解郁止痛方對(duì)偏頭痛抑郁共病大鼠行為學(xué)及腦組織腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子表達(dá)的影響

馮思娜，舒星星，張 慧

(1. 陜西中醫(yī)藥大學(xué)，陜西 咸陽 712046；2. 陜西中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院，陜西 咸陽 712000)

偏頭痛是以反復(fù)發(fā)作的搏動(dòng)樣劇烈頭痛為主要臨床表現(xiàn)的神經(jīng)血管疾病，并伴有惡心、嘔吐等自主神經(jīng)系統(tǒng)功能障礙的癥狀[1]。隨著病情進(jìn)展，偏頭痛常反復(fù)發(fā)作，遷延難愈，逐漸轉(zhuǎn)歸為慢性偏頭痛，其發(fā)生與抑郁等負(fù)性情緒相關(guān)[2]。流行病學(xué)研究顯示，在偏頭痛患者中抑郁癥的患病率為41%～47%[3]，二者常相互影響、相互轉(zhuǎn)化。偏頭痛與抑郁癥之間的高共病率提示兩者之間可能具有相同的分子、環(huán)路機(jī)制，以及受到相同核團(tuán)的調(diào)控[4]。影像學(xué)數(shù)據(jù)顯示，前額葉皮質(zhì)[5-6]、海馬[7]、杏仁核[8]等在偏頭痛患者和抑郁癥患者中均發(fā)生明顯改變。目前，對(duì)偏頭痛抑郁共病缺乏正確的認(rèn)識(shí)，對(duì)其發(fā)病機(jī)制了解匱乏。現(xiàn)有的偏頭痛診療指南中對(duì)偏頭痛抑郁共病并無公認(rèn)的、有效的措施[9]，臨床上多采用疊加方法治療，不良反應(yīng)大，效果不理想。重視偏頭痛抑郁共病，尋找針對(duì)二者共同作用靶點(diǎn)的藥物可能是偏頭痛治療并防治其慢性化、改善預(yù)后及生活狀態(tài)、保證家庭社會(huì)勞動(dòng)力的關(guān)鍵點(diǎn)及突破口。中醫(yī)藥治療以辨證論治為特色，結(jié)合中藥多靶點(diǎn)作用機(jī)制，對(duì)治療偏頭痛抑郁共病有獨(dú)特優(yōu)勢(shì)，可減少西藥用量,減輕不良反應(yīng),提高患者的生活質(zhì)量[10-11]。解郁止痛方為導(dǎo)師總結(jié)的臨床經(jīng)驗(yàn)方，可行氣活血、解郁止痛，治療偏頭痛抑郁共病療效滿意，但其機(jī)制尚不明確。相關(guān)基礎(chǔ)研究顯示，偏頭痛抑郁共病模型大鼠血清、額葉皮質(zhì)、海馬中的腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(BDNF)顯著降低，而杏仁核中的BDNF顯著升高[12-13]。為了探索額葉皮質(zhì)、海馬與杏仁核在偏頭痛抑郁共病中的不同作用機(jī)制，并更深層次探討解郁止痛方有效改善偏頭痛抑郁共病患者臨床癥狀的分子機(jī)制，為臨床提供有效理論依據(jù)，故進(jìn)行了本次實(shí)驗(yàn)研究。

1 實(shí)驗(yàn)材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SPF級(jí)雄性SD大鼠48只，體重(200±15)g，北京斯貝福生物技術(shù)有限公司提供，動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK(京)2019-0010，動(dòng)物使用許可證號(hào)：SYXK(陜)2021-0008。所有大鼠均飼養(yǎng)于陜西中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，實(shí)驗(yàn)室溫度維持在(22±2)℃，濕度維持在(50±10)%，噪聲<60 dB，12 h光/暗循環(huán)，自由攝食、攝水。所有操作均符合動(dòng)物處置倫理。

