骨炎膏對大鼠感染性創(chuàng)面TNF-α和IL-6表達(dá)的影響

陳 勤,馬文龍,陳 柯,謝 艷,曹向陽,田可為,范克杰,王慶豐

(1.河南省洛陽正骨醫(yī)院(河南省骨科醫(yī)院)，河南 洛陽 471000；2. 湖南中醫(yī)藥大學(xué)，湖南 長沙 410000)

嚴(yán)重創(chuàng)傷造成的急性皮膚軟組織缺損創(chuàng)面十分常見，此類創(chuàng)面常伴有細(xì)菌感染，金黃色葡萄球菌是最常見的致病菌[1]。對于感染創(chuàng)面，西醫(yī)除進(jìn)行傷口局部換藥及全身使用抗生素治療外，尚有多種治療方法，如VSD技術(shù)、臭氧、富血小板血漿、超聲清創(chuàng)技術(shù)、原位再生醫(yī)療技術(shù)等，以上治療方式雖在臨床應(yīng)用并取得一定療效，但也部分存在療效欠佳、費(fèi)用較高、手術(shù)創(chuàng)傷等不足。與西醫(yī)治療方法相比，中醫(yī)治療具有治療方法多樣、費(fèi)用低廉、無手術(shù)創(chuàng)傷、患者痛苦小等優(yōu)勢，其中膏、散外敷因其療效確切、安全性高、藥物易于存儲、藥效持久、操作簡便等優(yōu)勢在臨床運(yùn)用廣泛[2-3]。如生肌玉紅膏[4]、京萬紅軟膏、回陽生肌膏[5]等均具有去腐生肌、消腫止痛、活血解毒等功效，有促進(jìn)創(chuàng)面愈合的作用。骨炎膏是河南省洛陽正骨醫(yī)院(河南省骨科醫(yī)院)內(nèi)部外用制劑，可明顯促進(jìn)感染性創(chuàng)面愈合。本研究擬通過觀察骨炎膏對大鼠感染性創(chuàng)面組織中腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、白細(xì)胞介素-6(IL-6)表達(dá)的影響，探討其促進(jìn)感染性創(chuàng)面愈合的部分作用機(jī)制，以為臨床應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動物 生長狀況良好的SPF級成年健康SD大鼠72只，體重(210±10)g，購于河南省實(shí)驗(yàn)動物中心，合格證編號：SCXK(豫)2017-0001。全部于河南省洛陽正骨醫(yī)院動物實(shí)驗(yàn)室普通飼料喂養(yǎng)，飲用水為純凈自來水，飼養(yǎng)實(shí)驗(yàn)室溫度及濕度適中，環(huán)境清潔，適應(yīng)性喂養(yǎng)3 d后，將所有健康大鼠納入實(shí)驗(yàn)。

1.2實(shí)驗(yàn)用菌株及藥物 標(biāo)準(zhǔn)金黃色葡萄球菌、10%水合氯醛均由河南省洛陽正骨醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動物中心提供。骨炎膏(糊劑)由河南省洛陽正骨醫(yī)院內(nèi)部制劑科提供，豫藥制字Z20120264，主要成分：黃芪、土茯苓、當(dāng)歸、商陸、白芷、黃芩、連翹、紫草、紅花、大黃、虎杖、甘遂、大戟、龍骨。京萬紅軟膏(北京同仁堂生產(chǎn)，國藥準(zhǔn)字 212020440，主要成分為地榆、桃仁、紫草、當(dāng)歸、五倍子、地黃、黃連、冰片)。

1.3主要儀器 ELISA試劑盒(上海紀(jì)寧實(shí)業(yè)有限公司，批號：201510)、實(shí)驗(yàn)大鼠剃毛器(上海澤雅科教儀器有限公司 )、實(shí)驗(yàn)動物稱重器(上海玉研科學(xué)儀器有限公司)、電熱恒溫水槽(上海一恒科技儀器有限公司)、石蠟包埋機(jī)(湖北泰維科技實(shí)業(yè)有限公司)、恒溫?cái)偲酒瑱C(jī)(湖北泰維科技實(shí)業(yè)有限公司)、TC-120S 型組織脫水機(jī)(湖北泰維科技實(shí)業(yè)有限公司)、壓力蒸汽滅菌器(SANYO MLS-3780)、RD-201V型冷凍離心機(jī)(四川蜀科儀器有限公司)、LKB-NOVA型超薄切片機(jī)(以色列NOVA檢測設(shè)備公司)、Nikon-PFX型光學(xué)顯微鏡(日本尼康公司)、L-160DTP型萬分之一分析天平(梅特勒-托利多儀器有限公司)、Image圖像分析系統(tǒng)軟件(DMCII-Pro Plus6.0)。

