1株發(fā)光桿菌Photorhabdus asymbiotica的次級代謝產(chǎn)物研究

盧宇 閆璧瀅 陳渝川 朱小紅 李妍 司書毅 陳明華,* 袁麗杰,*

(1 華北理工大學 基礎(chǔ)醫(yī)學院，河北省慢性疾病基礎(chǔ)醫(yī)學重點實驗室，唐山市慢性病臨床基礎(chǔ)研究重點實驗室，唐山 063210；2 中國醫(yī)學科學院 北京協(xié)和醫(yī)學院 醫(yī)藥生物技術(shù)研究所，北京 100050)

近年來，細菌耐藥問題日益嚴峻。據(jù)統(tǒng)計，每年大概有70萬人因抗生素耐藥死亡，嚴重威脅著人類的健康[1]。2017年，世界衛(wèi)生組織(WHO)公布了一份抗生素耐藥優(yōu)先病原體清單，其中大多數(shù)為革蘭陰性細菌病原體[2]，這些病原體對人類健康構(gòu)成巨大威脅。革蘭陰性菌相對于革蘭陽性菌具有獨特的外膜結(jié)構(gòu)，只有少數(shù)抗生素能穿透其外膜。因此，對于革蘭陰性菌耐藥患者可選擇的抗生素則更少[3-4]。隨著抗革蘭陰性菌“最后一道防線”——多黏菌素耐藥株的出現(xiàn)，臨床迫切需要新型抗生素來戰(zhàn)勝耐藥細菌。

微生物次級代謝產(chǎn)物是抗生素的最大源泉[5-6]。昆蟲病原線蟲共生菌是一種寄生在昆蟲病原線蟲腸道內(nèi)的腸桿菌科細菌，主要包括發(fā)光桿菌屬(Photorhabdussp.)和致病桿菌屬(Xenorhabdussp.)[7]。昆蟲病原線蟲共生菌隨病原線蟲一同進入到昆蟲體內(nèi)，而后共生菌從線蟲體內(nèi)大量釋放出來，一方面共生菌產(chǎn)生代謝產(chǎn)物來協(xié)助線蟲感染宿主昆蟲，導致宿主昆蟲死亡；另一方面，昆蟲死亡后，共生菌還要釋放一些抗菌物質(zhì)來抵御環(huán)境微生物的入侵，為線蟲的生長繁殖提供營養(yǎng)物質(zhì)的保障[8-9]。因此，通過共生細菌-線蟲-昆蟲這一特殊的生存關(guān)系表明，昆蟲病原線蟲共生菌的次級代謝產(chǎn)物可能會產(chǎn)生許多具有藥用價值，特別是具有抗菌活性的次級代謝產(chǎn)物。

光桿菌屬(Photorhabdussp.)的次級代謝產(chǎn)物主要有碳青霉烯類、蛋白和肽類、二苯乙烯衍生物、兒茶酚類的鐵載體物質(zhì)等，其中不乏極具應(yīng)用潛力的抗菌、抗瘧原蟲、抗病毒，以及細胞毒性物質(zhì)等[10-12]。研究表明，從Photorhabdus luminescens中分離得到的一種新的環(huán)氧化物2-isopropyl-5-(3-phenyl-oxiranyl)-benzo-1,3-diol，對大腸埃希菌、化膿性鏈球菌、枯草芽胞桿菌和金黃色葡萄球菌均具有抑菌活性，MIC為6.25～12.5 μg/mL[13]；從Photorhabdus temperata中分離得到的蒽醌類化合物1,3,8-trihydroxy-9,10-anthraquinone和3,8-dihydroxy-1-methoxy-9,10-anthraquinone，可通過減少IL-6、TNF-α和NO來抑制小鼠小膠質(zhì)細胞(BV2)中干擾素γ誘導的神經(jīng)炎癥[14]。因此，挖掘光桿菌屬的次級代謝產(chǎn)物可能會獲得創(chuàng)新型藥物的先導化合物。

