circGFRA1靶向miR-138-5p調(diào)控宮頸癌SiHa細(xì)胞生物學(xué)行為*

湯雪齡， 劉 柳， 蔣沛月

浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬婦產(chǎn)科醫(yī)院婦產(chǎn)科，杭州 310003

宮頸癌(cervical cancer，CC)是發(fā)病率較高且死亡率較高的婦科惡性腫瘤，其發(fā)病率近年來(lái)呈增高及年輕化趨勢(shì)，嚴(yán)重威脅女性的生命安全。宮頸癌發(fā)生及發(fā)展過(guò)程涉及多基因、多因素，而宮頸癌轉(zhuǎn)移是導(dǎo)致患者治療效果降低及預(yù)后差的主要原因[1-2]。環(huán)狀RNA(circular RNA，circRNA)具有閉合環(huán)狀結(jié)構(gòu)，在轉(zhuǎn)錄水平、轉(zhuǎn)錄后水平上調(diào)控基因表達(dá)從而參與細(xì)胞生物學(xué)過(guò)程。circGFRA1是近年來(lái)研究比較多的一種circRNA。報(bào)道顯示，circGFRA1可通過(guò)調(diào)節(jié)微小RNA(microRNA，miRNA)表達(dá)，調(diào)節(jié)RNA結(jié)合蛋白與核轉(zhuǎn)錄參與或影響惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展，如circGFRA1在膠質(zhì)瘤細(xì)胞中表達(dá)水平升高，下調(diào)circGFRA1可促進(jìn)microRNA-99a表達(dá)并抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖和遷移。研究表明circRNA在宮頸癌中表達(dá)異常，并可參與宮頸癌發(fā)生及發(fā)展過(guò)程[3-5]。但circGFRA1對(duì)宮頸癌細(xì)胞生物學(xué)行為的影響及其可能作用機(jī)制報(bào)道較少。另外，miR-138-5p在宮頸癌細(xì)胞表達(dá)水平較低，提高其表達(dá)水平能夠抑制宮頸癌細(xì)胞增殖及轉(zhuǎn)移[6]。我們研究團(tuán)隊(duì)進(jìn)行的預(yù)實(shí)驗(yàn)顯示，circGFRA1與miR-138-5p存在靶向關(guān)系，但尚未有學(xué)者闡明circGFRA1/miR-138-5p分子軸在宮頸癌發(fā)生及發(fā)展過(guò)程中的具體機(jī)制。因此，本研究通過(guò)分析circGFRA1能否靶向調(diào)控miR-138-5p表達(dá)從而調(diào)節(jié)宮頸癌細(xì)胞生物學(xué)行為，為宮頸癌的防治提供參考，現(xiàn)將結(jié)果報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 臨床資料及實(shí)驗(yàn)試劑

選取2020年3月至2020年7月浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬婦產(chǎn)科醫(yī)院確診的宮頸癌患者共45例，取其癌組織及其癌旁組織(≥5 cm處的組織)標(biāo)本，癌組織均經(jīng)病理學(xué)診斷確診為宮頸癌?；颊吣挲g48～66歲，平均年齡(53.38±4.16)歲。組織標(biāo)本在術(shù)后轉(zhuǎn)移至-80℃超低溫冰箱保存。排除標(biāo)準(zhǔn)：合并其他惡性腫瘤患者；術(shù)前接受放療或化療患者。納入本研究患者均簽署知情同意書(shū)，且研究中收集的臨床資料及研究結(jié)果均采取保密措施，不做其他用途，本研究已獲浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

DMEM培養(yǎng)液、胎牛血清、胰蛋白酶、MTT試劑均購(gòu)自上海碧云天生物公司；Lipofectamine 2000購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司；Trizol試劑購(gòu)自美國(guó)Thermo Fisher公司；反轉(zhuǎn)錄與SYBR Green試劑盒購(gòu)自北京天根生化科技有限公司；si-NC、si-circGFRA1、anti-miR-NC、anti-miR-138-5p、miR-NC、miR-138-5p mimics均購(gòu)自廣州銳博生物科技有限公司；Transwell小室購(gòu)自美國(guó)Corning公司；Matrigel基質(zhì)膠購(gòu)自美國(guó)BD公司；RIPA裂解液、BCA蛋白定量檢測(cè)試劑盒均購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司；野生型載體wt-circGFRA1、突變型載體mut-circGFRA1及其活性檢測(cè)試劑盒均購(gòu)自美國(guó)Promega公司；兔抗人Bax、Bcl-2抗體與內(nèi)參GAPDH抗體均購(gòu)自美國(guó)Abcam公司。

