FSCN1蛋白在胃癌組織中的表達(dá)及臨床意義

于嬪，朱蔚遠(yuǎn)，彭文斌，范月娥，王躍平

胃癌是最為常見的消化道癌癥，流行病學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，2018年共有782 685例胃癌患者死亡，占所有癌癥死亡人數(shù)的8.2%，是全球癌癥死亡的第三大原因[1-3]，嚴(yán)重威脅患者身心健康[4]。我國胃癌早期診斷率不到10%，遠(yuǎn)低于發(fā)達(dá)國家。因此，尋找早期指示胃癌發(fā)展的生物標(biāo)志物對胃癌早期診斷及時治療具有重要臨床意義[5-6]。研究發(fā)現(xiàn)，肌動蛋白細(xì)胞骨架網(wǎng)絡(luò)在腫瘤細(xì)胞遷移、侵襲中起重要作用，成束蛋白1(Fascin1，F(xiàn)SCN1)是一種與肌動蛋白結(jié)合的細(xì)胞骨架蛋白，參與內(nèi)皮細(xì)胞纖足形成，促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞轉(zhuǎn)移[7-8]。已有研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)SCN1在胃癌組織中表達(dá)上調(diào)，受Notch1信號通路調(diào)控參與腫瘤的侵襲與轉(zhuǎn)移過程[9-10]。越來越多的研究認(rèn)為，細(xì)胞骨架改變對腫瘤的發(fā)生發(fā)展起促進(jìn)作用[11]。本研究通過檢測胃癌患者腫瘤組織中FSCN1蛋白的表達(dá)水平，探究其與胃癌發(fā)展及預(yù)后的關(guān)系，分析其臨床意義。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2014年1月至2015年12月我院手術(shù)切除的82例胃癌患者，術(shù)中取得胃癌組織標(biāo)本82例及癌旁正常胃黏膜組織標(biāo)本63例，所有患者組織標(biāo)本均經(jīng)病理檢查證實為胃癌。所有患者均為首次治療，術(shù)前均未行放療、化療或其他抗腫瘤治療，臨床病理資料及隨訪資料完整。所有患者均自愿簽署知情同意書，本研究獲得本院倫理委員會批準(zhǔn)。

1.2 方法

1.2.1 數(shù)據(jù)庫分析 GEPIA(http://gepia.cancer-pku.cn/index.html)是一個由北京大學(xué)開發(fā)的數(shù)據(jù)庫，是基于癌癥基因組圖譜(the cancer genome atlas，TCGA)的數(shù)據(jù)分析及可視化的網(wǎng)站，可實現(xiàn)相關(guān)癌癥基因的生物標(biāo)志物鑒定、表達(dá)圖譜分析、生存預(yù)后分析等。本研究基于TCGA數(shù)據(jù)庫，對FSCN1 mRNA在胃癌組織及正常胃黏膜組織中表達(dá)差異進(jìn)行比較。

1.2.2 免疫組化法檢測胃癌組織及癌旁正常胃黏膜組織中FSCN1蛋白表達(dá) 將石蠟組織標(biāo)本以4 μm連續(xù)切片，常規(guī)脫蠟、水化處理，采取免疫組化EnVision兩步染色法檢測FSCN1蛋白表達(dá)情況，操作均由檢驗科同一名經(jīng)驗豐富的醫(yī)師嚴(yán)格按照試劑盒說明書步驟進(jìn)行。一抗采用兔抗人FSCN1抗體(購自美國Sigma公司)，即用型二抗購自北京索萊寶科技有限公司。二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色，蘇木素復(fù)染，脫水、透明、封片后觀察。用已知陽性切片標(biāo)本為陽性對照，陰性對照用磷酸鹽緩沖液(PBS)代替一抗制成。

