線粒體移植在心肌缺血損傷治療中的研究

陳航，胡琴豐，林麗，劉建文，陳康輝，陳昭陽?

①福建醫(yī)科大學附屬協(xié)和醫(yī)院，福建省心血管中心，福州 350001；②復(fù)旦大學 生物醫(yī)學研究院，上海 200032

1890年Altmann首次發(fā)現(xiàn)線粒體，它是位于細胞質(zhì)中的一種細胞器。細胞所需能量的主要載體三磷酸腺苷(ATP)大部分產(chǎn)生于線粒體，所以線粒體通常被稱為細胞的動力工廠[1]。然而，在高效制造ATP的同時，線粒體也會產(chǎn)生少量可控的含氧活性化學反應(yīng)性物質(zhì)，即活性氧簇(ROS)，因此被稱為細胞的“核電站”。當線粒體受損時，ROS的產(chǎn)生會增多，并對受損線粒體和周圍線粒體造成傷害，從而導致細胞凋亡和壞死。由于受損的線粒體是導致細胞死亡的重要因素，線粒體對維持生命至關(guān)重要。

理論上線粒體曾經(jīng)是擁有呼吸能力而后被細胞吞噬并利用其呼吸功能的古細菌。這一理論的證據(jù)在于線粒體有兩個脂質(zhì)膜和自己的環(huán)狀DNA[2]。隨著生命的進化，細胞變得更加依賴線粒體來提供能量，甚至將編碼關(guān)鍵線粒體蛋白的基因整合到核DNA中。線粒體是母系遺傳的[3]，這意味著每個后代的線粒體DNA(mtDNA)將與其母體的相同。因此，使用母體線粒體追蹤家族譜系，也涉及mtDNA突變和疾病的母系遺傳。為了避免mtDNA突變的遺傳，科學家已嘗試在受精卵中進行線粒體置換，用來自供體的健康mtDNA替換有缺陷的mtDNA[4-5]。

1 線粒體結(jié)構(gòu)

線粒體位于細胞質(zhì)中，具有雙層膜結(jié)構(gòu)，一般長0.5～1 μm。線粒體擁有自己的DNA，稱為mtDNA。mtDNA共有37個基因，可以編碼2種rRNA、22種tRNA和13種多肽[6]。線粒體至少需要2 000多種蛋白才能維持其正常的功能，而絕大多數(shù)的蛋白仍需細胞核中的基因進行編碼。

線粒體的雙層膜分別是位于線粒體最外層的線粒體外膜(MOM)和位于線粒體內(nèi)側(cè)的線粒體內(nèi)膜(MIM)[7]。MOM維持線粒體的基本形狀，并隔絕線粒體基質(zhì)與細胞質(zhì)。由于MOM與細胞質(zhì)相通，因此膜間隙的pH值與細胞質(zhì)的相似。MOM的通透性大，因此還具有物質(zhì)交換平臺的功能。MIM折疊成嵴，通透性小，其上分布著兩條電子傳遞鏈(ETC)，是進行有氧呼吸的重要場所。MIM與MOM之間的腔隙稱為膜間隙(寬6～8 nm)，延伸至嵴的軸心部?；|(zhì)為MIM包圍著的空間，催化三羧酸循環(huán)、脂肪酸和丙酮酸氧化的酶均位于線粒體基質(zhì)中。除糖酵解在細胞質(zhì)中進行外，其他的生物氧化過程都在線粒體中進行。

2 線粒體功能

線粒體的核心功能是為細胞提供生命活動所需的能量。除此之外，線粒體還有許多額外的功能，包括產(chǎn)生ROS、維持鈣穩(wěn)態(tài)、調(diào)控細胞凋亡過程和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(ER)應(yīng)激等。

2.1 能量供應(yīng)

細胞的正常生命活動離不開能量。線粒體產(chǎn)生ATP，滿足細胞的大部分能量需求。在細胞的能量代謝過程中，不同的能量底物轉(zhuǎn)換為乙酰輔酶A后進入三羧酸循環(huán)。在氧化磷酸化的過程中，線粒體使用三羧酸循環(huán)產(chǎn)生的NADH和FADH作為底物，為位于MIM上的電子傳遞鏈提供動力。簡單來說，NADH向電子傳遞鏈復(fù)合物I提供一個電子，這使得一個氫原子可以逆濃度進入內(nèi)膜中，并以此形成了MIM上的膜電位(140～180 mV)[8]。ETC復(fù)合物V使用膜電位的能量使ADP變?yōu)锳TP，同時氫原子回到線粒體基質(zhì)中。當電子到達ETC復(fù)合物IV時，氫原子被釋放回線粒體基質(zhì)中并在此與氧結(jié)合，最終產(chǎn)生水分子。

