跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白在膽汁淤積性藥物性肝損傷患者肝組織中表達(dá)特點(diǎn)及與病理形態(tài)的相關(guān)性

何曉燕，許 燦，何曉琳，郭立杰，張海叢，張向娥，葉立紅

(1. 石家莊市第二醫(yī)院，河北 石家莊 050056；2. 石家莊市第五醫(yī)院,河北 石家莊 050200)

藥物性肝損傷在臨床中是引起肝內(nèi)膽汁淤積的最常見(jiàn)原因。2015年《藥物性肝損傷診治指南》[1]將藥物性肝損傷分為膽管細(xì)胞損傷型、肝細(xì)胞損傷型、血管內(nèi)皮損傷型3種病理類型，其中膽管細(xì)胞損傷型主要表現(xiàn)為毛細(xì)膽管和(或)肝細(xì)胞淤膽，依據(jù)肝細(xì)胞壞死程度不同又可分為混合性肝炎(肝細(xì)胞壞死重)、淤膽性肝炎(肝細(xì)胞壞死輕)、單純性淤膽(無(wú)肝細(xì)胞壞死)。膽汁酸鹽輸出泵(BSEP)、多藥耐藥相關(guān)蛋白2(MRP2)、多藥耐藥糖蛋白3(MDR3)是肝細(xì)胞毛細(xì)膽管膜側(cè)上的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，在膽汁經(jīng)肝細(xì)胞分泌入毛細(xì)膽管過(guò)程中發(fā)揮著重要作用[2-3]，但三者在膽汁淤積性藥物性肝損傷各病理亞型中表達(dá)情況及與不同病理形態(tài)膽汁淤積之間是否存在相關(guān)性尚不明確。因此，本研究進(jìn)行了相關(guān)探討，現(xiàn)將結(jié)果報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1一般資料 選擇2015—2019年在石家莊市第二醫(yī)院及石家莊市第五醫(yī)院經(jīng)肝穿組織病理診斷為膽汁淤積性藥物性肝損傷的患者112例，患者均有明確用藥史，并排除膽管不全梗阻、原發(fā)性膽汁性膽管炎、原發(fā)性硬化性膽管炎、酒精性肝病、脂肪性肝炎、嗜肝及非嗜肝病毒感染及遺傳性膽汁淤積性肝病等。所有入選患者均簽署知情同意書(shū)，研究方案經(jīng)石家莊市第五醫(yī)院倫理委員會(huì)審批(SWY2020022)。

1.2研究方法 依據(jù)2015年《藥物性肝損傷診治指南》[1]中的病理分類將患者分為混合性肝炎組 40例、淤膽性肝炎組 40例、單純性淤積組32例。收集3組患者的一般資料(性別、年齡)及用藥種類，對(duì)比分析每例組織切片內(nèi)病理形態(tài)特征(毛細(xì)膽管膽栓、肝細(xì)胞淤膽、肝細(xì)胞羽毛樣變性、小膽管損傷、細(xì)膽管增生、匯管區(qū)炎癥、肝細(xì)胞壞死)及BSEP、MRP2、MDR3陽(yáng)性表達(dá)情況，分析BSEP、MRP2、MDR3積分光密度值與不同病理形態(tài)評(píng)分之間的相關(guān)性。

1.2.1肝組織病理觀察及半定量評(píng)分方法 取患者肝穿組織，常規(guī)進(jìn)行HE染色、網(wǎng)織+Masson染色、D-PAS、角蛋白7/角蛋白19免疫組化染色，OLYMPUS BX53顯微鏡下，由2名病理醫(yī)師共同觀察并進(jìn)行病理分型。根據(jù)相關(guān)指南及文獻(xiàn)[4]， 選取毛細(xì)膽管膽栓、肝細(xì)胞淤膽、肝細(xì)胞羽毛樣變性、小膽管損傷、細(xì)膽管增生、肝細(xì)胞壞死6項(xiàng)病理形態(tài)作為觀察指標(biāo)，對(duì)每項(xiàng)病理指標(biāo)根據(jù)病變程度進(jìn)行半定量評(píng)分。