1.2 細(xì)胞轉(zhuǎn)染及分組

將宮頸癌SiHa細(xì)胞放入含10%胎牛血清的DMEM完全培養(yǎng)液中，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。將SiHa細(xì)胞接種到6孔板，當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)融合達(dá)到70%時(shí)轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染方法：將不含胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液分別與si-NC、si-circGFRA1、anti-miR-NC、anti-miR-138-5p混合，室溫孵育5 min(A液)，將不含胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液與Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑充分混合(B液)，A液與B液充分混勻后室溫孵育20 min，按分組將混合液加入6孔板中，每孔200 μL，置于培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)6 h，棄培養(yǎng)液，更換為含有10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)48 h。實(shí)驗(yàn)分組：采用上述轉(zhuǎn)染方法將si-NC、si-circGFRA1分別轉(zhuǎn)染至SiHa細(xì)胞，分別記為si-NC組、si-circGFRA1組；將si-circGFRA1和anti-miR-NC轉(zhuǎn)染至SiHa細(xì)胞，記為si-circGFRA1+anti-miR-NC組；將si-circGFRA1和anti-miR-138-5p轉(zhuǎn)染至SiHa細(xì)胞，記為si-circGFRA1+anti-miR-138-5p組。

1.3 qRT-PCR檢測(cè)circGFRA1、miR-138-5p的表達(dá)水平

采用Trizol試劑提取宮頸癌組織、癌旁組織及SiHa細(xì)胞內(nèi)總RNA，應(yīng)用Nanodrop2000c超微量分光光度計(jì)檢測(cè)RNA濃度與純度。反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，并進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)，反應(yīng)體系：SYBR Green Master Mix 10 μL，正、反向引物各0.8 μL，cDNA 2 μL，ddH2O補(bǔ)足至20 μL。反應(yīng)條件：95℃ 5 min、95℃ 30 s、60℃ 30 s、7℃ 30 s，共循環(huán)40次。circGFRA1的內(nèi)參為GAPDH，miR-138-5p的內(nèi)參為U6，采用2-ΔΔCt法分別計(jì)算circGFRA1、miR-138-5p相對(duì)表達(dá)量。

1.4 雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)檢測(cè)circGFRA1與miR-138-5p的靶向關(guān)系

預(yù)測(cè)circGFRA1與miR-138-5p存在結(jié)合位點(diǎn)，將結(jié)合位點(diǎn)、突變位點(diǎn)克隆至pmirGLO載體，得到野生型載體wt-circGFRA1、突變型載體mut-circGFRA1，將miR-NC、miR-138-5p mimics分別與wt-circGFRA1、mut-circGFRA1共轉(zhuǎn)染至SiHa細(xì)胞，培養(yǎng)48 h后，收集轉(zhuǎn)染細(xì)胞，采用雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)試劑盒檢測(cè)熒光素酶活性。采用“1.2”方法將si-NC、si-circGFRA1分別轉(zhuǎn)染至SiHa細(xì)胞，培養(yǎng)48 h后，采用qRT-PCR法檢測(cè)細(xì)胞miR-138-5p相對(duì)表達(dá)量。

1.5 MTT檢測(cè)細(xì)胞增殖

收集各組SiHa細(xì)胞并接種于96孔板，1×103個(gè)/孔，每孔加20 μL MTT溶液，于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 h，4 h后丟棄培養(yǎng)液，加入二甲基亞砜(150 μL/孔)，采用酶標(biāo)儀檢測(cè)各孔吸光度(A)值，計(jì)算細(xì)胞增殖抑制率=[(對(duì)照組A值-實(shí)驗(yàn)組A值)/(對(duì)照組A值-空白組A值)×100%]。

1.6 平板克隆形成實(shí)驗(yàn)

