醬香型白酒酒醅中乙醇測定方法的不確定度評定

聶 葉，焦 富，羅汝葉，李巧玉，牟明月

（貴州茅臺酒股份有限公司，貴州仁懷 564501）

在醬香型白酒生產過程中對酒醅中乙醇的監(jiān)測是了解酒醅發(fā)酵狀態(tài)的重要參數之一。酒醅中乙醇測定結果的準確性直接關系到釀造過程酒醅發(fā)酵狀態(tài)的判斷，及時、準確的檢測結果可為生產指導提供有效的數據支撐。選擇一種準確、快速、穩(wěn)定的乙醇檢測方法對釀酒生產指導非常重要。目前對于乙醇的檢測方法有蒸餾法、氣相色譜法、頂空氣相色譜法、氣相色譜質譜聯(lián)用法等。GB 5009.225—2016《食品安全國家標準酒中乙醇濃度的測定》中給出了4 種酒中乙醇濃度的測定方法，包括蒸餾法和氣相色譜法。針對酒醅中乙醇的測定目前無國家標準或行業(yè)標準，本文采用頂空氣相色譜法，結合超聲提取、冷凍高速離心技術，建立醬香型白酒酒醅中乙醇檢測方法，該方法具有快速、準確、穩(wěn)定、成本低等特點。

測量不確定度是質量控制的重要內容之一。測定不確定度是合理地表征賦予被測量值的分散性，與測量結果相聯(lián)系的參數。測量不確定度的評定是評價實驗室測定結果可信度的定量指標。目前有關乙醇含量測量不確定度評定主要集中在血液中乙醇含量測定，酒醅中乙醇含量的不確定度評定未見報道。本研究根據《測量不確定度評定與表示》（JJF 1059.1—2012）、CNAS-GL05：2011《測量不確定度要求的實施指南》及CNASGL06：2019《化學分析中不確定度的評估指南》，對頂空氣相色譜法（headspace gas chromatography，HS-GC）測量酒醅中乙醇結果的不確定度進行評定，分析不確定度來源，確定影響結果的主要因素，以期為實驗室檢測乙醇的準確性和可靠性提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料、儀器

酒醅樣品：醬香型白酒出窖酒醅、堆積酒醅、窖內酒醅；乙醇（純度≥99.9%），美國TEDIA公司。

儀器設備：頂空-氣相色譜儀（配有氫火焰離子化檢測器（flame ionization detector，FID）），7697A-7890 B，美國Agilent 公司；離心機（MIKRO 220R），德國Hettich 公司；分析天平（XP205），梅特勒-托利多公司；實驗室純水系統(tǒng)，上海HHitech 公司；回旋振蕩器（HZ-300），江蘇科析儀器公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 樣品前處理

準確稱取15.00 g酒醅置于50 mL離心管中，加入30 mL 超純水，280 r/min 振蕩15 min，超聲提取5 min，4 ℃條件下8000 r/min 離心3 min，準確吸取4 mL上清液至頂空瓶中進頂空-氣相色譜儀分析。

1.2.2 標準溶液配制

準確稱取2.5 g乙醇，用超純水定容至50 mL容量瓶中,搖勻即得質量濃度為50.0 g/L 乙醇標準儲備液，4 ℃冰箱中保存?zhèn)溆?。用超純水逐級稀釋標準儲備液，得到質量濃度梯度為0.5 g/L、1.0 g/L、2.5 g/L、5.0 g/L、10.0 g/L、15.0 g/L的標準工作溶液。

1.2.3 儀器條件

氣相色譜條件：色譜柱：DB-FFAP（30 m×0.25 mm×0.25 μm）；進樣口溫度160 ℃；載氣為氮氣；柱流量2 mL/min；分流比：80∶1；升溫程序：40 ℃，不保持，10 ℃/min 升溫至90 ℃，不保持，30 ℃/min 升溫至180 ℃，保持2 min；氫火焰離子化檢測器（FID）條件：溫度250 ℃；氮氣流量30 mL/min；空氣流量400 mL/min；尾吹氣流量25 mL/min。頂空（Agilent 7697A）進樣條件：加熱箱溫度45 ℃；傳輸線溫度110 ℃；定量環(huán)溫度80 ℃；平衡時間6 min；進樣持續(xù)時間0.5 min；樣品瓶振蕩頻率18次/min；樣品瓶填充壓力15 psi。