1.2.2肝組織中轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白免疫組化檢測(cè)及半定量分析方法 肝穿標(biāo)本石蠟切片脫蠟至水，pH 7.2磷酸鹽緩沖液(PBS)漂洗5 min×3， pH 6.0枸櫞酸酸鹽緩沖液微波熱修復(fù)，高溫修復(fù)4 min，低溫修復(fù)6 min，自然冷卻，3% H2O2封閉內(nèi)源性過(guò)氧化物酶25 min，直接滴加適當(dāng)比例稀釋的一抗BSEP(ABCB11,鼠單克隆抗體,美國(guó)Santa Cruz公司，稀釋比例1∶500)、MRP2(ABCC2，兔單克隆抗體，美國(guó)Abcam公司，稀釋比例1∶3 000)、MDR3(ABCB4,兔多克隆抗體,美國(guó)Abcam公司，稀釋比例1∶600)，濕盒4 ℃冰箱過(guò)夜，取出放置至室溫，PBS漂洗5 min×3次，滴加酶標(biāo)山羊抗小鼠/兔IgG聚合物室溫孵育25 min，PBS漂洗5 min×3；滴加二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色液(北京中杉金橋試劑公司)；切片梯度脫水、封片。并設(shè)陰陽(yáng)性對(duì)照。 BSEP、MDR3、MRP2免疫組化染色以在肝細(xì)胞毛細(xì)膽管膜上出現(xiàn)棕黃色為陽(yáng)性表達(dá)，無(wú)著色為陰性表達(dá)。對(duì)所有免疫組化切片進(jìn)行全切片數(shù)字掃描，并經(jīng)Image-Pro Plus 6.0(IPP)圖像分析軟件進(jìn)行半定量分析，通過(guò)圖像分析軟件設(shè)定統(tǒng)一選色參數(shù)，選取組織切片內(nèi)除壞死區(qū)外全部區(qū)域進(jìn)行定量分析，計(jì)算BSEP、MRP2、MDR3積分光密度值。

2 結(jié) 果

2.1不同病理亞型組年齡及性別構(gòu)成情況 混合性肝炎組40例，男17例(42.5%)，女23例(57.5%)；年齡19～71(47.2±14.8)歲，其中1～20歲4例(男2例、女2例)，21～40歲14例(男8例、女6例)，41～60歲16例(男5例、女11例)，>60歲6例(男2例、女4例)。淤膽性肝炎組40例，男12例(30.0%)，女28例(70.0%)；年齡23～70(45.0±13.6)歲，其中1～20歲2例(男1例、女1例)，21～40歲15例(男7例、女8例)，41～60歲17例(男4例、女13例)，>60歲6例(均為女性)。單純性淤積組32例，男14例(43.8%)，女18例(56.2%)；年齡18～72(49.3±14.1)歲，其中1～20歲3例(男1例、女2例)，21～40歲9例(男5例、女4例)，41～60歲12例(男5例、女7例)，>60歲8例(男3例、女5例)。各病理亞型組患者總體年齡比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，<40歲患者中男女比例比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，≥40歲患者女性均顯著多于男性，并且均以40～60歲女性最為多見(jiàn)。

2.2不同病理亞型組引起損傷的藥物種類 有明確用藥史的112患者中共應(yīng)用了146種藥物，致病藥物中中藥(包括中藥湯劑及中成藥)最多見(jiàn)，共有62例(42.5%)，主要為治療骨關(guān)節(jié)病、椎間盤(pán)疾病、骨質(zhì)疏松、風(fēng)濕病、脫發(fā)、膽結(jié)石、皮膚病等藥物；淤膽性肝炎組中中藥應(yīng)用所占比例最高達(dá)65.0%(26例)，混合性肝炎組和單純性淤積組所占比例分別為40.0%(16例)和40.6%(13例)；引起膽汁淤積性藥物性肝損傷前兩位的西藥分別為抗生素類15例(10.27%)和解熱鎮(zhèn)痛藥14例(9.59%)，其他藥物包括心血管藥10例(6.85%)、抗過(guò)敏藥5例(3.42%)、消化系統(tǒng)用藥8例(5.48%)、激素類5例(3.42%)，保健品4例(2.74%)，化學(xué)接觸8例(5.48%)。