本研究以抗大腸埃希菌活性為導向，對1株發(fā)光桿菌屬細菌Photorhabdus asymbioticaATCC43950進行了活性成分的分離，從中得到了3個化合物，分別鑒定為darobactin(1)、環(huán)(L-脯氨酸-L-苯丙氨酸)(2)和環(huán)(L-色氨酸-L-脯氨酸)(3)(圖1)，并對它們進行了抗菌活性測定，發(fā)現(xiàn)化合物1對大腸埃希菌、肺炎克雷伯菌和鮑曼不動桿菌均具有顯著的抗菌活性。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 儀器與試劑[15]

儀器：核磁共振(NMR)波譜儀(Bruker AVIIIHD-600 MHz，美國Bruker公司)；HPLC-MS聯(lián)用儀(Agilent 1100 series LC/MSD，美國Agilent公司)；高效液相色譜儀(Shimadzu LC-20AT，日本Shimadzu公司)；旋光測試儀(Autopol IV-T，美國Rudolph Research Analytical)；冷卻水循環(huán)裝置(EYELA CA-1116A，上海愛朗儀器有限公司)；恒溫振蕩器(THZ-98C，上海一恒科學儀器有限公司)；潔凈工作臺(BCM-1000A，蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司)；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(BUCHI R-300，瑞士Buchi公司)。

分離填料及試劑：大孔吸附樹脂HP-20 (日本Mitsubishi Chemical)；ODS-AQ-HG(s-50 μm,日本YMC公司)；微孔吸附樹脂MCI gel (CHP20/P120系列120 μm，日本Mitsubishi Chemical)；反相C18分析型色譜柱(Capcell Pak AQ,5 μm,4.6 mm× 150 mm，日本Shiseido Company)；反相C18半制備型色譜柱(Capcell Pak AQ,5 μm,10 mm× 250 mm；Capcell Pak PFP,5 μm,10 mm× 250 mm，日本Shiseido Company)；分析純乙醇(北京通廣精細化工廠)；色譜純乙腈(上海星可高純?nèi)軇┯邢薰?；氘代DMSO(德國Merck公司)；實驗用蒸餾水(廣州屈臣氏食品飲料有限公司)。

培養(yǎng)基：NB培養(yǎng)基N8300(北京索萊寶科技有限公司)；LB肉湯培養(yǎng)基L8291(北京索萊寶科技有限公司)；TSB培養(yǎng)基LA0020(北京索萊寶科技有限公司)；A2液體培養(yǎng)基(葡萄糖5 g/L、酵母提取物5 g/L、牛肉膏5 g/L、蛋白胨5 g/L、黃豆餅粉10 g/L、玉米浸膏4 g/L、可溶性淀粉20 g/L、CaCO34 g/L、CoCl2(0.002%) 1 mL，調(diào)節(jié)pH至7.2，121℃，0.1 MPA高壓滅菌15 min)。

1.1.2 發(fā)酵菌株與檢定菌

發(fā)酵菌株P(guān)hotorhabdus asymbioticaATCC43950由商城北納創(chuàng)聯(lián)生物科技有限公司從美國菌種保藏中心(AT C C)代購。檢定菌為大腸埃希菌(Escherichia coliATCC25922)、肺炎克雷伯菌(Klebsiella pneumoniaeATCC700603)、鮑曼不動桿菌(Acinetobacter baumanniiATCC19606)和銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosaATCC27853)，以上菌株均保藏于中國醫(yī)學科學院醫(yī)藥技術(shù)研究所，國家新藥(微生物)篩選實驗室。