2.2 ROS的產(chǎn)生

線粒體在產(chǎn)生能量的過程中，從ETC釋放的電子將氧還原為超氧化物，從而以超氧自由基(O2-)的形式產(chǎn)生少量的ROS。位于線粒體內(nèi)的錳超氧化物歧化酶(MnSOD)將超氧化物氧化成活性較低的過氧化氫[9-10]。過氧化氫可以發(fā)生芬頓反應(yīng)產(chǎn)生羥基自由基(OH-)，從而破壞脂質(zhì)、蛋白質(zhì)和核酸[11]。谷胱甘肽(GSH)過氧化物酶可以將過氧化氫轉(zhuǎn)化為水[12]。

2.3 維持鈣穩(wěn)態(tài)

研究表明線粒體內(nèi)鈣離子能夠調(diào)節(jié)許多生理病理過程。線粒體具有動態(tài)性，可以定位于細胞內(nèi)的任何位置。作為鈣離子依賴型效應(yīng)器，線粒體在很多生化過程(例如能量的產(chǎn)生和細胞的死亡)中起到重要作用。作為鈣離子進入線粒體的第一道屏障，MOM高表達電壓依賴型陰離子選擇性通道蛋白(VDAC)，進而維持對鈣離子的高滲透性。正常情況下，細胞質(zhì)內(nèi)的鈣離子濃度為0.1 mmol/L，細胞外鈣離子濃度為1 mmol/L，這有利于鈣離子從細胞外向細胞質(zhì)內(nèi)流[13]。線粒體基質(zhì)和MIM的膜電位分別為-240 mV和-180 mV，鈣離子更傾向于通過鈣單向轉(zhuǎn)運蛋白從細胞質(zhì)向線粒體基質(zhì)移動[14]。之前的研究指出當線粒體基質(zhì)內(nèi)的鈣離子濃度比細胞質(zhì)內(nèi)高106倍時，膜電位才能達到平衡[13]。鈣離子可以通過鈉-鈣交換系統(tǒng)和膜轉(zhuǎn)運孔道進入胞質(zhì)，從而改變胞漿中的鈣離子濃度。鈣離子流入和流出線粒體的能力為線粒體維持細胞質(zhì)鈣穩(wěn)態(tài)提供了理論基礎(chǔ)。當細胞受到Ins(1,4,5)P3刺激時，鈣離子從ER釋放，細胞質(zhì)中鈣離子濃度升高。線粒體上MCU蛋白的過表達可增強線粒體攝取鈣離子的能力，從而減輕Ins(1,4,5)P3引起的細胞質(zhì)鈣超載。此外，使用PDZD8刺激神經(jīng)元時，線粒體對內(nèi)質(zhì)網(wǎng)釋放的鈣離子吸收能力減弱，細胞質(zhì)中鈣離子濃度明顯升高。總的來說，線粒體可在多個層面、多個水平上調(diào)控鈣離子濃度，有助于維持鈣穩(wěn)態(tài)。鈣離子與許多生理活動息息相關(guān)，例如可以促進各種代謝酶的激活從而使ATP的產(chǎn)量增加，并且與細胞信號轉(zhuǎn)導、能量代謝、細胞凋亡等有關(guān)[15]。

3 線粒體移植在心肌缺血性損傷中的應(yīng)用

心肌缺血損傷是由冠狀動脈血流減少或中斷，導致輸送到心肌的氧氣不足以維持心肌細胞的正常功能而產(chǎn)生的。線粒體是心肌細胞的“發(fā)電廠”，為心肌細胞產(chǎn)生超過95%的ATP。在受到缺血缺氧刺激時，線粒體功能受損，無法維持心肌細胞的正常功能。研究表明，心肌缺血發(fā)生后，線粒體的體積[16]、氧化磷酸化能力[17]、線粒體鈣離子[18-20]、線粒體酶活性(細胞色素氧化酶)、線粒體復(fù)合物活性[21]、能量合成能力[20]、mtDNA[22]、線粒體調(diào)節(jié)的細胞死亡途徑[23-24]，以及線粒體轉(zhuǎn)錄組學和蛋白質(zhì)組學[21,24-25]發(fā)生改變。所有這些有害事件都發(fā)生在心肌缺血期間，并在組織再灌注恢復(fù)后持續(xù)存在，導致缺血后細胞活力降低，心肌功能恢復(fù)嚴重受損[16-25]。基于此，科學家們在近十年來提出心肌線粒體移植的概念。