2.3不同病理亞型組病理形態(tài)學(xué)特點(diǎn) 混合性肝炎組表現(xiàn)為中或重度肝細(xì)胞炎癥壞死(包括融合性壞死、橋接性壞死及多腺泡壞死)，壞死區(qū)旁見(jiàn)毛細(xì)膽管膽栓及肝細(xì)胞淤膽(見(jiàn)圖1)，匯管區(qū)炎癥浸潤(rùn)明顯，伴或不伴小葉間膽管損傷；淤膽性肝炎組表現(xiàn)為輕度肝細(xì)胞炎癥壞死(包括點(diǎn)狀及灶狀壞死)，伴中央靜脈周圍毛細(xì)膽管膽栓和肝細(xì)胞淤膽(見(jiàn)圖2), 匯管區(qū)炎癥較明顯，伴或不伴小膽管小葉間損傷；單純性淤積組表現(xiàn)為中央靜脈周圍單純毛細(xì)膽管膽栓形成(見(jiàn)圖3)，無(wú)或極輕的肝細(xì)胞炎癥壞死，匯管區(qū)炎癥不明顯。

圖1 混合性肝炎組中央靜脈周圍融合性壞死及毛細(xì)膽管膽栓及肝細(xì)胞淤膽情況(HE，×200)

圖2 淤膽性肝炎組羽毛樣變性肝細(xì)胞及毛細(xì)膽管膽栓和肝細(xì)胞淤膽情況(HE，×200)

圖3 單純性淤積組中央靜脈周圍毛細(xì)膽管淤膽情況(HE，×200)

2.4不同病理亞型組病理形態(tài)評(píng)分比較 淤膽性肝炎組和單純性淤積組毛細(xì)膽管膽栓評(píng)分、肝細(xì)胞淤膽評(píng)分均高于混合性肝炎組，淤膽性肝炎組肝細(xì)胞羽毛樣變性評(píng)分高于單純性淤積組和混合性肝炎組，混合性肝炎組和淤膽性肝炎組小膽管損傷評(píng)分、細(xì)膽管增生評(píng)分均高于單純性淤積組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.05)。見(jiàn)表1。

表1 膽汁淤積性藥物性肝損傷不同病理亞型組間各項(xiàng)病理形態(tài)評(píng)分比較[Q2(Q1，Q3)，分]

2.5不同病理亞型組轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白表達(dá)情況 正常肝組織中BSEP、MRP2、MDR3在肝細(xì)胞毛細(xì)膽管膜側(cè)呈微管分支狀陽(yáng)性表達(dá)。各病理亞型組由于肝細(xì)胞炎癥壞死造成BSEP、MRP2、MDR3表達(dá)缺失，故壞死區(qū)不作為分析觀察區(qū)域。BSEP、MRP2、MDR3在各病理亞型組肝細(xì)胞毛細(xì)膽管膜側(cè)的表達(dá)變化趨勢(shì)較一致：羽毛樣變性肝細(xì)胞(肝細(xì)胞膽鹽淤積形成)較明顯區(qū)域陽(yáng)性表達(dá)均缺失，羽毛樣變性越明顯，陽(yáng)性表達(dá)減少越顯著，在肝細(xì)胞淤膽區(qū)及毛細(xì)膽管淤膽區(qū)沿?cái)U(kuò)張的毛細(xì)膽管壁亦呈表達(dá)缺失或弱陽(yáng)性表達(dá)，而在匯管區(qū)內(nèi)的小膽管及增生細(xì)膽管均未見(jiàn)BSEP、MRP2、MDR3陽(yáng)性表達(dá)。見(jiàn)圖4～6。

圖4 混合性肝炎組MDR3在壞死區(qū)旁毛細(xì)膽管淤膽及肝細(xì)胞淤膽腫脹區(qū)表達(dá)減弱或無(wú)表達(dá)(SP法，×200)

2.6不同病理亞型組間轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白積分光密度值與不同病理形態(tài)評(píng)分關(guān)系 混合性肝炎組、淤膽性肝炎組、單純性淤積組毛細(xì)膽管膽栓評(píng)分均與MDR3積分光密度值呈中等強(qiáng)度負(fù)相關(guān)性(r=-0.597，P=0.021；r=-0.670，P=0.019；r=-0.706，P=0.014)，肝細(xì)胞淤膽評(píng)分均與MRP2積分光密度值呈中等強(qiáng)度負(fù)相關(guān)性(r=-0.634，P=0.017；r=-0.786，P=0.013；r=-0.463，P=0.026)，羽毛樣變性評(píng)分均與BSEP積分光密度值呈中等強(qiáng)度負(fù)相關(guān)性(r=-0.793，P=0.012；r=-0.788，P=0.013；r=-0.544，P=0.026)，小膽管損傷評(píng)分、細(xì)膽管增生評(píng)分與BSEP、MRP2、MDR3積分光密度值均無(wú)相關(guān)性。見(jiàn)表2。