將各組SiHa細(xì)胞接種于6孔板，500個(gè)/孔，接種后培養(yǎng)14 d，14 d后丟棄培養(yǎng)液，用PBS溶液沖洗，甲醇固定細(xì)胞20 min，結(jié)晶紫染色15 min，顯微鏡下觀察克隆形成數(shù)。

1.7 Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞遷移及侵襲

遷移實(shí)驗(yàn)：收集各組SiHa細(xì)胞加入小室的上室，1×105個(gè)/孔，下室加入500 μL培養(yǎng)液(20%胎牛血清)，進(jìn)行48 h培養(yǎng)，用多聚甲醛進(jìn)行固定20 min，固定完畢后采用PBS溶液沖洗，0.1%結(jié)晶紫染液染色10 min，顯微鏡下觀察細(xì)胞并計(jì)算穿過(guò)小室的細(xì)胞數(shù)。侵襲實(shí)驗(yàn)：將Matrigel基質(zhì)膠按一定比例稀釋后，每孔45 μL加入小室的上室，37℃凝固2 h，收集各組SiHa細(xì)胞加入小室的上室，1×105個(gè)/孔，后續(xù)實(shí)驗(yàn)步驟同遷移實(shí)驗(yàn)。

1.8 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡率

將各組SiHa細(xì)胞使用0.25%胰蛋白酶進(jìn)行細(xì)胞消化，3000 r/min離心6 min(離心半徑15 cm)，棄上清液，加入500 μL提前預(yù)冷的PBS緩沖液重懸細(xì)胞，再依次加入Annexin Ⅴ-FITC與PI各5 μL，混勻后靜置10 min，采用FACS Calibur流式細(xì)胞儀及Cellauest軟件檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況。

1.9 Western blot檢測(cè)Bax、Bcl-2蛋白表達(dá)量

采用RIPA裂解液提取SiHa細(xì)胞的總蛋白，BCA法測(cè)定其濃度。將40 μg蛋白進(jìn)行SDS-PAGE電泳，轉(zhuǎn)膜，用5%脫脂牛奶室溫封閉2 h，4℃加入按比例稀釋好的Bax、Bcl-2一抗與內(nèi)參GAPDH抗體，24 h后室溫加入二抗稀釋液，1 h后滴加ECL顯影，采用Image J軟件分析條帶灰度值，計(jì)算Bax、Bcl-2蛋白的相對(duì)表達(dá)。

1.10 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 circGFRA1、miR-138-5p在宮頸癌中的表達(dá)

與癌旁組織比較，宮頸癌組織中circGFRA1的表達(dá)量升高(P<0.05)，miR-138-5p的表達(dá)量降低(P<0.05)，見(jiàn)圖1。

A：宮頸癌中circGFRA1高表達(dá)；B：宮頸癌中miR-138-5p低表達(dá)；與癌旁組織比較，*P<0.05圖1 宮頸癌中circGFRA1、miR-138-5p表達(dá)的檢測(cè)Fig.1 Detection of circGFRA1 and miR-138-5p in cervical cancer tissues

2.2 circGFRA1靶向調(diào)控miR-138-5p

circGFRA1和miR-138-5p存在結(jié)合位點(diǎn)，見(jiàn)圖2A。miR-138-5p高表達(dá)對(duì)wt-circGFRA1的熒光素酶活性產(chǎn)生抑制作用(P<0.05)，對(duì)mut-circGFRA1熒光素酶活性無(wú)明顯影響，見(jiàn)圖2B。

與其在si-NC組的表達(dá)相比較，si-circGFRA1組miR-138-5p的表達(dá)量顯著升高(P<0.05)，見(jiàn)圖2C。

A：circGFRA1和miR-138-5p的互補(bǔ)序列；B：雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)；C：circGFRA1調(diào)控miR-138-5p的表達(dá)；與miR-NC組比較，*P<0.05；與si-NC組比較，#P<0.05圖2 circGFRA1靶向調(diào)控miR-138-5pFig.2 Targeted regulation of miR-138-5p by circGFRA1

