不同香型白酒香味物質(zhì)特征差異比較分析

何 菲，蔣洪久，玉光惠，唐平華

（仁懷醬香白酒科研所，貴州仁懷 564500）

自1979 年輕工業(yè)部主持第三屆全國評酒會以來，中國白酒香型歷經(jīng)40 余年的發(fā)展，從最先劃分的醬香、濃香、清香、米香四大基本香型，逐漸衍生出了由其中一種或多種工藝技術(shù)糅合的其他8種獨特香型。為充分表達白酒個性特征，白酒行業(yè)除進行一系列色、香、味、格等感官評價工作外，還開展了大量白酒風味特征化合物或主體香味物質(zhì)的研究，普遍認同四大酯（乙酸乙酯、己酸乙酯、丁酸乙酸、乳酸乙酯）、四大酸（乙酸、乳酸、己酸、丁酸）、高級醇（正丙醇、異丁醇、異戊醇、β-苯乙醇等）等物質(zhì)的香味特征和多組分香味物質(zhì)量比關(guān)系對白酒風味產(chǎn)生的綜合特征貢獻。

隨著色譜技術(shù)推廣和應用，大量研究集中對不同香型白酒中的醇類、羰基類、酸類、酯類、芳香族類、酚類、萜烯類、雜環(huán)類、氨基酸、無機離子等物質(zhì)進行檢測和比較分析，這些物質(zhì)既對白酒產(chǎn)生風味貢獻，又蘊藏生物活性健康價值，但也可能存在潛在食品安全風險。因此，實驗利用GC-MS 對樣品進行Q3-SCAN 定性，參考文獻采購色譜對照品進行氣相色譜和離子色譜全譜段定性定量分析，以期探索不同香型白酒中色譜微量成分之間的差異，為白酒香型識別和感官品評提供數(shù)據(jù)參考，為白酒微量和痕量物質(zhì)分析奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑及儀器

1.1.1 實驗樣品

實驗樣品酒樣來源品酒培訓機構(gòu)香型識別典型代表酒樣或知名酒企代表酒樣，且同一香型酒樣均來自不同生產(chǎn)企業(yè)，詳見表1。

表1 不同香型白酒樣品信息

1.1.2 試劑與藥品

乙醇（色譜純），德國默克股份兩合公司；91 組定性定量色譜標準對照品（純度≥99.5%，包含叔戊醇和乙酸正戊酯2 組內(nèi)標物質(zhì)，15 組分醇類物質(zhì)，17 組分羰基類物質(zhì)，9 組分酸類物質(zhì)，29 組分酯類物質(zhì)，6 組分芳香族物質(zhì)，8 組分雜環(huán)類物質(zhì)，4 組分無機陰離子，1 組分未作分類物質(zhì)），天津西瑪科技有限公司。

1.1.3 儀器與設(shè)備

Nexis GC-2030 氣相色譜儀，日本SHIMADZU公司；DionexIntegrion HPIC 高壓離子色譜儀，美國thermo scientific 公司；BS 244S 電子天平（感量：0.0001 g），北京塞多利斯儀器系統(tǒng)有限公司；Milli-QAA10 超純水系統(tǒng)，德國默克密理博公司；MS-X可調(diào)式混勻儀，美國SCILOGEX 賽洛捷克公司；10～100 μL、100～1000 μL、1～10 mL 移液器，艾德本（中國）有限公司；10 mL 容量瓶、50 mL 容量瓶、10 mL刻度試管，天津天科玻璃制品有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 標準溶液配制與樣品制備

標準曲線溶液配制：稱取標準對照品配制高濃度儲備液，配制中間濃度混標溶液進行預實驗，根據(jù)預實驗酒樣初測濃度，配制5 個合適的曲線系列混合標準溶液（其中，氣相色譜分析配制76 組分混標溶液，高壓離子色譜分析配制13 組分有機酸酸和無機陰離子混合標準溶液）。

氣相色譜分析樣品制備：準確取5.0 mL待測酒樣于10 mL 試管中，加入0.1 mL 2%（v/v）叔戊醇和乙酸戊酯2 組分內(nèi)標混合溶液，振蕩混勻靜置，穩(wěn)定平衡后，用于GC分析。