1.2藥物與試劑 解郁止痛方(川芎12 g、柴胡10 g、合歡皮10 g、全蝎6 g、黃芪10 g)由陜西中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院中藥房提供；硝酸甘油注射液(北京益民藥業(yè)有限公司，國(guó)藥準(zhǔn)字H11020289，規(guī)格：5 mg/mL)；尼莫地平片(亞寶藥業(yè)集團(tuán)股份有限公司，國(guó)藥準(zhǔn)字H14022821，規(guī)格：20 mg/片)；多聚甲醛(博士德生物，批號(hào)：14J26068)；BDNF ELISA 試劑盒(博士德生物，產(chǎn)品批號(hào)：EK0308)。

1.3主要儀器 電子天平(上海民橋公司)，電子VonFrey測(cè)痛儀(美國(guó)ITLife Science公司2390系列)，冰凍離心機(jī)(EPPendrof 公司)，純水儀(重慶艾科浦公司)，酶標(biāo)儀(芬蘭Labsystems公司，型號(hào)：MK3) 。

1.4實(shí)驗(yàn)方法 實(shí)驗(yàn)大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周，經(jīng)行為學(xué)測(cè)試后按照隨機(jī)數(shù)字表法分為空白組、模型組、尼莫地平組、解郁止痛方高劑量組、解郁止痛方中劑量組、解郁止痛方低劑量組，每組8只。除空白組外，其余組均復(fù)制偏頭痛抑郁共病模型。制備方法：在實(shí)驗(yàn)第1，7，14，21天于大鼠的頸背部皮下注射經(jīng)生理鹽水稀釋后的硝酸甘油注射液10 mg/kg(硝酸甘油注射液5.0 mg/mL)誘發(fā)偏頭痛發(fā)作，20 min后，大鼠可表現(xiàn)出異常行為變化，如耳部發(fā)紅、躁動(dòng)、前肢搔頭動(dòng)作頻繁和攀籠次數(shù)增多。偏頭痛模型復(fù)制后當(dāng)天，各組大鼠進(jìn)行慢性不可預(yù)測(cè)的刺激，包括7種刺激類型，每種刺激重復(fù)2～3次，相同條件刺激不可連續(xù)發(fā)生，使大鼠不能預(yù)測(cè)所接受的刺激。①夾尾：使用夾取力度相同且適中的鼠尾夾，在距大鼠尾巴根部1 cm處夾緊，時(shí)間2 min。 ②冰水游泳：準(zhǔn)備裝4 ℃冷水、水深15 cm的水桶，放入大鼠5 min后取出，期間保證大鼠的足尖可以碰到水桶的底部。③濕籠：在籠子里灑100 mL水，持續(xù)24 h。 ④禁食、禁水：禁食、禁水24 h。 ⑤晃籠：200 Hz 5 min。⑥晝夜反轉(zhuǎn)：8：00—20：00，在確保通風(fēng)的前提下，用不透明的罩布覆蓋大鼠，20：00—次日8：00取下罩布，打開燈保持明亮的光照環(huán)境。⑦電擊足底：0.9 mA，15 s×4次。實(shí)驗(yàn)期間，空白組和模型組大鼠正常進(jìn)食進(jìn)水，每天予以純水灌胃；尼莫地平組予以尼莫地平混懸液6 mg/kg灌胃，解郁止痛方高、中、低劑量組分別給予解郁止痛方10 g/kg、5 g/kg、2.5 g/kg (生藥)灌胃，均1次/d，連續(xù)灌胃21 d。

1.5檢測(cè)指標(biāo)與方法

1.5.1機(jī)械痛閾測(cè)定 實(shí)驗(yàn)第1，7，14，21天造模前行機(jī)械痛閾值測(cè)定。將大鼠放置于底部具有網(wǎng)狀金屬孔格的透明測(cè)試籠中，在測(cè)試前預(yù)留15 min適應(yīng)時(shí)間,使大鼠放松并保持相對(duì)靜止。使用不同折力的Von Frey細(xì)絲刺激大鼠后爪的足底表面，引起爪子縮回的最小細(xì)絲被認(rèn)為是閾值。每只動(dòng)物測(cè)試3次，每次間隔時(shí)間為5 min，3次測(cè)試結(jié)果取平均值。

1.5.2行為學(xué)評(píng)分 實(shí)驗(yàn)第1天造模前及實(shí)驗(yàn)第10,21天進(jìn)行以下實(shí)驗(yàn)。