線粒體移植是將健康線粒體注射到受損器官中的治療方法。2009年，在兔缺血心臟模型中首次驗證了線粒體移植的作用[26]。研究者在兔缺血后再灌注之前，從供體兔的健康左心室組織中分離出有活力的、有呼吸能力的線粒體注射到離體心臟的缺血區(qū)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)移植了健康線粒體的缺血心臟的ATP含量增加，梗死面積減少，心肌細胞損失減少和心臟功能改善。共聚焦顯微鏡顯示注射的線粒體在再灌注120 min后存在并存活，并且從心外膜分布到心內(nèi)膜。Blitzer等[27]通過結(jié)扎左前降支建立了豬的缺血/再灌注模型，結(jié)果表明，接受線粒體移植治療的豬的射血分數(shù)和縮短分數(shù)顯著增加，心肌梗死面積顯著減少，但是與對照組相比危險區(qū)的比例無顯著差異。Moskowitzova及其同事[28]在小鼠上進行心臟移植時，從腓腸肌中分離出1×108個同種異體線粒體，通過冠狀動脈口順行輸送到冠狀動脈進行治療。結(jié)果表明，線粒體移植治療顯著延長了冷缺血時間，增強了移植心臟的功能，并減少移植物組織損傷。Sun等[29]的研究顯示乙醛脫氫酶2(ALDH2) 激活劑Alda-1顯著增強了線粒體移植對小鼠心肌缺血再灌注的療效，表明ALDH2的激活能增強移植的線粒體功能。

2016年，研究者在心肌缺血再灌注損傷的兒科患者中完成了線粒體移植治療的首次臨床應(yīng)用。因缺血再灌注相關(guān)的心肌功能障礙而無法脫離體外膜肺氧合(ECMO)支持的5名危重患者接受了從自身腹直肌分離的線粒體移植治療[30]。結(jié)果表明，5名患者的心肌收縮功能都有顯著改善，4名患者在線粒體移植后第二天成功脫離了ECMO支持。該研究表明線粒體移植在改善人類缺血再灌注損傷后的心肌功能障礙中的潛在作用。關(guān)于心肌缺血損傷的線粒體移植治療研究見表1。

表1 心肌缺血損傷的線粒體移植治療研究

4 線粒體移植治療的機制

線粒體吸收受到其數(shù)量、質(zhì)量及轉(zhuǎn)運方式有效性等的影響，預(yù)計不同患者線粒體治療的療效也不同，因此在臨床應(yīng)用線粒體移植之前，需要更好地了解線粒體吸收的機制[35]。

目前線粒體移植治療的機制仍存在較大爭議。據(jù)McCully等[36]推測，移植的線粒體對缺血性心臟產(chǎn)生保護作用的機制是線粒體可以促進心肌功能，并且移植的線粒體在細胞外和細胞內(nèi)都起作用。第一種可能是，線粒體在移植后10 min就可直接激活心臟細胞中的ATP合成，增加ATP含量。第二種可能是，移植的線粒體通過肌動蛋白依賴型內(nèi)吞作用進入心臟細胞，進而調(diào)節(jié)細胞因子，而這些細胞因子可以促進細胞的生長和增殖，從而促進血管生成和保護心肌細胞免受凋亡的影響。第三種可能性是，移植線粒體在心肌缺血期間用正常的mtDNA取代受損的mtDNA，進而增加ATP的合成能力。但是Huynh[37]指出了線粒體移植機制上的一些問題，對McCully團隊的研究提出質(zhì)疑：①血液和細胞外液與線粒體相比含有較高濃度的鈣離子，這有可能引起線粒體的鈣超載，導致線粒體功能障礙，無法保證進入血液中的線粒體仍具有活性；②據(jù)McCully團隊的報道[26]，線粒體移植后僅需幾分鐘的時間即可促進實驗兔的心臟功能，而線粒體進入心肌細胞卻需要幾個小時[34]，假如是移植的線粒體產(chǎn)生的ATP改善缺血心臟功能，那么意味著線粒體在心肌外就向心臟提供能量，這顯然難以解釋；③線粒體進入心肌細胞的機制尚不明確，從文獻來看僅有極少的線粒體進入了受體細胞，而少量的線粒體難以產(chǎn)生足量的ATP供給心肌。綜上，雖然線粒體移植技術(shù)已經(jīng)得到多個實驗室和多個實驗?zāi)Ｐ偷淖C實，但其具體的作用機制仍未得以闡明。