結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)：①按染色強(qiáng)度評分：無染色為0分，淺黃色為1分，黃色或黃棕色為2分，棕褐色為3分；②按陽性細(xì)胞所占比例評分：無陽性細(xì)胞記0分，陽性細(xì)胞所占比例<25%記1分，26%～50%記2分，51%～75%記3分，>75%記4分。兩種評分方法得分的乘積為最終結(jié)果，以最終結(jié)果>2分定義為表達(dá)陽性(+)，≤2分定義為表達(dá)陰性(-)；同時定義最終結(jié)果≥3分為高表達(dá)，<3分為低表達(dá)。

1.2.3 隨訪 胃癌患者術(shù)后均以電話或門診方式進(jìn)行隨訪，隨訪起始日期為術(shù)后第一個月，截止日期為2020年12月或患者死亡。第1～2年每1～3個月隨訪一次，第3～4年每6個月隨訪一次，之后每年隨訪一次。記錄胃癌患者預(yù)后情況，分析FSCN1蛋白表達(dá)水平與患者生存時間的關(guān)系。

1.2.4 FSCN1共表達(dá)基因互作分析 基于Coexpedia數(shù)據(jù)庫(https://www.coexpedia.org/)分析FSCN1共表達(dá)基因互作關(guān)系，選取共表達(dá)的對數(shù)似然分?jǐn)?shù)(Log likelihood score，LLS)，基因?qū)Π凑誔earson相關(guān)系數(shù)的降序排列，計算每個bin的LLS。

1.2.5 FSCN1共表達(dá)基因的富集分析 使用R3.6.3軟件中的clusterProfiler包進(jìn)行共表達(dá)基因的富集分析，并利用Enrichr(http://amp.pharm.mssm.edu/Enrichr)在線分析工具進(jìn)行GO功能注釋和KEGG通路分析，分析FSCN1參與的生物學(xué)功能、信號通路等內(nèi)容。

1.2.6 FSCN1表達(dá)與胃癌患者免疫細(xì)胞浸潤的相關(guān)性分析 利用TCGA數(shù)據(jù)庫下載數(shù)據(jù)，分析胃癌患者FSCN1表達(dá)與免疫細(xì)胞浸潤之間的關(guān)系。利用R3.6.3軟件中的GSVA包繪圖，并以ssGSEA算法評估腫瘤細(xì)胞免疫浸潤程度。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 FSCN1 mRNA在胃癌組織及正常胃黏膜組織中的表達(dá)水平

利用TCGA數(shù)據(jù)庫比較408例胃癌組織和211例正常胃黏膜組織中FSCN1 mRNA的表達(dá)情況，結(jié)果顯示FSCN1 mRNA胃癌組織中表達(dá)顯著上調(diào)(P<0.05)，見圖1。

圖1 FSCN1 mRNA在胃癌組織及正常胃黏膜組織中的表達(dá)水平

2.2 免疫組化結(jié)果分析

免疫組化結(jié)果顯示，F(xiàn)SCN1主要定位于細(xì)胞質(zhì)，見圖2。FSCN1蛋白在胃癌組織中的陽性表達(dá)率為60.98%(50/82)，明顯高于正常胃黏膜中的19.05%(12/63)(P<0.05)，見表1。

圖2 免疫組化結(jié)果(SP，×400)

表1 FSCN1蛋白在胃癌組織和正常胃黏膜組織中的陽性表達(dá)情況 n(%)

2.3 FSCN1蛋白表達(dá)水平與胃癌患者臨床病理參數(shù)之間的關(guān)系

結(jié)果顯示，F(xiàn)SCN1蛋白表達(dá)水平與胃癌患者年齡、性別、腫瘤位置無關(guān)(P>0.05)，與患者TNM分期、腫瘤分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)(P<0.05)，見表2。

表2 FSCN1蛋白表達(dá)水平與胃癌患者臨床病理參數(shù)之間的關(guān)系 [n(%)]

2.4 生存分析

圖3 FSCN1蛋白表達(dá)水平與胃癌患者生存時間的關(guān)系

2.5 影響胃癌患者預(yù)后的多因素Cox回歸分析

多因素Cox回歸分析結(jié)果顯示，TNM分期Ⅲ～Ⅳ期、分化程度低、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、FSCN1蛋白高表達(dá)是影響胃癌患者預(yù)后的獨立危險因素(P<0.05)，見表3。