離子色譜分析樣品制備：準確取1.0 mL待測酒樣于50 mL 容量瓶中，加入二級去離子水定容，搖晃均勻穩(wěn)定后，用于HPIC分析。

1.2.2 儀器分析方法條件

氣相色譜條件：DB-Wax色譜柱（30 m×0.25 mm× 0.25 μm）；升溫程序：起始溫度28 ℃，保持12 min，以7.0 ℃/min 升溫至50 ℃，以3.5 ℃/min 升溫至95 ℃，以3.0 ℃/min 升溫至125 ℃，保持8 min，以1.5 ℃/min升溫至145 ℃，以8.0 ℃/min升溫至240 ℃，保持8 min，總時間80.21 min；進樣口溫度250 ℃；FID檢測器溫度250 ℃（氫氣H流量32.0 mL/min，純度≥99.999 %；干燥空氣Air 流量200.0 mL/min；尾吹氣流量24.0 mL/min）；載氣流速0.5 mL/min（氮氣N，純度≥99.999 %）；載流模式為恒流；分流進樣（分流比，45∶1）；進樣量1 μL。

高壓離子色譜條件：DionexIonPac AS11-HC 4×250 mm 陰離子色譜柱（配AG11-HC 4×50 mm色譜保護柱，柱溫箱溫度30 ℃）；EGC 500 KOH 淋洗液自動發(fā)生器；AERS 4 mm 自循環(huán)抑制器，抑制電流104 mA；流速：多步梯度類型，0～40 min流速1.0 mL/min，40～47 min 流速0.8 mL/min，47～50 min 流速1.0 mL/min；進樣量25.0 μL，稀釋因子50.0；檢測器：電導檢測器，檢測池溫度35 ℃；KOH淋洗液梯度洗脫程序，詳見表2。

表2 KOH淋洗液梯度洗脫程序

1.2.3 定性定量計算方法

配制混合標準溶液并結(jié)合樣品酒樣，逐一進行色譜條件優(yōu)化，得到儀器分析方法條件，再利用單體標準溶液逐一對保留時間定性，或進行同類屬性化合物分類分段保留時間定性。

根據(jù)預測樣品酒樣濃度，配制5 個合適濃度梯度系列混合標準溶液，氣相色譜分析樣品加入內(nèi)標，以待測組分與對應內(nèi)標物濃度比為橫坐標，以峰面積比為縱坐標，建立內(nèi)標法校準曲線進行定量濃度計算；高壓離子色譜分析，以待測組分濃度為橫坐標，以峰面積為縱坐標，建立外標法校準曲線進行定量濃度計算（樣品濃度需換算稀釋倍數(shù)）。

1.3 數(shù)據(jù)分析

數(shù)據(jù)采用SIMCA 14.1 進行偏最小二乘判別分析（partial least squares discrimination analysis,PLSDA），利用IBM SPSS Statistics 25.0 進行單因素方差分析（one-way analysis of variance,ANOVA）。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同香型白酒分析結(jié)果

實驗根據(jù)氣相色譜和離子色譜分析方法，測定得到不同香型白酒中15 組分醇類物質(zhì)，17 組分羰基類物質(zhì)，9 組分酸類物質(zhì)，29 組分酯類物質(zhì)，6 組分芳香族物質(zhì)，8 組分雜環(huán)類物質(zhì)，4 組分無機陰離子，1組分未作分類物質(zhì)（詳見表3）。

表3 不同香型白酒香味物質(zhì)檢測結(jié)果 （mg/L）

續(xù)表3 不同香型白酒香味物質(zhì)檢測結(jié)果 （mg/L）

不同香型白酒微量物質(zhì)統(tǒng)計結(jié)果顯示，醇類物質(zhì)總量醬香＞米香＞清香＞濃香；羰基類、酸類、酯類、雜環(huán)類和微量物質(zhì)總量高低順序相同，醬香＞濃香＞清香＞米香；芳香族和無機陰離子物質(zhì)總量高低順序相同，米香＞醬香＞清香＞濃香。排序中米香和清香型白酒出現(xiàn)跳位，醬香和濃香型白酒排位順序保持一致。同一香型白酒微量物質(zhì)統(tǒng)計顯示，醬香和濃香型白酒各物質(zhì)總量占比趨勢相同，酯類＞酸類＞醇類＞羰基類＞雜環(huán)類＞無機陰離子＞芳香族；清香和米香型白酒各類物質(zhì)總量占比趨勢相同，酯類＞酸類＞醇類＞羰基類＞無機陰離子＞芳香族＞雜環(huán)類，在雜環(huán)類物質(zhì)和無機陰離子占比排序上存在差異。

2.2 不同香型白酒香味物質(zhì)差異比較

為進一步比較各香味物質(zhì)濃度含量在不同香型白酒之間的差異，對分析測定的醇類、羰基類、酸類、酯類、芳香族、雜環(huán)類、無機陰離子等89 組香味物質(zhì)含量進行PLS-DA分析。