1.5.2.1糖水消耗實(shí)驗(yàn) 實(shí)驗(yàn)前先對(duì)各組大鼠進(jìn)行糖水?dāng)z入適應(yīng)性訓(xùn)練，每籠放裝有1%蔗糖水500 mL的2個(gè)水瓶。24 h后，同時(shí)給2個(gè)水瓶各裝1%蔗糖水500 mL、純水500 mL。24 h后，取走水瓶，記錄大鼠的液體攝入量、糖水?dāng)z入量、純水?dāng)z入量，計(jì)算糖水偏好百分率。糖水偏好百分率=糖水?dāng)z入量/總液體攝入量×100%。

1.5.2.2強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn) 將大鼠置于水溫(24±1)℃、水深40 cm的圓桶(桶高50 cm、直徑20 cm)中，強(qiáng)迫游泳10 min，記錄大鼠的不動(dòng)時(shí)間。大鼠在水中處于被動(dòng)漂浮，同時(shí)停止掙扎3 s以上為不動(dòng)狀態(tài)。

1.5.2.3新奇抑制攝食實(shí)驗(yàn) 分別將大鼠放于50 cm×36 cm的盒子中，測(cè)試前1 d大鼠禁食、不禁水，在盒子中央放置大小相似的食丸，從敞箱的一個(gè)角放入大鼠，記錄大鼠第一次咬食丸時(shí)間，即攝食的潛伏期。

1.5.3血清及額葉皮質(zhì)、海馬、杏仁核組織中BDNF含量 各項(xiàng)實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，麻醉大鼠,心臟采血約3 mL，室溫凝固30 min，1 500×g離心15 min，收集血清，分裝后-80 ℃冷凍保存。斷頭取腦，分別提取大鼠的額葉皮質(zhì)、海馬及杏仁核，稱重后放置1.5 mL離心管中，10 mg組織加入100 μL蛋白裂解液(每1 mL裂解液加入10 μL PMSF)，放置在冰上。將裂解后的樣品(10 000～14 000)×g離心3～5 min，取上清液至新1.5 mL離心管，切勿吸取沉淀，蛋白樣品放入-80 ℃凍存。BDNF濃度測(cè)定均嚴(yán)格按照ELISA試劑盒說明執(zhí)行。

2 結(jié) 果

2.1各組大鼠機(jī)械痛閾值比較 實(shí)驗(yàn)第1天造模前，各組大鼠機(jī)械痛閾值比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)。實(shí)驗(yàn)第7，14，21天造模前，模型組大鼠機(jī)械痛閾值均明顯低于空白組(P均<0.05)，且隨著病程的進(jìn)展，機(jī)械痛閾值逐漸降低；與模型組比較，尼莫地平組及解郁止痛方各組大鼠機(jī)械痛閾值均明顯升高(P均<0.05)。見表1。

表1 空白組及偏頭痛抑郁共病各組大鼠后爪機(jī)械痛閾值比較

2.2各組大鼠糖水偏好百分率比較 實(shí)驗(yàn)第1天造模前，各組大鼠糖水偏好百分率比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)。實(shí)驗(yàn)第10，21天，模型組大鼠糖水偏好百分率均明顯低于空白組(P<0.05)；尼莫地平組及解郁止痛方各組大鼠糖水偏好百分率均明顯高于模型組(P均<0.05)。見表2。

表2 空白組及偏頭痛抑郁共病各組大鼠糖水偏好百分率比較

2.3各組大鼠強(qiáng)迫游泳不動(dòng)時(shí)間比較 實(shí)驗(yàn)第1天造模前，各組大鼠強(qiáng)迫游泳不動(dòng)時(shí)間比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)。實(shí)驗(yàn)第10天，模型組大鼠強(qiáng)迫游泳不動(dòng)時(shí)間明顯長(zhǎng)于空白組(P<0.05)；尼莫地平組及解郁止痛方各組大鼠強(qiáng)迫游泳不動(dòng)時(shí)間均明顯短于模型組(P均<0.05)，解郁止痛方中劑量組降低最為明顯。實(shí)驗(yàn)第21天，模型組大鼠強(qiáng)迫游泳不動(dòng)時(shí)間明顯長(zhǎng)于空白組(P<0.05)；尼莫地平組及解郁止痛方中、高劑量組大鼠強(qiáng)迫游泳不動(dòng)時(shí)間均明顯短于模型組(P均<0.05)，解郁止痛方低劑量組與模型組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表3。

