免疫印跡法與間接免疫熒光法在副腫瘤性天皰瘡自身抗體檢測中的應(yīng)用)

張 燕 彭明霞 潘 萌

副腫瘤性天皰瘡(paraneoplastic pemphigus，PNP)是1990年被命名的一種罕見的累及皮膚黏膜的自身免疫性大皰性疾病，常伴發(fā)腫瘤，多為淋巴增生性腫瘤，可累及多個內(nèi)臟器官?；颊唧w內(nèi)存在多種自身抗體成分，可與多個器官或組織的上皮成分結(jié)合，如膀胱、呼吸道、小腸及大腸、甲狀腺、心肌及骨骼肌等[1]。PNP病情危重，死亡率高，因此，早期診斷、早期治療對提高患者的生存率尤為重要。目前，除了臨床表現(xiàn)和組織病理學(xué)檢查外，間接免疫熒光(indirect immunofluorescence，IIF)也是主要的臨床檢測手段，但一般用于自身免疫性大皰性皮膚病的IIF底物為猴食道上皮，由于其主要成分為復(fù)層鱗狀上皮，而非移行上皮，故檢出率較低。為進(jìn)一步提高檢出率，探索PNP的早期診斷手段，本研究采用以鼠膀胱和猴食道為底物的IIF和以人表皮提取物為抗原的免疫印跡(immunoblot，IB)檢測，對其在臨床診斷中的應(yīng)用進(jìn)行研究。

1 對象與方法

1.1 研究對象 收集2007年7月—2017年10月上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬瑞金醫(yī)院皮膚科病房收治的11例PNP患者資料，其中男4例、女7例；年齡范圍13～53歲，平均年齡為32歲；病程2～36個月，平均病程為9個月。所有患者均符合PNP的臨床和病理學(xué)診斷。所有患者均檢出腫瘤，其中7例伴有卡斯?fàn)柭?Castleman)瘤(2例卡斯?fàn)柭霭闉V泡樹突細(xì)胞增生)，2例伴有胸腺瘤，1例伴有纖維組織淋巴瘤，1例伴有起源于卡斯?fàn)柭〉牧馨徒Y(jié)濾泡樹突肉瘤。對照組選取同期本院健康體檢者4例，年齡、性別與PNP組相當(dāng)。

1.2 主要試劑和儀器

1.2.1 主要試劑 異硫氰酸熒光素(FITC)標(biāo)記的羊抗人IgG抗體(美國ThermoFisher Scientific公司)；BCA蛋白定量試劑盒(碧云天生物技術(shù)有限公司)；高分子量預(yù)染蛋白Marker(10帶，加拿大Fermentas公司)；辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的羊抗人IgG抗體(碧云天生物技術(shù)有限公司)；硝酸纖維素(nitrocellulose，NC)膜購自美國ThermoFisher Scientific公司。

1.2.2 主要儀器 熒光顯微鏡(德國Leica公司，型號為DM2500)；聚丙烯酰胺凝膠電泳系統(tǒng)(美國Bio-Rad，型號為165-8001、164-5050、170-3930)。

1.3 方法

1.3.1 血清樣本 收集11例PNP患者共15份血清(其中4例為術(shù)前和術(shù)后各2份血清)，其中6份為手術(shù)前患者的血清樣本，9份為手術(shù)切除腫瘤后1～6個月的患者血清樣本。對照組為4例正常人血清樣本。

1.3.2 IIF 分別以猴食道和鼠膀胱為底物，檢測患者血清中的PNP抗體，陽性者見表皮細(xì)胞間免疫球蛋白G(IgG)呈網(wǎng)狀沉積，顯示綠色熒光。

1.3.3 IB 取健康成人新鮮環(huán)切包皮，去除皮下組織，浸入表皮分離液中，4 ℃靜置48 h后剝離表皮，轉(zhuǎn)入500 μL RIPA蛋白裂解液，裂解30 min后，離心，收集上清液，用BCA法測定蛋白質(zhì)含量，作為人表皮細(xì)胞蛋白提取液。參照文獻(xiàn)[2]的方法，將上述得到的蛋白質(zhì)通過SDS-PAGE將人表皮細(xì)胞蛋白抗原按分子質(zhì)量大小分離，濕式轉(zhuǎn)膜將蛋白轉(zhuǎn)印至NC膜上，以β-actin作內(nèi)參照。以患者及對照組血清為一抗，以HRP標(biāo)記的羊抗人IgG抗體為二抗，用增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光法(ECL)檢測轉(zhuǎn)印膜上目的條帶的表達(dá)。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理 應(yīng)用SAS 9.2 統(tǒng)計學(xué)軟件。計數(shù)資料以頻數(shù)(n)表示，數(shù)據(jù)比較采用Fisher確切概率法檢驗(yàn)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 IIF檢測結(jié)果 11例PNP患者血清中，在鼠膀胱黏膜上皮細(xì)胞間有IgG型自身抗體表達(dá)且呈網(wǎng)狀沉積者6例，陽性血清中PNP抗體的滴度為1∶50～1∶100。見圖1。對照組血清未見在鼠膀胱黏膜上皮細(xì)胞間呈陽性表達(dá)。以猴食道為底物行IIF檢測，結(jié)果均呈陰性。