1.2 方法

1.2.1 發(fā)酵培養(yǎng)基篩選

將保藏的菌株P(guān)hotorhabdus asymbioticaATCC43950在NB固體培養(yǎng)基上進行復蘇，然后挑取單克隆接種到含有5mL NB液體培養(yǎng)基的培養(yǎng)管中進行培養(yǎng)，在對數(shù)生長期中，按照1:100接種到100 mL的錐形瓶中，每瓶30 mL，培養(yǎng)基分別為NB、A2、LB肉湯和TSB液體培養(yǎng)基，180 r/min進行發(fā)酵，發(fā)酵第七天取發(fā)酵液10000 r/min，離心5 min，留取上清發(fā)酵液。選取大腸埃希菌ATCC25922為檢定菌(濃度：105CFU/mL)，采用二倍稀釋法對4種不同培養(yǎng)基的發(fā)酵液進行抗菌活性檢測，首孔發(fā)酵液含量為60 μL，進行10次倍比稀釋，在37℃培養(yǎng)箱中靜置孵育過夜，以菌完全不生長判斷為具有抗菌活性。

1.2.2 菌株發(fā)酵

挑取菌株P(guān)hotorhabdus asymbioticaATCC43950單克隆轉(zhuǎn)接至3個含有100 mL發(fā)酵培養(yǎng)基(LB肉湯培養(yǎng)基，121℃，高壓滅菌15 min)的500 mL錐形瓶中，30℃，180 r/min，培養(yǎng)24 h，作為發(fā)酵種子液使用。然后進行放大發(fā)酵，準備40個2 L三角瓶，每瓶加入500 mL發(fā)酵培養(yǎng)基，121℃高壓滅菌15 min，待冷卻后使用。每瓶發(fā)酵培養(yǎng)基內(nèi)加入5 mL種子液，28℃，180 r/min條件下發(fā)酵培養(yǎng)7d。

1.2.3 分離純化

將菌株P(guān)hotorhabdus asymbioticaATCC43950的發(fā)酵液進行離心，6000 r/min，30 min，留取上清發(fā)酵液。上清發(fā)酵液經(jīng)大孔樹脂吸附柱色譜，依次用去離子水和20%、50%及100%乙醇進行梯度洗脫，利用HPLC檢測，相似流出組分進行合并，得到A～D 4個組分。利用大腸埃希菌ATCC25922作為檢定菌，采用二倍稀釋法對各個組分進行抗菌活性檢測。首孔化合物濃度為1 mg/mL，進行10次倍比稀釋，在37℃培養(yǎng)箱中靜置孵育過夜，以菌完全不生長判斷為具有抗菌活性。

將具有抗菌活性的C組分用MCI gel按質(zhì)量比1:1.5拌樣，干法上樣，進行MCI柱色譜，用10%、20%、40%、60%、80%和100%EtOH進行梯度洗脫，根據(jù)HPLC液相色譜(Capcell Pak AQ 5 μm，4.6 mm×150 mm；5%～100% ACN-含0.1% TFA的 H2O梯度洗脫30 min；1 mL/min)結(jié)果對相似流出組分進行合并，減壓濃縮得到10個亞組分(C1～C10)。根據(jù)抗大腸埃希菌活性結(jié)果，接著對亞組分C8進行ODS柱色譜，用10%、20%、40%、60%、80%和100%EtOH進行梯度洗脫，根據(jù)HPLC液相色譜結(jié)果對相似流出組分進行合并，減壓濃縮得到11個組分(C8-1～C8-11)。C8-1經(jīng)半制備HPLC (Capcell Pak PFP 10 mm× 250 mm; 17% ACN-含0.1% TFA的H2O等度洗脫；3 mL/min)得到化合物2(4.0 mg)和3(4.0 mg)。C8-2經(jīng)半制備HPLC (Capcell Pak AQ 10 mm×250 mm；18% ACN-含0.1% TFA的 H2O等度洗脫；1.5 mL/min)得到化合物1(17.3 mg)。

