老年腹膜透析患者腹膜纖維化與腹膜透析液中糖原合酶激酶-3β、β連環(huán)蛋白水平的相關(guān)性研究

鄭峰，姜燕，臧秀娟，吳水，邵偉娟

上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬松江醫(yī)院腎內(nèi)科，上海 201600

腹膜透析為現(xiàn)臨床常用的腎臟替代治療干預(yù)方式，具有不依賴透析機(jī)、肝炎病毒傳染率低、保護(hù)殘余腎功能、操作簡(jiǎn)便、費(fèi)用低廉等優(yōu)點(diǎn)，但隨透析齡逐步增大，患者腹膜結(jié)構(gòu)出現(xiàn)漸進(jìn)性改變，引起腹膜纖維化，目前已成為透析失敗的常見原因［1］。研究顯示［2］，腹膜間皮細(xì)胞上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial mesenchymal transformation，EMT）為腹膜纖維化早期關(guān)鍵環(huán)節(jié)，而糖原合酶激酶-3β（GSK-3β）/β 連環(huán)蛋白（β-catenin）通路與腹膜間皮細(xì)胞EMT 關(guān)聯(lián)密切。國(guó)內(nèi)有學(xué)者發(fā)現(xiàn)［3］，GSK-3β/β-catenin 通路在腹膜纖維化大鼠模型中處于異常激活狀態(tài)，給予藥物干預(yù)后GSK-3β 降解增多，β-catenin蓄積減少，腹膜纖維化病情減輕。另有國(guó)外研究發(fā)現(xiàn)［4］，他莫昔芬可通過抑制GSK-3β/β-catenin 軸活化以減輕腹透液所致腹膜纖維化。由此可見，GSK-3β和β-catenin 與腹膜纖維化關(guān)聯(lián)較深，但既往研究為基礎(chǔ)研究，尚缺乏臨床研究加以證實(shí)。腹膜透析老年患者因生理機(jī)能與免疫能力減弱，對(duì)腹透液耐受能力差，更易在透析過程中發(fā)生腹膜纖維化，故本次研究以上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬松江醫(yī)院2016年1月—2020年12月收治的腹膜透析老年患者為研究對(duì)象，檢測(cè)并比較腹膜透析未發(fā)生和發(fā)生腹膜纖維化患者腹膜透析液中GSK-3β、β-catenin 水平變化，明確其相關(guān)性，希望為臨床防治腹膜纖維化提供新的思路和指導(dǎo)。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選擇2016年1月—2020年12月上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬松江醫(yī)院收治的腹膜透析腹膜纖維化患者81 例（觀察組）和同期在上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬松江醫(yī)院腹膜透析未發(fā)生腹膜纖維化患者100 例（對(duì)照組）為研究對(duì)象，進(jìn)行前瞻性研究。觀察組年齡60～80歲，平均（68.8 ±3.1）歲；對(duì)照組年齡60～80歲，平均（68.5 ±3.2）歲。2 組一般資料如性別、年齡等差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見表1。在選取的腹透患者中，2 例由血透轉(zhuǎn)為腹透，179 例一直進(jìn)行腹透。納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）患者原發(fā)病為終末期腎病，維持性腹透大于90 d，腹膜纖維化經(jīng)腹膜活檢證實(shí)［5］；（2）使用同一種透析液；（3）無精神疾病、自身免疫性疾病、凝血系統(tǒng)疾病或良、惡性腫瘤；（4）入組前90 d 內(nèi)未發(fā)生過腹膜炎；（5）年齡≥60 歲；（6）簽署知情同意書。符合上述所有標(biāo)準(zhǔn)的病例納入本研究。排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）重要臟器功能障礙；（2）近期患者存在激素使用史；（3）病歷資料不齊；（4）患者伴有腹腔出血；（5）患者腹部皮膚感染未得到控制；（6）透析管路存在機(jī)械性問題。符合上述任意1 項(xiàng)的病例排除于本項(xiàng)研究。本研究經(jīng)上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬松江醫(yī)院倫理委員會(huì)審批（批準(zhǔn)號(hào)ZJC-20151203）。