目前，已經(jīng)有很多動物以及細胞試驗驗證了線粒體移植技術(shù)的可行性，但線粒體移植的具體機制尚未被完全揭示，這嚴重限制了該技術(shù)的發(fā)展與應(yīng)用。

5 線粒體移植治療的局限性

盡管線粒體移植在治療缺血性疾病方面已經(jīng)顯現(xiàn)出巨大的前景，在推廣應(yīng)用之前仍然有許多亟需解決的問題。

5.1 潛在的免疫反應(yīng)

線粒體移植中是否發(fā)生免疫反應(yīng)仍然存在爭議。一些研究顯示線粒體移植后未出現(xiàn)明顯的免疫反應(yīng)，如Masuzawa等[38]研究了兔缺血性心肌病模型接受線粒體移植治療后的免疫反應(yīng)，結(jié)果顯示血清中各種炎癥標記物都沒有顯著增加，也未檢測到抗線粒體相關(guān)的抗體。Kaza等[39]也報道了豬缺血再灌注模型中，自體線粒體移植后的炎癥因子并未顯著增加。Ramirez-Barbieri等[40]證實在小鼠腹腔內(nèi)單次或多次注射同源線粒體后，小鼠的免疫反應(yīng)和損傷相關(guān)分子模式(DAMP)沒有明顯的改變。另有一些研究則表明線粒體移植后出現(xiàn)了免疫反應(yīng)， Lin等[41]研究發(fā)現(xiàn)在心臟移植模型中，受體小鼠內(nèi)皮細胞吸收供體小鼠的細胞外線粒體，引起血管內(nèi)皮細胞表面黏附分子(CD54/ICAM-1、CD106 /VCAM-1和CD62E/E-selectin)表達升高，從而導致中性粒細胞、單核細胞和淋巴細胞對內(nèi)皮細胞的黏附增多，炎癥反應(yīng)增加。他們的結(jié)果還顯示，在小鼠心臟移植模型中，移植的心臟中的線粒體促進了排斥反應(yīng)。Pollara等[42]報道，在進行人體器官移植時，捐獻者器官血液中的線粒體衍生的DAMPs增多，從而導致受者體內(nèi)炎癥相關(guān)的細胞因子的水平明顯升高。了解線粒體移植過程中出現(xiàn)免疫反應(yīng)的機制，對于降低線粒體移植的風險具有巨大的價值。

5.2 線粒體的來源和分離方法

為了避免潛在的免疫反應(yīng)，既往的線粒體移植研究中大多使用來自自體組織分離的線粒體，這限制了線粒體的來源，尤其是對于那些先天性線粒體功能障礙的患者來說。另外，線粒體發(fā)揮的作用是即時性的，線粒體的單次使用并不能維持長期治療效果，這進一步增加了對線粒體來源多樣性的需求。最早的線粒體分離方法可以追溯至20世紀，取新鮮的肝臟組織研磨，而后在鹽溶液中低速離心，從而得到分離的線粒體[43-46]。隨后出現(xiàn)了研磨和差速離心相結(jié)合的方法，通過多次研磨和差速離心得到線粒體[47-48]。2013年Schmitt等[48]研發(fā)了從細胞和組織中分離線粒體的半自動化方法，并證明可以從冰凍組織或器官中分離得到完整的線粒體，這對臨床研究意義重大。目前的研究主要通過在冷卻的緩沖液中差速離心來分離線粒體[49-51]。

5.3 線粒體的儲存

線粒體是具有生物活性的細胞器，分離后的線粒體需要合理的儲存。線粒體處于冷藏或冷凍狀態(tài)時，其外膜和內(nèi)膜會被損壞。MIM受損時，氧化磷酸化障礙，ATP和氨基酸等生物分子的合成能力受損，某些分子的MIM傳輸受損，pH值梯度和膜電位降低，能量生成減少。當MOM受損時，線粒體失去完整性，膜滲透性增加，導致蛋白質(zhì)(包括細胞色素c(Cyt c))從線粒體釋放，細胞會不可避免地發(fā)生凋亡[52]。