表3 空白組及偏頭痛抑郁共病各組大鼠強(qiáng)迫游泳不動(dòng)時(shí)間比較

2.4各組大鼠新奇抑制攝食潛伏時(shí)間比較 實(shí)驗(yàn)第1天造模前，各組大鼠新奇抑制攝食潛伏時(shí)間比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)。實(shí)驗(yàn)第10天，模型組大鼠新奇抑制攝食潛伏時(shí)間明顯長(zhǎng)于空白組(P<0.05)；解郁止痛方中劑量組大鼠新奇抑制攝食潛伏時(shí)間明顯短于模型組(P<0.05)；尼莫地平組及解郁止痛方低、高劑量組大鼠新奇抑制攝食潛伏時(shí)間有縮短趨勢(shì)，但與模型組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)。實(shí)驗(yàn)第21天，模型組大鼠新奇抑制攝食潛伏時(shí)間明顯長(zhǎng)于空白組(P<0.05)；尼莫地平組及解郁止痛方中劑量組大鼠新奇抑制攝食潛伏時(shí)間均明顯短于模型組(P均<0.05)，而解郁止痛方低、高劑量組與模型組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)。見表4。

表4 空白組及偏頭痛抑郁共病各組大鼠新奇抑制攝食潛伏時(shí)間比較

2.5各組大鼠血清及額葉皮質(zhì)、海馬、杏仁核組織中BDNF含量比較 實(shí)驗(yàn)第21天干預(yù)結(jié)束后，模型組大鼠血清及額葉皮質(zhì)、海馬組織中BDNF含量均明顯低于空白組(P均<0.05)，杏仁核組織中BDNF含量明顯高于空白組(P<0.05)。尼莫地平組、解郁止痛方中劑量組大鼠血清、額葉皮質(zhì)、海馬組織中BDNF含量及解郁止痛方低劑量組大鼠血清中BDNF含量均明顯高于模型組(P均<0.05)，尼莫地平組及解郁止痛方各劑量組杏仁核組織中BDNF含量均明顯低于模型組(P均<0.05)；解郁止痛方低劑量組大鼠額葉皮質(zhì)、海馬組織中BDNF含量及解郁止痛方高劑量組大鼠血清、額葉皮質(zhì)、海馬組織中BDNF含量與模型組比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)。見表5。

表5 空白組及偏頭痛抑郁共病各組大鼠實(shí)驗(yàn)第21天干預(yù)結(jié)束后血清及額葉皮質(zhì)、海馬、杏仁核組織中BDNF含量比較

3 討 論

頭痛與郁證有著相同的病機(jī)，均與肝失疏泄、脾失健運(yùn)密切相關(guān)，又與病理產(chǎn)物瘀血、痰濕合而為病[14]。臨床上情緒波動(dòng)是誘發(fā)偏頭痛慢性化的重要因素，故肝失疏泄在偏頭痛抑郁共病的發(fā)展進(jìn)程中起著關(guān)鍵作用。由于情志不調(diào)，氣機(jī)郁滯，不能推動(dòng)血液運(yùn)行而產(chǎn)生瘀滯；氣化失司，痰濕內(nèi)停，上擾清竅，均致不通則痛。頭痛日久不愈，病者憂悶不解，加之久痛入絡(luò)，氣滯既生，易導(dǎo)致肝氣郁結(jié)，疏泄不暢。故臨證頭痛未愈，又見心情抑郁、情緒不暢等癥，二者相互影響，易成頭痛、郁證并重。頭痛、抑郁相互影響，遷延難愈，久病則虛，遂成本虛標(biāo)實(shí)之氣滯血瘀正虛之證，患者常以頭痛經(jīng)年遷延不愈，繼而并見以情緒低落為主的郁證為臨床特征?？偨Y(jié)其病因病機(jī)，慢性頭痛并抑郁狀態(tài)當(dāng)屬中醫(yī)“內(nèi)傷頭痛”“郁證”范疇。