1.2 觀察指標(biāo)與方法

（1）透析方法：所有患者給予腹透治療，腹透液（乳酸鹽－G2.5%）購(gòu)于上海長(zhǎng)征富民金山制藥有限公司，每日透析量6 000～10 000 mL，治療觀察時(shí)間90 d。（2）樣本采集：于早上7：00 收集腹透液10 mL（患者夜間留腹10 h），TGL-16 臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)（長(zhǎng)沙湘銳離心機(jī)有限公司）以3 000 r/min 條件下進(jìn)行離心操作10 min 之后將上清液收集并于－80 ℃條件下保存待用。（3）指標(biāo)檢測(cè)：應(yīng)用酶聯(lián)免疫吸附法［6］測(cè)定腹膜透析液中GSK-3β、β-catenin 及腹膜纖維化指標(biāo)［轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1（transforming growth factor β1，TGFβ1）、α-平滑肌肌動(dòng)蛋白（α-smooth muscle actin，α-SMA）、纖維連接蛋白（fibronectin，F(xiàn)N）、Ⅰ型膠原蛋白（collagen Ⅰ，Col-Ⅰ）］水平，實(shí)驗(yàn)步驟嚴(yán)格按照試劑盒說明進(jìn)行，試劑盒購(gòu)于上海酶聯(lián)生物科技有限公司，使用北京昊諾斯科技有限公司提供的Thermo Scientific Multiskan FC 酶標(biāo)儀于450 nm 波長(zhǎng)下進(jìn)行測(cè)定。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS23.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以（±s）表示，用t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料用例數(shù)和百分率表示，用χ2檢驗(yàn)；相關(guān)性分析用Spearman 檢驗(yàn)和Pearson 檢驗(yàn)。以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 2 組一般資料比較

2 組性別、體質(zhì)量指數(shù)、年齡、煙酒史、原發(fā)疾病差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見表1。

表1 2 組一般資料比較

2.2 2 組腹透液中GSK-3β 和β-catenin 水平比較

觀察組GSK-3β 和β-catenin 水平高于對(duì)照組（P＜0.05）。見表2。

表2 2 組GSK-3β 和β-catenin 水平（±s）

表2 2 組GSK-3β 和β-catenin 水平（±s）

注：與對(duì)照組比較，△P＜0.05。

組別 GSK-3β （μg/L） β-catenin （pg/mL）對(duì)照組（n＝100） 9.22 ±2.10 28.88 ±6.02觀察組（n＝81） 23.36 ±5.25△ 59.17 ±13.36△

2.3 2 組腹膜纖維化指標(biāo)水平比較

檢測(cè)并比較2 組腹膜纖維化指標(biāo)水平發(fā)現(xiàn)，觀察組腹透液中TGF-β1、FN、Col-I、α-SMA 水平高于對(duì)照組（P＜0.05）。見表3。

表3 2 組腹膜纖維化指標(biāo)水平（±s）

表3 2 組腹膜纖維化指標(biāo)水平（±s）

注：與對(duì)照組比較，△P＜0.05。

組別 TGF-β1 （ng/mL） FN （pg/mL） Col-Ⅰ（ng/L） α-SMA （KU/L）對(duì)照組（n＝100） 38.80±8.00 155.51±37.74 19.00±4.66 15.17 ±3.59觀察組（n＝81） 43.32±9.96△ 210.09±51.15△ 33.36±8.10△ 28.48±6.36△

2.4 各指標(biāo)與腹膜透析患者發(fā)生腹膜纖維化的相關(guān)性分析

Spearman 檢驗(yàn)相關(guān)性分析提示，腹膜透析液中GSK-3β 和β-catenin 水平與腹膜透析患者發(fā)生腹膜纖維化呈正相關(guān)（P＜0.05）。見表4。

表4 相關(guān)性數(shù)據(jù)分析

2.5 GSK-3β、β-catenin 與腹膜纖維化指標(biāo)的相關(guān)性

Pearson 檢驗(yàn)相關(guān)性分析提示，腹膜透析液中GSK-3β 水平與TGF-β1、FN、Col-Ⅰ、α-SMA 呈正相關(guān)（r＝0.377，0.351，0.394.0.366，分別P＜0.001，＜0.001，＜0.001，＜0.001），β-catenin 水平亦與TGF-β1、FN、Col-Ⅰ、α-SMA 呈正相關(guān)（r＝0.447，0.395，0.411.0.407，分別P＜0.001，＜0.001，＜0.001，＜0.001）。見圖1。