2.3 circGFRA1和miR-138-5p對(duì)宮頸癌SiHa細(xì)胞增殖的影響

與si-NC組比較，si-circGFRA1組細(xì)胞增殖抑制率升高(P<0.05)，細(xì)胞克隆形成數(shù)減少(P<0.05)；與si-circGFRA1+anti-miR-NC組比較，si-circGFRA1+anti-miR-138-5p組細(xì)胞增殖抑制率降低(P<0.05)，細(xì)胞克隆形成數(shù)增多(P<0.05)，見(jiàn)圖3、表1。

圖3 circGFRA1和miR-138-5p對(duì)宮頸癌SiHa細(xì)胞克隆形成的影響Fig.3 Effect of circGFRA1 and miR-138-5p on the colony formation of SiHa cells

表1 circGFRA1和miR-138-5p對(duì)宮頸癌SiHa細(xì)胞增殖的影響Table 1 Effect of circGFRA1 and miR-138-5p on proliferation of SiHa

2.4 circGFRA1和miR-138-5p對(duì)宮頸癌SiHa細(xì)胞遷移、侵襲的影響

與si-NC組比較，si-circGFRA1組遷移及侵襲細(xì)胞數(shù)減少(均P<0.05)；與si-circGFRA1+anti-miR-NC組比較，si-circGFRA1+anti-miR-138-5p組遷移及侵襲細(xì)胞數(shù)增多(均P<0.05)，見(jiàn)圖4、表2。

圖4 circGFRA1和miR-138-5p對(duì)宮頸癌SiHa細(xì)胞遷移、侵襲的影響Fig.4 Effect of circGFRA1 and miR-138-5p on migration and invasion of SiHa cells

表2 circGFRA1和miR-138-5p對(duì)宮頸癌SiHa細(xì)胞遷移、侵襲的影響Table 2 Effect of circGFRA1 and miR-138-5p on migration and invasion of SiHa

2.5 circGFRA1和miR-138-5p對(duì)宮頸癌SiHa細(xì)胞凋亡的影響

與si-NC組比較，si-circGFRA1組細(xì)胞凋亡率和Bax蛋白水平升高(均P<0.05)，Bcl-2蛋白水平降低(P<0.05)；與si-circGFRA1+anti-miR-NC組比較，si-circGFRA1+anti-miR-138-5p組細(xì)胞凋亡率和Bax蛋白水平降低(均P<0.05)，Bcl-2蛋白水平升高(P<0.05)，見(jiàn)圖5、表3。

1：si-NC；2：si-circGFRA1；3：si-circGFRA1+anti-miR-NC；4：si-circGFRA1+anti-miR-138-5p；A：circGFRA1和miR-138-5p對(duì)宮頸癌SiHa細(xì)胞凋亡率的影響；B：circGFRA1和miR-138-5p對(duì)宮頸癌SiHa細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的檢測(cè)圖5 circGFRA1和miR-138-5p對(duì)宮頸癌SiHa細(xì)胞凋亡的影響Fig.5 Effect of circGFRA1 and miR-138-5p on apoptosis of SiHa cells

表3 circGFRA1和miR-138-5p對(duì)宮頸癌SiHa細(xì)胞凋亡的影響Table 3 Effect of circGFRA1 and miR-138-5p on apoptosis of SiHa