A IgG型自身抗體呈網(wǎng)狀沉積 B 4’,6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)核染色圖1 以鼠膀胱上皮為底物的IIF檢測熒光顯微鏡下陽性表現(xiàn)示意圖(×100)

2.2 IB檢測結(jié)果 11例PNP患者中，有7例患者的血清中檢測到特異性IgG型自身抗體，位于190 000 Da處，其中5例呈現(xiàn)出雙條帶，同時在210 000 Da處呈現(xiàn)陽性條帶。4例患者檢測了術(shù)前、術(shù)后2份血清，術(shù)前血清均在190 000 Da處呈現(xiàn)陽性條帶，其中2例患者的術(shù)后血清轉(zhuǎn)為陰性。對照組血清未呈現(xiàn)任何特異性條帶。見圖2。其他4例患者血清為陰性，其中3例患者血清采樣時已使用藥物治療3個月以上，且腫瘤已經(jīng)手術(shù)切除。

2.3 IIF和IB在PNP抗體檢測中的比較 11例PNP患者中，IIF檢出陽性6例，IB檢出陽性7例，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.31)。其中兩種檢測方法結(jié)果均呈陽性者5例；IB陽性，IF陰性者2例；IIF法陽性，IB陰性者1例。其他3例血清兩種方法檢測均為陰性。

3 討 論

PNP是一種嚴(yán)重危及生命的自身免疫性大皰性皮膚黏膜疾病，其免疫學(xué)特點(diǎn)為患者血清中存在Plakin家族的多克隆IgG抗體。針對的Plakin蛋白的抗原包括包斑蛋白EP(envoplakin，210 000)、周斑蛋白PP(periplakin，190 000)、橋斑蛋白(desmoplakin，DP)Ⅰ和Ⅱ(相對分子質(zhì)量分別為250 000、210 000)，其中最具特征性和一致性的為EP和PP，可作為PNP確診依據(jù)。近年來發(fā)現(xiàn)，PNP患者血清中存在抗-α2巨球蛋白樣1蛋白(alpha-2-macroglobulin-like-1，A2ML1)抗體。A2ML1是一種蛋白酶抑制劑，在表皮、甲狀腺及睪丸中均有表達(dá)。Numata等[3]發(fā)現(xiàn)，抗A2ML1抗體與PNP的早期發(fā)生有關(guān)，這為PNP早期篩查提供了思路。

本研究以正常人表皮提取物進(jìn)行IB分析，7例PNP患者血清檢測到與表皮分離抗原結(jié)合的IgG抗體，均與相對分子質(zhì)量為190 000的表皮抗原發(fā)生反應(yīng)，其中5例患者血清同時與相對分子質(zhì)量為210 000的表皮抗原發(fā)生反應(yīng)。與既往研究[3]結(jié)果不同，本研究未檢測到相對分子質(zhì)量為250 000的DPⅠ和170 000的A2ML1條帶。究其原因，可能是IB檢測過程中SDS-PAGE電泳使大分子降解，在結(jié)構(gòu)上破壞了敏感的抗原表位；也可能與表皮抗原提取過程及檢測抗體技術(shù)操作流程不同有關(guān)。最新研究[4]結(jié)果表明，當(dāng)前推薦的PNP血清學(xué)診斷技術(shù)檢測抗A2ML1抗體的靈敏度和特異度欠佳。利用基于綠色熒光蛋白的新型活性真核A2ML1 ELISA試劑盒進(jìn)行檢測，其靈敏度和特異度均較高[4]。另外，本試驗(yàn)分離正常表皮并提取抗原，進(jìn)行IB反應(yīng)，結(jié)果中陽性率較低，可能與患者經(jīng)過治療后自身抗體的滴度下降有關(guān)。

抽取PNP患者血清以鼠膀胱或人皮膚為底物進(jìn)行IIF檢測可見上皮細(xì)胞間熒光表達(dá)，提示患者血清中存在著可識別復(fù)層鱗狀上皮和移行上皮的循環(huán)抗體，此法診斷PNP具有較高的特異度和靈敏度[5]。本研究以鼠膀胱為底物，對11例患者血清進(jìn)行檢測，陽性率為 54.55%。而以猴食道上皮為底物時均未呈現(xiàn)陽性結(jié)果。這可能與PNP患者血清中的循環(huán)抗體與膀胱上皮結(jié)合的能力最強(qiáng)有關(guān)，因?yàn)榘螂资且菩猩掀ぃ瑑?nèi)含大量橋?；蚣?xì)胞內(nèi)物質(zhì)的成分[1]。本研究證明了鼠膀胱移行上皮是檢測PNP自身抗體的敏感底物，可作為PNP的過篩試驗(yàn)。

總之，IB檢測PNP患者血清可識別角質(zhì)形成細(xì)胞提取物中的EP(210 000)和PP(190 000)，從而確診PNP，但方法復(fù)雜。而以IIF檢測PNP患者血清，方法簡便易行，且靈敏度和特異度均較高，但因不同底物導(dǎo)致不同的結(jié)果，建議以鼠膀胱移行上皮為底物。所以，對那些有典型PNP臨床及病理學(xué)表現(xiàn)而尚未確診的自身免疫性大皰性皮膚病患者應(yīng)以鼠膀胱為底物行IIF檢測作為過篩試驗(yàn)，以及時發(fā)現(xiàn)潛在腫瘤。在條件允許的情況下行IB試驗(yàn)以確診。