通過PLS-DA 模型[R2X(cum)=0.603,R2Y(cum)=0.918,Q2(cum)=0.829]可將不同香型白酒有效區(qū)分，模型解釋變量(R2Y)接近1，預測能力(Q2)大于0.5，且經(jīng)過200 次置換驗證Q2 回歸線截距為負值（醬香-0.377，濃香-0.327，清香-0.345，米香-0.41），說明模型無過擬合現(xiàn)象，可用于不同白酒香型分類差異剖析，R2X[1]、R2X[2]、R2X[3]因子得分二維和三維散點圖如圖1所示。

圖1 不同香型白酒微量物質(zhì)含量PLS-DA分析

PLS-DA 變量重要因子（Variable Importance for the Projection，VIP）表征了分類過程中各個變量的重要性，通常VIP 值大于1 的變量在不同樣本組之間的區(qū)分中起重要作用。通過VIP 值篩選出29 個差異標記物，ANOVA 分析進一步驗證了這些物質(zhì)含量在不同香型之間是否具有顯著差異（P＜0.05），最終確定28 個白酒香型差異標記物（詳見表4）。

表4 基于PLS-DA 篩選不同香型白酒差異標記物

統(tǒng)計PLS-DA 篩選差異標記物，發(fā)現(xiàn)酯類物質(zhì)有豆蔻酸乙酯、棕櫚酸乙酯、月桂酸乙酯、硬脂酸乙酯、丁二酸二乙酯、亞油酸乙酯、丁酸乙酯、癸酸乙酯、己酸乙酯、辛酸乙酯、油酸乙酯、庚酸乙酯12 個組分，醇類物質(zhì)有甲醇、異戊醇、正辛醇、3-甲基-3-丁烯-1-醇、正己醇、仲戊醇、2,3-丁二醇（內(nèi)消旋）7 個組分；芳香族物質(zhì)有β-苯乙醇、苯甲醛2 個組分；酸類物質(zhì)有異戊酸、丁酸、乳酸、己酸4 個組分；羰基類物質(zhì)有3-乙氧基-1-丙醇、3-羥基-2-丁酮2個組分；無機陰離子有PO1個組分。

結(jié)合表3 各香型白酒濃度含量分析，VIP 值大于1 的28 種差異標記物中醬香型白酒中含量相對其他香型較高的有苯甲醛、2,3-丁二醇(內(nèi)消旋)、3-甲基-3-丁烯-1-醇、3-羥基-2-丁酮、亞油酸乙酯、油酸乙酯、乳酸等；濃香型白酒中含量相對其他香型較高的有仲戊醇、正己醇、正辛醇、丁酸乙酯、己酸乙酯、辛酸乙酯、庚酸乙酯、丁酸、異戊酸、己酸等；清香型白酒中含量相對其他香型較高的有丁二酸二乙酯，其余差異標記物相對其他香型白酒較低；米香型白酒中含量相對其他香型較高的有β-苯乙醇、異戊醇、3-乙氧基-1-丙醇、3-甲基-3-丁烯-1-醇、癸酸乙酯、月桂酸乙酯、豆蔻酸乙酯、棕櫚酸乙酯、硬脂酸乙酯、亞油酸乙酯、PO等。

3 結(jié)論

本研究采用實驗室常用的氣相色譜儀和離子色譜儀測定4 大香型白酒中微量物質(zhì)組分的精確含量，并全面解析不同香型白酒之間的差異。總體上醬香和濃香型白酒擁有大量的酯類、酸類物質(zhì)，且醬香型白酒含有較高的羰基類和雜環(huán)類物質(zhì)；清香和米香型白酒微量物質(zhì)種類和含量相對較為簡單，但米香型白酒中含有較高的芳香族和無機陰離子物質(zhì)，清香型白酒則表現(xiàn)較為平常單一。研究進一步利用偏最小二乘回歸分析法篩選出28 種差異特征標記物，主要代表有β-苯乙醇、苯甲醛、3-甲基-3-丁烯-1-醇、正己醇、正辛醇、丁酸乙酯、己酸乙酯、辛酸乙酯、庚酸乙酯、丁二酸二乙酯、丁酸、異戊酸、己酸、乳酸等，在不同香型白酒中貢獻了不同程度的香氣和口味特征。本研究建立的氣相色譜法和離子色譜法可在生產(chǎn)企業(yè)進一步推廣運用，差異特征標記物也可用于白酒香型品評評價。