NO結(jié)合到血紅素鐵中心，即還原狀態(tài)的Ngb紫外-可見(jiàn)光譜由脫氧形式轉(zhuǎn)變?yōu)镹O結(jié)合狀態(tài)。紫外-可見(jiàn)光譜圖顯示，無(wú)論是WT Ngb還是H64M/C120S Ngb在557 nm處均出現(xiàn)不同程度的降低(見(jiàn)圖2(a)，(c))，WT Ngb蛋白在557 nm處出現(xiàn)明顯的下降。H64M/C120S Ngb由于亞硝酸鹽活性過(guò)快，因此，加入NaNO2測(cè)定立即測(cè)定，其在557 nm處的紫外吸收峰已經(jīng)大幅度降低，這與J.Tejero等人之前的研究結(jié)果一致[12]。這說(shuō)明六配位活性中心WT Ngb的活性依賴His的解離速率，而五配位H64M/C120S Ngb的不存在配位中心的解離，大大的提高了其亞硝酸鹽還原速率。其亞硝酸鹽的還原可以通過(guò)方程來(lái)表示：

(1)

(2)

通過(guò)對(duì)表觀速率常數(shù)kobs和NaNO2濃度進(jìn)行線性擬合得到該蛋白還原亞硝酸鹽的二級(jí)速率常數(shù)knitrite。計(jì)算結(jié)果顯示，突變體蛋白H64M/C120S Ngb的knitrite達(dá)到了487 L/(mol·s)，遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于天然神經(jīng)紅蛋白(WT Ngb)所顯示的活性(0.44 L/(mol·s))，與文獻(xiàn)中報(bào)道的數(shù)據(jù)(0.52 L/(mol·s))非常接近。結(jié)果顯示通過(guò)對(duì)神經(jīng)紅蛋白血紅素活性中心構(gòu)象的改變，使NIR活性提高了超過(guò)1 000倍(見(jiàn)圖2(b)，(d))。對(duì)目前報(bào)道的類似蛋白及其突變體的亞硝酸鹽還原二級(jí)速率常數(shù)knitrite以進(jìn)行橫向?qū)Ρ?見(jiàn)表1)，通過(guò)對(duì)比發(fā)現(xiàn)，雙突變體H64M/C120S Ngb具有較高的活性，這說(shuō)明五配位結(jié)構(gòu)及64位的蛋氨酸的引入，能夠顯著增強(qiáng)其亞硝酸鹽還原酶活性，但是由于反應(yīng)太快，導(dǎo)致NaNO2加入后紫外-可見(jiàn)光譜的迅速變化，而且所有的反應(yīng)是在無(wú)氧密閉的條件下進(jìn)行，對(duì)反應(yīng)紫外檢測(cè)的速率提出來(lái)較大的挑戰(zhàn)，目前快速停留分析光譜儀器不能進(jìn)行無(wú)氧操作，如何精準(zhǔn)測(cè)量無(wú)氧條件下的紫外-可見(jiàn)光譜變化是今后需要解決的重要問(wèn)題。

表1 各血紅素蛋白亞硝酸鹽還原酶活性的kNitrite比較

圖2 WT Ngb和H64M/C120S Ngb的亞硝酸鈉反應(yīng)紫外-可見(jiàn)光譜圖以及表觀速率常數(shù)與亞硝酸鹽濃度的線性擬合圖

2.3 EPR研究

為了進(jìn)一步提供Ngb及其突變體的亞硝酸鹽還原的信息，對(duì)蛋白結(jié)合NO的復(fù)合物進(jìn)行EPR研究。電子順磁共振波譜圖可以證明順磁性物質(zhì)亞硝?；t素鐵的存在(見(jiàn)圖3)。低溫條件下(90 K)，H64M/C120S Ngb在還原亞硝酸鹽時(shí)，形成了亞鐵血紅素結(jié)合NO獨(dú)特的超精細(xì)的峰。H64M/C120S Ngb-NO(g⊥=2.037，g∥=1.981)和WT Ngb(g⊥=2.034，g∥=1.980)均是A型裂分峰信號(hào)，即NO與蛋白中心Fe的鍵合方向是與卟啉分子平面垂直的。這與M.Tiso等人[18]觀察到的人的神經(jīng)紅蛋白亞硝酰基血紅素鐵EPR峰形一致。研究結(jié)果說(shuō)明在還原條件下，H64M/C120S Ngb中心鐵原子可以與NO進(jìn)行較好的結(jié)合。

圖3 0.15 mmol/L還原態(tài)下的WT Ngb和H64M/C120S Ngb與15 mmol/L NaNO2反應(yīng)得到的電子順磁共振波譜圖

3 結(jié) 論

本實(shí)驗(yàn)以人的Ngb為模型，在其軸向配位引入一個(gè)Met，構(gòu)建得到突變體蛋白H64M/C120S Ngb，結(jié)果顯示其亞硝酸鹽還原速率常數(shù)knitrite為(487±23) L/(mol·s)，比WT Ngb提高了近1 000倍。EPR結(jié)果顯示，NO與血紅素中心Fe以垂直于卟啉分子的方向進(jìn)行結(jié)合，同時(shí)表明五配位血紅素中心相對(duì)于六配位活性中心的血紅素蛋白，在亞硝酸鹽還原酶活性表達(dá)過(guò)程中，不需要經(jīng)歷配位點(diǎn)的解離，有利于亞硝酸鹽還原酶的活性提高。