解郁止痛方是治療偏頭痛的驗(yàn)方，方中川芎、柴胡為君藥，川芎辛溫香燥，走而不守，具有活血祛瘀、行氣開郁、散寒止痛之功。張?jiān)胤Q譽(yù)川芎“上行頭目，下行血?！?，它既可行血中之氣以解郁，又可祛血中之風(fēng)而止痛。柴胡味辛，本以疏肝解郁、調(diào)暢情志見長(zhǎng)，方中又取其入經(jīng)理氣，以止頭痛；輔以合歡皮解郁、和血、寧心；全蝎為搜風(fēng)通絡(luò)之品，長(zhǎng)于病久入絡(luò)，尤遷延日久之慢性頭痛；《景岳全書·古頭痛第及》中認(rèn)為“凡診頭痛者……蓋暫頭痛，必因邪氣，久病者，必兼元?dú)?。”該證由頭痛遷延，并發(fā)郁證，病久勢(shì)必傷及正氣，故用黃芪大補(bǔ)元?dú)?。五味合力，達(dá)理氣活血、扶正補(bǔ)氣之功。解郁止痛方治療慢性頭痛合并抑郁狀態(tài)，立法組方本于該病的基本病機(jī)，臨床應(yīng)用證實(shí)其療效可靠。

BDNF是中樞和外周神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)的神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子，可控制神經(jīng)元的發(fā)育和分化。BDNF主要由神經(jīng)元和星形膠質(zhì)細(xì)胞以自分泌、旁分泌方式分泌，廣泛存在于額葉皮質(zhì)、海馬、杏仁核等中樞神經(jīng)系統(tǒng)中[15]。目前研究發(fā)現(xiàn)，BDNF部分通過影響谷氨酸能和γ-氨基丁酸能突觸的效率來調(diào)節(jié)三叉神經(jīng)傷害感受通路中突觸的可塑性，其是偏頭痛抑郁共病的重要調(diào)節(jié)因子，BDNF/酪氨酸激酶受體B(TrkB)信號(hào)通路激活后，可通過細(xì)胞內(nèi)的級(jí)聯(lián)反應(yīng)導(dǎo)致中樞敏化[16-17]。當(dāng)疼痛上行通路逐級(jí)上傳至丘腦傷害感受性神經(jīng)元，則會(huì)出現(xiàn)顱外痛覺超敏，從而造成偏頭痛的慢性化[18]。杏仁核主要包括中央杏仁核(CeA)和基底外側(cè)復(fù)合體(BLA)。BLA中主要是興奮性的谷氨酸能神經(jīng)元，CeA中主要是抑制性的γ-氨基丁酸能神經(jīng)元[19]。關(guān)于杏仁核的環(huán)路連接已經(jīng)有很多報(bào)道，CeA的外側(cè)部分被稱為“傷害感受性杏仁核”，從腦干和脊髓接收傷害感受性輸入，CeA將疼痛的認(rèn)知和意識(shí)感知整合之后，將信號(hào)輸出發(fā)送到皮質(zhì)部位和丘腦[19]。BLA與皮質(zhì)區(qū)域相互連接，尤其是額葉皮質(zhì)、海馬以及感覺相關(guān)區(qū)域。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，解郁止痛方可顯著改善偏頭痛抑郁共病大鼠的行為，降低杏仁核中BDNF含量，升高血清、額葉皮質(zhì)、海馬中BDNF含量。推測(cè)解郁止痛方可能通過影響B(tài)DNF/ERK/CREB信號(hào)通路，降低疼痛上行傳導(dǎo)通路的中樞敏化，抑制杏仁核的過度活化，從而減輕其對(duì)額葉皮質(zhì)及海馬的負(fù)性調(diào)節(jié)而發(fā)揮鎮(zhèn)痛作用。

利益沖突：所有作者均聲明不存在利益沖突。