1.4實(shí)驗(yàn)方法 隨機(jī)抽取18只大鼠作為正常創(chuàng)面組，剩余54只大鼠制作成金黃色葡萄球菌創(chuàng)面感染模型。正常創(chuàng)面制備方法：造模前禁食、禁水6 h,采用10%水合氯醛腹腔內(nèi)注射麻醉后，將大鼠左側(cè)臥位固定，充分暴露脊柱右側(cè)皮膚，用紅色記號筆描記脊柱右側(cè)3 cm×3 cm大小正方形的皮膚范圍，使用寵物剃毛器完全剔除大鼠背部描記范圍內(nèi)的體毛，用碘伏消毒手術(shù)部位，沿記號筆標(biāo)記的范圍進(jìn)行全層皮膚切除并破壞皮下淺筋膜直至肌層，創(chuàng)面充分止血后覆蓋無菌紗布包扎固定。感染創(chuàng)面制備方法：前期操作同正常創(chuàng)面制備方法，于創(chuàng)面充分止血后創(chuàng)面處接種含量為1×109CFU/mL金黃色葡萄球菌液1 mL，紗布包裹后使用醫(yī)用膠布粘貼牢固，第2天見創(chuàng)面附有膿性分泌物、滲液較多、創(chuàng)緣皮色發(fā)紅即為急性感染性創(chuàng)面造模成功。將感染性創(chuàng)面造模成功大鼠隨機(jī)分為感染創(chuàng)面組、骨炎膏組、京萬紅組，每組18只，分籠飼養(yǎng)。造模成功后第1天開始，助手配合固定大鼠，用剪刀剪開原有覆蓋膠布后輕柔揭開傷口覆蓋紗布，正常創(chuàng)面組及感染創(chuàng)面組大鼠創(chuàng)面予生理鹽水棉球擦拭后，直接用無菌紗布及醫(yī)用膠帶包扎固定；京萬紅軟膏組取適量京萬紅軟膏(約2 g)均勻涂抹于大鼠創(chuàng)面上，厚度適中，以完全覆蓋創(chuàng)面為宜，后予無菌紗布包裹后使用醫(yī)用膠布粘貼牢固；骨炎膏組將涂抹骨炎膏的無菌紗布(將骨炎膏攪拌均勻，取約5 g涂抹于無菌紗布上，厚度適中)覆蓋創(chuàng)面后，使用醫(yī)用膠布粘貼牢固。各組均每天換藥1次，直至創(chuàng)面完全愈合。

1.5檢測指標(biāo)及方法

1.5.1創(chuàng)面愈合率 分別測算并記錄各組大鼠造模后第3天、第7天、第14天創(chuàng)面愈合面積。用數(shù)碼相機(jī)對創(chuàng)面拍照，比對標(biāo)尺，采用計(jì)算機(jī)DMCII-image-Pro Plus6.0圖像分析系統(tǒng)軟件分析創(chuàng)面面積并進(jìn)行計(jì)算。第n天創(chuàng)面愈合率(%)=(原始創(chuàng)面面積-第n天創(chuàng)面面積)/原始創(chuàng)面面積×100%[6]。造模時大鼠創(chuàng)面面積即為原始創(chuàng)面面積。

1.5.2創(chuàng)面愈合時間 以肉眼觀察到的大鼠創(chuàng)面完全上皮化所需的時間為創(chuàng)面愈合時間。愈合標(biāo)準(zhǔn)：創(chuàng)面平齊，表皮爬行，創(chuàng)面未愈合距離<1 mm且大鼠生命體征良好。

1.5.3創(chuàng)面組織中TNF-α、IL-6含量 分別于造模后第3天及第7天每組隨機(jī)取6只大鼠、第14天取剩余大鼠，采用水合氯醛腹腔注射麻醉后處死，取創(chuàng)面邊緣至中心的創(chuàng)面組織約2 g，使用ELISA法檢測TNF-α、IL-6含量。