表2 膽汁淤積性藥物性肝損傷不同病理亞型組轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白積分光密度值與病理形態(tài)評(píng)分關(guān)系

圖5 淤膽性肝炎組BSEP在羽毛樣變性肝細(xì)胞膽管膜側(cè)表達(dá)缺失，毛細(xì)膽管淤膽區(qū)表達(dá)減弱或無(wú)表達(dá)(SP法，×400)

圖6 單純性淤積組MRP2在淤膽的肝細(xì)胞毛細(xì)膽管膜側(cè)表達(dá)減少或無(wú)表達(dá)(SP法，×400)

3 討 論

肝臟是藥物轉(zhuǎn)換及代謝的重要器官，易成為藥物毒性損傷的靶器官。任何原因引起的肝細(xì)胞和膽管細(xì)胞膽汁生成、分泌障礙以及膽汁流動(dòng)障礙均將導(dǎo)致膽汁淤積，故藥物性肝損傷中膽汁淤積型較常見(jiàn)[5]。相關(guān)研究報(bào)道，某些經(jīng)膽汁代謝轉(zhuǎn)化的藥物及其代謝產(chǎn)物可通過(guò)直接抑制肝細(xì)胞毛細(xì)膽管膜上的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白功能或下調(diào)其表達(dá)，從而抑制膽汁分泌及膽汁酸運(yùn)輸，導(dǎo)致膽汁淤積，引發(fā)高膽紅素血癥[6-7]。BSEP、MRP2、MDR3均為ATP結(jié)合盒超家族成員，其中BSEP可通過(guò)ATP的水解將膽汁酸鹽逆濃度梯度泵入毛細(xì)膽管,如果其發(fā)生基因突變，會(huì)影響蛋白功能，不能有效發(fā)揮作用，可使肝細(xì)胞內(nèi)膽汁酸蓄積，進(jìn)而損傷肝細(xì)胞[8]。MRP2是ATP依賴的有機(jī)陰離子重要轉(zhuǎn)運(yùn)體，主要負(fù)責(zé)轉(zhuǎn)運(yùn)膽紅素、多價(jià)有機(jī)陰離子等，也是唯一將結(jié)合膽紅素從肝細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)至毛細(xì)膽管內(nèi)的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白[9-10]。Kiguchi等[11]通過(guò)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，當(dāng)MRP2向胞漿轉(zhuǎn)運(yùn)及在肝細(xì)胞膽管膜定位減少時(shí)，將造成肝細(xì)胞毛細(xì)膽管膜上的膽汁酸鹽分泌障礙，從而引起肝內(nèi)膽汁淤積。MDR3為肝細(xì)胞膽管膜側(cè)的卵磷脂轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，負(fù)責(zé)磷脂的轉(zhuǎn)運(yùn)，其可將磷脂由具雙分子層結(jié)構(gòu)的肝細(xì)胞膜內(nèi)側(cè)轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞膜外，并與膽汁酸鹽等混合形成微粒，防止膽汁酸鹽損傷膽管上皮細(xì)胞；MDR3表達(dá)減少時(shí)會(huì)影響磷脂轉(zhuǎn)運(yùn)，使膽汁中的卵磷脂含量降低，進(jìn)而使膽汁中的膽汁酸鹽不易形成微膠顆粒，從而降低膽固醇的溶解度[12]，導(dǎo)致毛細(xì)膽管破壞損傷，并易于形成膽栓。

本研究膽汁淤積性藥物性肝損傷各亞型組患者年齡比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，均集中在40～60歲中老年人。Bolesterli等[13]研究認(rèn)為遺傳學(xué)線粒體異常增加了肝毒素的敏感性，可能和年齡相關(guān)，使高齡患者藥物性肝損傷的危險(xiǎn)度增加，此外與高齡人群更多患有基礎(chǔ)性疾病，藥物應(yīng)用劑量更大、種類更復(fù)雜有關(guān)。各亞型組不同年齡段性別構(gòu)成情況顯示，40歲以下患者男女比例差別不明顯，但40歲以上者均女性明顯多于男性，可能與女性生理?xiàng)l件下肝藥物代謝酶數(shù)量與活性低于男性，導(dǎo)致女性對(duì)某些藥物更敏感有關(guān)[14]。在本研究中，中藥及西藥所致膽汁淤積性藥物性肝損傷各約占一半，提示中藥引起的膽汁淤積性藥物性肝損傷不容忽視，要規(guī)范應(yīng)用，注意藥物的炮制及提純；西藥中解熱鎮(zhèn)痛藥及抗生素的應(yīng)用需引起關(guān)注，要定期監(jiān)測(cè)肝生化指標(biāo)。