3 討論

circRNA作為一種新型的非編碼RNA，通過(guò)典型的3′，5′-磷酸二酯鍵具有穩(wěn)定的閉環(huán)結(jié)構(gòu)。雖然circRNA被認(rèn)為是RNA的異常剪接產(chǎn)物，但越來(lái)越多的證據(jù)表明circRNA參與各種生物學(xué)過(guò)程，例如circRNA可競(jìng)爭(zhēng)性地結(jié)合miRNA，從而參與多種惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展過(guò)程。circRNA具有多個(gè)miRNA的結(jié)合位點(diǎn)，即circRNA可通過(guò)調(diào)控多個(gè)miRNA調(diào)節(jié)多種惡性腫瘤細(xì)胞的生物學(xué)行為[7-9]。circGFRA1是最近發(fā)現(xiàn)的與多種惡性腫瘤相關(guān)的circRNA，并在多種惡性腫瘤中呈高表達(dá)，如circGFRA1在三陰性乳腺癌中表達(dá)上調(diào)，并可促進(jìn)三陰性乳腺癌細(xì)胞生長(zhǎng)及轉(zhuǎn)移，下調(diào)的circGFRA1可通過(guò)調(diào)節(jié)miR-361-5p表達(dá)抑制三陰性乳腺癌對(duì)紫杉醇的耐藥性[10-11]。研究顯示，circGFRA1在惡性肝細(xì)胞癌中表達(dá)水平顯著升高，并作為miR-149的海綿分子而促進(jìn)肝細(xì)胞癌細(xì)胞血管生成、細(xì)胞增殖及遷移[12]；circGFRA1在卵巢癌組織和細(xì)胞中表達(dá)水平升高，并可促進(jìn)卵巢癌細(xì)胞增殖[13]；還有研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，circGFRA1可充當(dāng)miR-188-3p的海綿分子而促進(jìn)非小細(xì)胞肺癌發(fā)展進(jìn)程[14]。本研究結(jié)果顯示，在宮頸癌組織中circGFRA1表達(dá)量升高，干擾circGFRA1表達(dá)可增加宮頸癌細(xì)胞抑制率，減少克隆數(shù)、遷移和侵襲細(xì)胞數(shù)，提示干擾circGFRA1可抑制宮頸癌細(xì)胞增殖、克隆形成、遷移及侵襲。Bcl-2與Bax定位于線粒體基質(zhì)中，當(dāng)細(xì)胞受到信號(hào)刺激后會(huì)轉(zhuǎn)移至線粒體外膜，Bax可通過(guò)增強(qiáng)線粒體外膜的通透性，此時(shí)跨膜電壓下降，線粒體中細(xì)胞色素等蛋白質(zhì)被釋放從而促進(jìn)細(xì)胞凋亡[15]。本研究結(jié)果顯示，干擾circGFRA1表達(dá)后宮頸癌細(xì)胞凋亡率和Bax蛋白水平升高，Bcl-2蛋白水平顯著降低，提示干擾circGFRA1表達(dá)可促進(jìn)宮頸癌細(xì)胞凋亡。類似的研究亦顯示，干擾circGFRA1表達(dá)可降低神經(jīng)膠質(zhì)瘤U251細(xì)胞的活力、集落形成、增殖和遷移潛力[5]。

miR-138在脊椎動(dòng)物中多為高度保守，miR-138-5p屬于miR-138家族成員，位于染色體Xq38.13，研究顯示，miR-138-5p不僅在帕金森病、椎間盤蛻變過(guò)程中發(fā)揮作用，在惡性腫瘤組織中也呈異常表達(dá)[16]。研究顯示，miR-138-5p在宮頸癌細(xì)胞中表達(dá)下調(diào)，過(guò)表達(dá)miR-138-5p可抑制宮頸癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲能力[17-18]。miR-138-5p通過(guò)靶向調(diào)控foxc1表達(dá)而有效抑制前列腺癌細(xì)胞生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移[19]。本研究結(jié)果顯示，宮頸癌組織和細(xì)胞中miR-138-5p的表達(dá)量降低，circGFRA1可靶向結(jié)合miR-138-5p，抑制miR-138-5p表達(dá)的同時(shí)還能逆轉(zhuǎn)干擾circGFRA1對(duì)宮頸癌細(xì)胞增殖、遷移、侵襲和凋亡的影響。通過(guò)雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)circGFRA1與miR-138-5p存在靶向關(guān)系。以上結(jié)果提示，一方面，circGFRA1可靶向結(jié)合miR-138-5p，影響宮頸癌發(fā)生發(fā)展，miR-138-5p有望成為宮頸癌診治的潛在標(biāo)記物；另一方面，circGFRA1可能作為宮頸癌治療的新的潛在重要靶點(diǎn)。

綜上所述，circGFRA1在宮頸癌高表達(dá)，干擾circGFRA1能抑制宮頸癌細(xì)胞增殖、克隆形成、遷移及侵襲，并對(duì)細(xì)胞凋亡具有促進(jìn)作用，可能與調(diào)控miR-138-5p有關(guān)，circGFRA1可能作為宮頸癌治療的潛在重要靶點(diǎn)，具體作用機(jī)制尚需進(jìn)一步探究。