2 結(jié) 果

2.1實(shí)驗(yàn)大鼠情況 實(shí)驗(yàn)過程中，感染組及骨炎膏組各死亡1只，考慮為創(chuàng)面較大、無法耐受感染導(dǎo)致。

2.2創(chuàng)面愈合率比較 造模后第3天、第7天、第14天，感染創(chuàng)面組、骨炎膏組、京萬紅組創(chuàng)面愈合率均明顯低于正常創(chuàng)面組(P均<0.05)；感染創(chuàng)面組、骨炎膏組、京萬紅組造模后第3天創(chuàng)面愈合率比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)；骨炎膏組和京萬紅組造模后第7天、第14天創(chuàng)面愈合率均明顯高于感染創(chuàng)面組(P均<0.05)，且骨炎膏組均明顯高于京萬紅組(P均<0.05)。見表1。

表1 正常創(chuàng)面組和感染創(chuàng)面各組大鼠各時間點(diǎn)創(chuàng)面愈合率比較

2.3創(chuàng)面愈合時間比較 感染創(chuàng)面組、骨炎膏組、京萬紅組、正常創(chuàng)面組創(chuàng)面愈合時間分別為(22.4±0.9)d、(18.3±1.1)d、(20.5±0.6)d、(15.6±0.9)d，正常創(chuàng)面組創(chuàng)面愈合時間均明顯短于其他組(P均<0.05)，骨炎膏組和京萬紅組大鼠創(chuàng)面時間均明顯短于感染創(chuàng)面組(P均<0.05)，且骨炎膏組明顯短于京萬紅組(P<0.05)。

2.4各時間點(diǎn)創(chuàng)面組織中TNF-α、IL-6含量比較 造模后第3天、第7天、第14天，各組大鼠創(chuàng)面組織中TNF-α、IL-6含量均呈逐步下降趨勢，但感染創(chuàng)面組、骨炎膏組及京萬紅組大鼠創(chuàng)面組織中TNF-α、IL-6含量均明顯高于正常創(chuàng)面組(P均<0.05)；造模后第3天，骨炎膏組及京萬紅組大鼠創(chuàng)面組織中TNF-α含量均明顯低于感染創(chuàng)面組(P均<0.05)，IL-6含量與感染創(chuàng)面組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；造模后第7天、第14天，骨炎膏組及京萬紅組大鼠創(chuàng)面組織中TNF-α、IL-6含量均明顯低于感染創(chuàng)面組(P均<0.05)，且骨炎膏組均明顯低于京萬紅組(P均<0.05)。見表2。

表2 正常創(chuàng)面組和感染創(chuàng)面各組大鼠各時間點(diǎn)創(chuàng)面組織中TNF-α、IL-6含量比較

3 討 論

細(xì)菌、創(chuàng)傷或機(jī)體自身的錯誤免疫反應(yīng)發(fā)生都會觸發(fā)炎癥反應(yīng)。炎癥反應(yīng)是通過清除異物以改善傷口環(huán)境從而加速愈合的過程，其發(fā)生是由于炎性趨化因子激活，受到損傷的細(xì)胞通過結(jié)合選擇性受體后釋放趨化因子，激活巨噬細(xì)胞和嗜中性粒細(xì)胞釋放炎性細(xì)胞因子如IL-6和TNF-α，這些炎性因子通過與它們各自的受體相互作用而致[7-8]。IL-6細(xì)胞因子家族包括IL-6、IL-11、IL-27、IL-31、制抑素M、白血病抑制因子、睫狀神經(jīng)營養(yǎng)因子、心肌營養(yǎng)因子1和心肌營養(yǎng)因子樣細(xì)胞因子1，它們在細(xì)胞增殖、存活、遷移、侵襲和炎癥過程中起關(guān)鍵作用[9]。IL-6主要由淋巴細(xì)胞、骨髓細(xì)胞、成纖維細(xì)胞和上皮細(xì)胞產(chǎn)生，其是一種多功能的NF-κB調(diào)節(jié)細(xì)胞因子，可以作用于上皮細(xì)胞和免疫細(xì)胞。內(nèi)毒素和白細(xì)胞介素-1β(IL-1β)可刺激淋巴樣細(xì)胞產(chǎn)生IL-6，IFN-γ可以協(xié)同IL-1β增加IL-6產(chǎn)生，TGF-β和環(huán)磷酸腺苷(cAMP)可以促進(jìn)IL-6分泌。IL-6作為關(guān)鍵的促炎因子，在多項(xiàng)炎癥相關(guān)的研究中被作為觀察指標(biāo)，如腸道傷口愈合等[10-11]。TNF-α主要由活化的巨噬細(xì)胞和T淋巴細(xì)胞合成，其他細(xì)胞如肥大細(xì)胞、B淋巴細(xì)胞、自然殺傷細(xì)胞、嗜中性粒細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、腸上皮細(xì)胞、平滑肌和心肌細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、破骨細(xì)胞也可產(chǎn)生TNF-α[12]。身體健康的情況下，TNF-α幾乎檢測不到，但在炎癥和感染條件下，機(jī)體血清和組織中TNF-α表達(dá)皆會升高，其升高的水平與感染的嚴(yán)重程度相關(guān)[11]。 因此，TNF-α是炎癥的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，其相關(guān)的疾病包括感染性創(chuàng)面牛皮癬、類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎和潰瘍性結(jié)腸炎[13]。故本研究選取了具有代表性的炎癥因子IL-6和TNF-α來作為炎癥指標(biāo)進(jìn)行觀測。