1.2.4 測量數據模型

酒醅樣品中乙醇含量按下列公式計算：

Y=(C×V)/M（1）

式中：Y——樣品中乙醇含量，g/kg；

C——測試溶液中質量濃度，g/L；

V——提取被測組分的超純水體積，mL；

M——樣品稱取量，g。

1.2.5 測量不確定度來源分析

根據《測量不確定度評定與表示》（JJF 1059.1—2012），從數學模型和試驗步驟分析，頂空氣相色譜法測定醬香型白酒酒醅中乙醇含量的不確定度主要來源：（1）乙醇標準儲備液配制；（2）乙醇標準溶液配制；（3）乙醇標準曲線擬合引入的不確定度；（4）樣品稱量引入的不確定度；（5）實驗回收率引入的不確定度；（6）酒醅樣品重復測定引入的不確定度。

圖1 頂空氣相色譜法測定醬香型白酒酒醅中乙醇含量的不確定度來源

2 結果與分析

2.1 標準儲備液配制引入的不確定度

2.1.1 乙醇標準物質純度引入的不確定度

2.1.2 標準物質稱量引入的不確定度

2.1.3 標準儲備液配制引入的不確定度

則合成得到乙醇標準儲備液配制產生的相對標準不確定度u(S)為：

2.2 乙醇標準溶液配制引入的不確定度

由1.2標準溶液配制方法可知，用1 mL和5 mL移液器移取0.5 mL、1.0 mL、2.0 mL、3.0 mL 儲備液于10 mL 容量瓶中并定容，可配得標準系列溶液為0.5 g/L、1.0 g/L、2.5 g/L、5.0 g/L、10.0 g/L、15.0 g/L。該部分使用的量器有移液器和容量瓶，測量不確定度由移液器和容量瓶引入。

乙醇標準系列溶液配制過程中一共用到1 mL移液器4 次，5 mL 移液器2 次，10 mL 容量瓶6 次，則相對標準不確定度u(V)為：

2.3 標準曲線擬合引入的不確定度

按照試驗方法，分別配制6 種不同質量濃度的標準系列溶液，使用頂空氣相色譜法進行測定，每個濃度3 個平行，得到乙醇標準物質峰面積（見表1），采用最小二乘法進行線性擬合，得到標準曲線（見圖2），建立線性回歸方程y=81.626x+1.1165，R2=0.999。取1 份酒醅樣品，進行3 次重復檢測，測定結果見表2。根據參考文獻，標準曲線擬合引入的不確定度按式（2）、式（3）計算，結果如表3所示。

圖2 乙醇標準工作曲線

表1 乙醇標準曲線數據

表2 酒醅樣品測定結果

表3 擬合標準曲線引入的不確定度分量

式中：a——標準曲線斜率；

p——樣品的測定次數，p=3；

n——標準系列溶液重復測定總次數，n=18；

S——標準曲線的標準偏差；

C——標準系列溶液的實測質量濃度，g/L。

2.4 樣品稱量時引入的相對不確定度

2.5 實驗回收率引入的不確定度

醬香型酒醅中70 %以上為高粱顆粒，樣品前處理過程未粉碎或未均質，使目標物提取可能不完全；酒醅樣品中富含有機酸、糖類物質、脂類物質等，提取液色澤深、基質復雜，檢測過程易存在基質效應。使用回收率可以判斷樣品提取效率以及是否存在基質效應等。平行稱取樣品3 份，加入乙醇標準品，按1.2 方法進行前處理后進頂空氣相色譜儀檢測。加標回收試驗結果見表4，則不確定度u(F)由下式計算。

表4 加標回收結果及不確定度

2.6 測量重復性引入的相對標準不確定度

表5 重復性試驗結果

2.7 合成標準不確定度評定

各個標準不確定度分量量值和貢獻度見表6。合成相對標準不確定度為：

表6 頂空氣相色譜法測定酒醅中乙醇的不確定度量值和貢獻度

2.8 擴展不確定度評定及結果表示

取包含概率95 %，包含因子k=2，則酒醅中乙醇含量測定的擴展不確定度為：

當酒醅中乙醇檢測結果為24.81 g/kg 時，不確定度表示為(24.81±1.24) g/kg，包含因子k=2，包含概率P=95%。

3 結論

通過對醬香型白酒酒醅中乙醇含量測定方法不確定度的評定，當檢測結果為24.81 g/kg 時，擴展不確定度為1.24 g/kg。通過此次評定，得出乙醇測量過程中各分量及其貢獻度為：標準溶液配制24 %，測量重復性20%，標準曲線擬合20 %，實驗回收率12 %，樣品稱量3 %，標準儲備液配制2%。標準溶液配制、測量重復性和標準曲線擬合是引入不確定度的主要因素。因此在測定酒醅中乙醇含量實驗過程中，要使用已檢定合格的移液槍和容量瓶，嚴格規(guī)范標準溶液系列配制操作，同時可增加平行樣品檢測次數、加強檢測人員技能培訓，旨在減少測量結果的不確定，保證結果的準確度。

圖3 各類不確定度分量的占比