圖1 GSK-3β、β-catenin 與腹膜纖維化指標(biāo)的相關(guān)性

3 討論

腹膜透析患者長(zhǎng)期暴露于腹膜透析液可引起腹膜纖維化，患者透析效能減弱，最終導(dǎo)致超濾衰竭，影響患者長(zhǎng)期存活率［7］，故而明確腹膜透析致腹膜纖維化的發(fā)生及進(jìn)展機(jī)制對(duì)于預(yù)防其發(fā)生或者延緩病情進(jìn)展有重要意義。以往研究報(bào)道［8］，腹膜間皮細(xì)胞EMT 為腹膜纖維化過程中的始動(dòng)因素，其可誘發(fā)腹膜間皮細(xì)胞向成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化，促使ECM 大量產(chǎn)生，為機(jī)體腹膜功能減弱的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。GSK-3β/β-catenin 通路異?；罨推鞴倮w維化相關(guān)，并已證明該通路可參與EMT 發(fā)生［9］。GSK-3β 為Wnt 通路中的重要信號(hào)分子，廣泛存在于各種細(xì)胞內(nèi)，能夠通過Wnt 通路調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、凋亡、代謝等過程。研究［10］證實(shí)，GSK-3β蛋白分子在纖維化過程中發(fā)揮重要作用，抑制其表達(dá)可阻止肺纖維化進(jìn)展。β-catenin 為1 種多功能蛋白，生理狀態(tài)下維持在較低水平，GSK-3β 磷酸化可抑制β-catenin 的泛素化活性，引起胞內(nèi)β-catenin 蛋白積聚，進(jìn)而遷移至胞核［11］。既往研究顯示［12］，抑制β-catenin 蛋白表達(dá)可阻斷高糖所致的HKC 轉(zhuǎn)分化，調(diào)控GSK-3β 通路可阻抑DN 纖維化進(jìn)展。資料顯示［13］，GSK-3β 基因沉默能夠阻斷TGF-1 分子誘導(dǎo)的a-SMA 和FN 表達(dá)，繼而發(fā)揮其所具有的抗肺纖維化效應(yīng)。另有研究顯現(xiàn)［14］，長(zhǎng)期腹透可使腹膜形態(tài)和功能異常改變，促使腹膜溶質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)變多，導(dǎo)致腹膜纖維化形成，而GSK-3β/β-catenin 通路可介導(dǎo)腹膜間皮細(xì)胞EMT 過程，增加ECM 沉積量，促使腹膜功能退化。

本研究中，觀察組腹透液中GSK-3β 和β-catenin 水平高于對(duì)照組，提示GSK-3β/β-catenin 通路異常激活與老年腹膜透析患者腹膜纖維化相關(guān)。TGF-β1、FN、Col-Ⅰ、α-SMA 為腹膜纖維化相關(guān)指標(biāo)［15］，TGF-β1 具有促纖維化作用，可促進(jìn)成纖維細(xì)胞增殖，抑制上皮細(xì)胞生長(zhǎng)，誘發(fā)器官組織纖維化；FN 是一種非膠原糖蛋白，能反映器官纖維化發(fā)生和進(jìn)展情況，在纖維化發(fā)生時(shí)FN 含量明顯上調(diào)；Col-Ⅰ為體內(nèi)最豐富的膠原蛋白，可反映纖維化程度；α-SMA 為一種細(xì)胞骨架蛋白，其表達(dá)水平檢測(cè)在器官組織纖維化中有重要評(píng)估意義。本研究結(jié)果提示，腹膜透析致腹膜纖維化患者TGFβ1、FN、Col-Ⅰ、α-SMA 均增高，能反映腹膜纖維化的發(fā)生。相關(guān)性分析結(jié)果顯示，腹膜透析液中GSK-3β 和β-catenin 水平與老年腹膜透析患者發(fā)生腹膜纖維化呈正相關(guān)，且與腹膜纖維化患者TGF-β1、FN、Col-Ⅰ、α-SMA 呈正相關(guān)，提示GSK-3β 和β-catenin為腹膜纖維化發(fā)生的關(guān)聯(lián)因素，提示GSK-3β/β-catenin 通路在腹膜纖維化中占據(jù)一定意義。

綜上所述，老年腹透患者腹膜纖維化與腹透液中GSK-3β、β-catenin 水平存在一定相關(guān)性，其水平檢測(cè)有利于了解腹膜纖維化發(fā)病和病情情況。但本研究存在一定不足，如樣本量偏小、選擇性偏倚、觀察性偏倚、關(guān)系機(jī)制尚未被挖掘等，待進(jìn)一步深入研究。