感染性創(chuàng)面在中醫(yī)屬“瘡瘍”范疇，多由外傷兼染毒而成，典型表現(xiàn)為局部紅腫熱痛及潰后流膿，屬于典型的陽證瘡瘍[14]。根據(jù)中醫(yī)學(xué)觀點(diǎn),陽證瘡瘍一般由火毒、熱毒引起,內(nèi)郁熱毒以及外感邪毒使經(jīng)絡(luò)阻塞、氣血不暢,氣血不能養(yǎng)膚則腐肉漸生，瘡瘍遷延日久還可導(dǎo)致全身經(jīng)脈受損，究其根源實(shí)為正氣虛損，邪氣入侵。中醫(yī)“整體觀念”認(rèn)為，對感染性創(chuàng)面的治療并不應(yīng)只局限于局部的損傷，還應(yīng)當(dāng)著眼于全身的整體治療，正如《外科理例》中所言“生肌之法，當(dāng)先理脾胃，助氣血為主，則肌肉自生”。對于瘡瘍的分期，古代醫(yī)家多采用正邪盛衰的辨證方法來判斷。瘡瘍初期，正氣尚強(qiáng)，正能勝邪，則瘡瘍限于局部無法蔓延，或瘡瘍漸為消散無法發(fā)展。若正邪相爭，則腫勢漸盛，熱毒與腐肉相互影響而成膿毒積于其中，為成膿期，此時應(yīng)消腫排膿，或直接切開引流，或使用散瘀排膿之類藥物治療。瘡瘍遷延不愈至后期，為潰瘍期，若正氣尚可，則潰瘍脫落而新肉始生；若正氣衰微無力鼓動祛除腐肉生肌而愈，則瘡瘍?nèi)站脽o法痊愈，最終變?yōu)槿硐男约膊。藭r，正虛為本，邪勝為標(biāo)，應(yīng)主要使用扶正治法，兼以活血化瘀、祛腐解毒[14]。

骨炎膏方以黃芪、土茯苓為君，當(dāng)歸、商陸、白芷、黃芩、連翹、紫草、紅花、大黃、虎杖為臣，甘遂、大戟、龍骨為佐。全方具有清熱解毒、祛瘀拔毒、生肌收口、滋潤肌膚之功效，不但可改善局部微循環(huán)，緩解創(chuàng)面疼痛，減輕腫脹，還可保持濕性環(huán)境和促進(jìn)感染性創(chuàng)面愈合，且其臨床操作簡便。陳紅干等[15]將骨炎膏方應(yīng)用于全髖關(guān)節(jié)置換、股骨干骨折內(nèi)固定及脛腓骨骨折內(nèi)固定等清潔傷口術(shù)后早期感染的治療，結(jié)果顯示傷口均一期愈合，且無后遺癥。王新江等[16]將骨炎膏用于治療手指感染患者,治療有效率為87.5%。

本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果顯示，在感染性創(chuàng)面愈合的中期及后期，骨炎膏及京萬紅軟膏均能促進(jìn)創(chuàng)面加速愈合，骨炎膏促愈作用優(yōu)于京萬紅軟膏。炎癥因子的觀察顯示，在創(chuàng)面愈合過程中，與正常創(chuàng)面比較，感染創(chuàng)面中 TNF-α、IL-6含量均更高；骨炎膏組及京萬紅組干預(yù)后第7天及第14天，創(chuàng)面組織中TNF-α、IL-6含量均明顯低于感染創(chuàng)面組，且骨炎膏組TNF-α、IL-6含量明顯低于京萬紅組。提示促炎因子高表達(dá)是感染性創(chuàng)面愈合遲緩的原因之一，骨炎膏外敷可能通過下調(diào)炎癥介質(zhì)的表達(dá)，改善炎癥環(huán)境及控制炎癥反應(yīng)，進(jìn)而促進(jìn)感染創(chuàng)面愈合。

利益沖突：所有作者均聲明不存在利益沖突。