表3 影響胃癌患者預(yù)后的多因素Cox回歸分析

2.6 FSCN1共表達(dá)基因互作分析

本研究共分析FSCN1與303個基因的互作關(guān)系，根據(jù)LLS評分分析，相關(guān)性較強(qiáng)的前10個基因分別為APOE、ZYX、HOMER3、AXL、RBM42、ARHGDIA、ITGA3、PMAIP1、COL4A1、TP53，見表4。

表4 FSCN1共表達(dá)基因分析

2.7 FSCN1共表達(dá)基因的富集分析

FSCN1共表達(dá)基因主要參與細(xì)胞外基質(zhì)組織、白細(xì)胞遷移、血小板活化、白細(xì)胞增殖、淋巴細(xì)胞增殖等生物學(xué)過程，富集到的主要通路包括黏著斑、阿米巴病、ECM-受體相互作用、PI3K-Akt信號通路、Hippo信號通路、病毒性心肌炎、細(xì)胞間黏附分子等信號通路。見圖4。

圖4 FSCN1共表達(dá)基因通路的富集分析

2.8 FSCN1表達(dá)與胃癌患者免疫細(xì)胞浸潤的相關(guān)性

Spearman相關(guān)性分析顯示，F(xiàn)SCN1表達(dá)與NK細(xì)胞、Tem細(xì)胞、浸潤性樹突狀細(xì)胞(iDC)、巨噬細(xì)胞(Macrophages)、樹突狀細(xì)胞(DC)、Th1細(xì)胞、肥大細(xì)胞(Mast cells)、漿細(xì)胞樣樹突狀細(xì)胞(pDC)、Tgd細(xì)胞、中性粒細(xì)胞(Neutrophils)、NK CD56dim細(xì)胞、濾泡輔助性T細(xì)胞(TFH)均呈正相關(guān)(r=0.408、0.259、0.230、0.222、0.195、0.174、0.171、0.167、0.156、0.142、0.139、0.129，P均<0.05)，與調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(TReg)、中央記憶型T細(xì)胞(Tcm)、NK CD56bright細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞(Eosinophils)、B細(xì)胞、CD8 T細(xì)胞、自體樹突狀細(xì)胞(aDC)、細(xì)胞毒性細(xì)胞(Cytotoxic cells)、T細(xì)胞、Th2細(xì)胞均無明顯相關(guān)性(r=0.099、0.095、0.080、0.060、0.054、0.049、0.043、0.037、-0.022、-0.022，P均>0.05)；與輔助性T細(xì)胞(T helper cells)、Th17細(xì)胞均呈負(fù)相關(guān)(r=-0.145、-0.188，P均<0.05)。見圖5。