McCully等[53]報道，分離的線粒體在冰上儲存超過1 h后活性顯著降低，因此快速操作至關(guān)重要。如果可以使用儲存的線粒體進行移植，而不是每次使用前即時分離線粒體，線粒體移植的臨床應(yīng)用價值將顯著提高。Gnaiger等[54]提出，將線粒體冷藏儲存在HEPES-蔗糖的緩沖液24 h后，線粒體呼吸能力仍能保持在80%以上。此外，在保存緩沖液中添加Cyt c可使線粒體呼吸能力在冷藏24 h內(nèi)保持不變。另有一些研究探討了大鼠肝臟中分離的線粒體儲存在Eurocollins和UW溶液中的情況[55-57]：當線粒體儲存在Eurocollins溶液中時，可以觀察到線粒體的擴張，且由于缺乏抗氧化劑，復(fù)合物III和IV的活性喪失；而UW溶液含有抗氧化劑(如別嘌呤醇、腺苷和谷胱甘肽)，它可以使分離的線粒體的Cyt c的含量和復(fù)合物II的活性在儲存24 h內(nèi)保持不變。Greiff等[58]則研究了冷凍儲存在二甲基亞砜(DMSO)或甘油中線粒體的功能：線粒體儲存在-65 ℃以下10%DMSO中18天或10%甘油中15天時，其氧化磷酸化能力保持不變。Nukala及其同事[59]評估了線粒體在-80 ℃的10%DMSO保存溶液中冷凍1周后的活性，結(jié)果表明含有DMSO的保存溶液保留了線粒體的氧化磷酸化能力。另外，與正常線粒體相比，在10%DMSO中儲存的線粒體的Cyt c的含量減少。線粒體儲存在30%甘油中時其氧化磷酸化能力喪失，而儲存在30%DMSO中時其氧化磷酸化能力得以保留，表明DMSO的毒性低于甘油[58]。與正常線粒體活性相比，當使用DMSO儲存線粒體時，線粒體活性仍是降低的[59]。綜上所述，DMSO的優(yōu)點是可以防止凍融時線粒體膜的損傷，但缺點是不能保留Cyt c。Yamaguchi等[60]探討了海藻糖對線粒體冷凍保存的保護作用，線粒體在蔗糖/甘露醇緩沖液中解凍后15 min內(nèi)釋放95%的細胞色素c，而使用海藻糖時，可以在解凍后45 min內(nèi)保留大約95%的Cyt c。此外，該研究表明線粒體在海藻糖中冷凍保存時不會誘導細胞凋亡，然而其ATP合成能力和線粒體呼吸能力降低至正常水平的30%左右。因此，我們顯然需要開發(fā)一種新的線粒體儲存方案來保持線粒體的正常生物活性。

6 結(jié)論

線粒體功能障礙是心肌缺血損傷的主要特征。缺血下的線粒體異常包括線粒體的結(jié)構(gòu)、功能、鈣離子、線粒體蛋白、能量合成、mtDNA結(jié)構(gòu)、轉(zhuǎn)錄組的改變。線粒體移植治療應(yīng)用有活性的、呼吸能力強的線粒體取代缺血心臟中受損的線粒體，這種新的治療方法已被證明可以減輕心肌梗死的嚴重程度，改善細胞生存能力。心肌線粒體移植的已知機制包括增加心肌ATP含量、刺激細胞因子的釋放以及替換受損的mtDNA。此外，線粒體分離是一種簡單、快速的技術(shù)，這為線粒體移植治療的推廣提供了實際基礎(chǔ)。線粒體移植的潛在應(yīng)用對象比比皆是，因為線粒體損傷是包括阿爾茨海默病，帕金森病，肝、腎、腦和心肌缺血性損傷，以及罕見的線粒體遺傳性疾病在內(nèi)的大量疾病的基礎(chǔ)。

盡管線粒體移植治療發(fā)展迅速，也已被證明是有益的，但是在廣泛推廣使用之前，仍有許多非常重要的問題亟需解決。目前線粒體結(jié)合到宿主細胞的機制仍未被完全了解。一些實驗室發(fā)現(xiàn)，線粒體與受體細胞體外共同培養(yǎng)即可刺激外源線粒體的吸收，并增加受體細胞的活力，而另一些實驗室則未發(fā)現(xiàn)這種線粒體的結(jié)合。這是否是由于不同的研究之間存在重大技術(shù)差異，或者有其他混淆因素尚不清楚。多項研究表明，只有受損的細胞能夠吸收外源性線粒體。然而，同樣有多個研究觀察到健康細胞對線粒體的吸收。宿主細胞的損傷類型也可能是一個關(guān)鍵因素，細胞是否經(jīng)歷外源性的壓力、mtDNA是否耗竭、ETC是否受損害，這些都可能決定細胞是否可以吸收線粒體。

線粒體移植是一個充滿前景的治療方法，為缺血性心臟病的治療提供了寶貴的策略，并為人們更深入了解線粒體的功能和治療潛力打開了大門。未來需要更多基礎(chǔ)和臨床研究來驗證該治療的安全性和長期結(jié)果。