本研究中發(fā)現(xiàn)，淤膽性肝炎組及混合性肝炎組病理形態(tài)表現(xiàn)為肝細(xì)胞不同程度的壞死脫失，淤膽肝細(xì)胞明顯腫脹、羽毛樣變性，毛細(xì)膽管膽栓形成，匯管區(qū)不同程度炎癥浸潤(rùn)，有的小膽管變性脫失；單純性淤積組病理形態(tài)特點(diǎn)較簡(jiǎn)單，肝實(shí)質(zhì)無(wú)或輕微肝細(xì)胞壞死，僅表現(xiàn)為小葉中央靜脈周圍單純毛細(xì)膽管淤膽，匯管區(qū)炎癥不明顯。同時(shí)，不同病理形態(tài)下轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的表達(dá)不同，在羽毛樣變性肝細(xì)胞(肝細(xì)胞膽鹽淤積形成)及腫脹變性較明顯區(qū)域，BESP無(wú)陽(yáng)性表達(dá)，且病變?cè)矫黠@，BSEP 陽(yáng)性表達(dá)越低，二者呈中等強(qiáng)度負(fù)相關(guān)，表明負(fù)責(zé)膽鹽代謝的BSEP功能障礙可引起肝細(xì)胞羽毛樣變性；不同病理亞型組中，肝細(xì)胞淤膽區(qū)MRP2均在擴(kuò)張的毛細(xì)膽管壁呈弱表達(dá)或表達(dá)缺失，肝細(xì)胞淤膽與MRP2表達(dá)呈中等強(qiáng)度負(fù)相關(guān)，進(jìn)一步證實(shí)MRP2是負(fù)責(zé)膽色素代謝的重要轉(zhuǎn)運(yùn)體，其功能障礙可引起肝細(xì)胞淤膽；不同病理亞型組中，毛細(xì)膽管淤膽區(qū)MDR3在擴(kuò)張的毛細(xì)膽管壁呈弱表達(dá)或表達(dá)缺失，毛細(xì)膽管淤膽均與MDR3表達(dá)呈中等強(qiáng)度負(fù)相關(guān)，證實(shí)MDR3功能障礙將減少卵磷脂轉(zhuǎn)運(yùn)，易于形成毛細(xì)膽管膽栓。上述結(jié)果提示，由于不同轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白表達(dá)的強(qiáng)弱不同，從而引起不同的病理形態(tài)特點(diǎn)，但是每種轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白在各病理亞型組的表達(dá)強(qiáng)弱較一致，提示藥物性肝損傷可同時(shí)損傷到肝細(xì)胞毛細(xì)膽管膜上的3種轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，不像遺傳性膽汁淤積性肝病為單純某一個(gè)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白表達(dá)異常。相關(guān)性分析還顯示，小膽管損傷及細(xì)膽管增生與BSEP、MRP2、MDR3無(wú)相關(guān)性，考慮匯管區(qū)內(nèi)小膽管損傷主要與匯管區(qū)內(nèi)炎癥程度相關(guān)，細(xì)膽管增生則與匯管區(qū)內(nèi)炎癥程度及小膽管損傷程度有關(guān)，進(jìn)而表明由于BSEP、MRP2、MDR3均為負(fù)責(zé)肝細(xì)胞膽汁排泌的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，并不影響匯管區(qū)內(nèi)小膽管及細(xì)膽管的損傷或增生。

綜上所述，藥物引起的膽汁淤積發(fā)生機(jī)制非常復(fù)雜，跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白BSEP、MRP2、MDR3表達(dá)異常是重要因素之一。了解轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白在膽汁淤積性藥物性肝損傷中的表達(dá)特點(diǎn)及與病理形態(tài)之間的對(duì)應(yīng)關(guān)系，可為解釋膽汁淤積及膽管損傷的形態(tài)特點(diǎn)提供依據(jù)，并有助于明確損傷位點(diǎn)，為臨床合理選擇治療藥物及判斷預(yù)后提供客觀依據(jù)。

利益沖突：所有作者均聲明不存在利益沖突。