圖5 FSCN1表達(dá)與胃癌患者免疫細(xì)胞浸潤的相關(guān)性

3 討論

FSCN1是一種55KD的單鏈肌動蛋白絲結(jié)合蛋白，與腫瘤活動進(jìn)展和腫瘤細(xì)胞活動性有關(guān)，可調(diào)節(jié)細(xì)胞表面的絲狀偽足、片狀偽足和微穗狀突起的形成，通過典型的Smad依賴通路促進(jìn)細(xì)胞遷移、運(yùn)動[12-13]。已有研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)SCN1在多種惡性腫瘤如結(jié)直腸癌[14]、前列腺癌[15]、腎細(xì)胞癌[16]中表達(dá)上調(diào)，參與腫瘤進(jìn)展，并與患者預(yù)后不良有關(guān)[17]。Wang等[18]研究報道稱，F(xiàn)SCN1在胃癌細(xì)胞系及胃癌組織中的表達(dá)量高于正常細(xì)胞及正常胃黏膜組織，且隨細(xì)胞分化程度降低而表達(dá)增加，體外實驗證實沉默F(xiàn)SCN1基因可抑制胃癌細(xì)胞遷移及上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化標(biāo)志物的表達(dá)，提示FSCN1可能在胃癌中發(fā)揮癌基因作用。本研究結(jié)果顯示，胃癌組織中FSCN1蛋白的陽性表達(dá)率明顯高于癌旁正常黏膜組織，與Wang等[18]報道一致，表明FSCN1可能與胃癌的發(fā)生有關(guān)。分析患者臨床病理資料發(fā)現(xiàn)，胃癌患者TNM分期越重、分化程度越低，F(xiàn)SCN1蛋白高表達(dá)人數(shù)所占比例越大，并且FSCN1蛋白高表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，表明FSCN1可能參與胃癌增殖、分化、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移作用。生存分析顯示，F(xiàn)SCN1高表達(dá)患者5年累積生存率及中位生存時間均低于低表達(dá)患者，與一項薈萃分析[19]結(jié)果一致，表明FSCN1可能作為胃癌發(fā)生、進(jìn)展及預(yù)后的潛在標(biāo)志物。最后，Cox回歸分析結(jié)果顯示，F(xiàn)SCN1蛋白高表達(dá)是影響胃癌患者預(yù)后的獨立危險因素，表明FSCN1蛋白高表達(dá)患者預(yù)后不良風(fēng)險增加，可能成為指示胃癌患者病情發(fā)展及預(yù)后的潛在生物指標(biāo)。

既往研究發(fā)現(xiàn)[20-22]，F(xiàn)SCN1與多種腫瘤細(xì)胞的增殖分化、黏附、轉(zhuǎn)移侵襲及免疫反應(yīng)等方面有一定關(guān)聯(lián)。本研究利用Coexpedia數(shù)據(jù)庫共預(yù)測與FSCN1共表達(dá)的基因303個，且富集分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)SCN1共表達(dá)基因主要參與細(xì)胞外基質(zhì)組織、白細(xì)胞遷移、血小板活化、白細(xì)胞增殖、淋巴細(xì)胞增殖等生物學(xué)過程，富集到的主要通路包括黏著斑、阿米巴病、ECM-受體相互作用、PI3K-Akt信號通路、Hippo信號通路、細(xì)胞間黏附分子等信號通路[23]。進(jìn)一步提示FSCN1可能參與胃癌的發(fā)展過程。由于腫瘤發(fā)展存在復(fù)雜的微環(huán)境改變，而抗腫瘤的療效與自身免疫系統(tǒng)密切相關(guān)，因此通過分析腫瘤免疫系統(tǒng)可在一定程度上幫助癌癥患者的免疫治療[24-25]。本研究利用利用TCGA數(shù)據(jù)庫及R3.6.3軟件，分析胃癌患者FSCN1表達(dá)與免疫細(xì)胞浸潤之間的關(guān)系，結(jié)果發(fā)現(xiàn)FSCN1表達(dá)與NK細(xì)胞、Tem細(xì)胞、浸潤性樹突狀細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞、Th1細(xì)胞、肥大細(xì)胞、漿細(xì)胞樣樹突狀細(xì)胞、Tgd細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、NK CD56細(xì)胞、濾泡輔助性T細(xì)胞均呈正相關(guān)，與輔助性T細(xì)胞、Th17細(xì)胞均呈負(fù)相關(guān)。提示FSCN1表達(dá)與NK細(xì)胞、輔助性T細(xì)胞等多種免疫細(xì)胞的浸潤程度密切相關(guān)，其可能在胃癌免疫治療方面具有重要的研究價值。

綜上所述，胃癌組織中FSCN1蛋白高表達(dá)，其表達(dá)水平與胃癌患者TNM分期、腫瘤分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，可能是指示腫瘤發(fā)生發(fā)展及患者預(yù)后的潛在標(biāo)志物，有望成為胃癌免疫治療的新靶點。FSCN1的差異表達(dá)可能與細(xì)胞骨架改變有關(guān)，可能在胃癌細(xì)胞侵襲過程中發(fā)揮重要作用，值得進(jìn)一步細(xì)胞實驗或動物實驗研究。