1.2.4 抗菌活性檢測

將化合物1～3分別溶于DMSO，配置成濃度為10 mg/mL的溶液。采用倍比稀釋法對化合物進行4種檢定菌最低抑菌濃度(minimal inhibitory concentration，MIC)的測定。參照CLSI標準[16]，采用倍比稀釋法進行藥敏實驗。在無菌的96孔板中，加入200 μL培養(yǎng)體系：LB液體培養(yǎng)基、化合物、待測菌株(濃度：105CFU/mL)?；衔锝K濃度為：100、50、25、12.5、6.25、3.125、1.56、0.78、0.39、0.2、0.1和0.05 μg/mL。37℃恒溫培養(yǎng)12 h后觀察結(jié)果，無菌生長孔中所含化合物最小的濃度為MIC，同時設(shè)立一線抗G-菌藥物多黏菌素作為陽性對照。

2 結(jié)果

2.1 發(fā)酵培養(yǎng)基篩選結(jié)果

選取NB、A2、LB肉湯和TSB液體培養(yǎng)基對菌株P(guān)hotorhabdus asymbioticaATCC43950進行培養(yǎng)，并在第三天、第五天和第七天進行取樣，對發(fā)酵上清液進行抗菌活性測定。結(jié)果表明，在培養(yǎng)至第七天時，LB肉湯和TSB發(fā)酵液分別在發(fā)酵液原液稀釋6倍和3倍時對大腸埃希菌具有較強的抑制作用，另外兩種培養(yǎng)基的發(fā)酵液未顯示出抗菌活性。因此，本研究選用LB肉湯液體培養(yǎng)基對Photorhabdus asymbioticaATCC43950進行放大發(fā)酵。

2.2 結(jié)構(gòu)鑒定及波譜數(shù)據(jù)

化合物1為白色無定形粉末，易溶于水和甲醇，[α]2D4-72 (c 0.4,MeOH)。(+)-HR-ESI-MSm/z966.4390 [M+H]+，483.7066 [M+2H]2+，分子式為C47H55N11O12。1H NMR(600 MHz,DMSO-d6): δH4.02(1H,m,H-1),3.57 (1H,dd,H-2a),3.38 (1H,overlap,H-2b,12),7.22～7.35 (8H,overlap,H-4,7,9,21,42,42',43,43'),7.16 (1H,m,H-8),2.07 (1H,dd,J=13.2,7.8 Hz,H-13a),1.98 (1H,dd,J=13.2,10.0 Hz,H-13b),5.98 (1H,brs,H-17),7.87 (1H,brs,H-19),6.96 (1H,d,J=13.2,10.0 Hz,H-13b),6.83 (1H,d,J=7.8 Hz,H-23),7.44 (1H,d,J=7.8 Hz,H-24),4.02 (1H,m,H-27),3.24-3.28 (3H,m,H-28,40a),4.17 (1H,t,J=10.2 Hz,H-30),3.03 (1H,m,H-31),2.04 (2H,m,H-32),1.87 (1H,m,H-33a),1.74 (1H,m,H-33b),2.96 (2H,m,H-34),4.46(2H,m,H-36,39),3.87 (2H,m,H-37),3.06 (1H,m,H-40b)；13C NMR (150 MHz，DMSO-d6): δC173.0(C-14,C-15),171.3 (C-35,C-38),170.4 (C-29),170.2(C-26),146.0 (C-6),137.6 (C-20,C-41),137.0 (C-22),132.9 (C-20),129.6 (C-42,C-42',C-44),128.5 (C-43,C-43'),129.4 (C-3,C-5),128.6 (C-25),126.8 (C-4,C-23),125.2 (C-19),119.2 (C-24),116.7 (C-9),112.9(C-18),112.0 (C-7),110.4 (C-3),75.8 (C-17),63.2 (C-16),62.5 (C-28),61.9 (C-30),60.5 (C-37),55.7 (C-39),54.0 (C-1),53.9 (C-12),49.1 (C-31),37.0 (C-40),26.5(C-2),25.7 (C-32,C-33)。以上數(shù)據(jù)與文獻[17]中數(shù)據(jù)對照基本一致，故鑒定該化合物為darobactin。

化合物2為白色無定形粉末，ESI-MSm/z 245[M+H]+，分子式為C14H16N2O2，1H NMR(600 MHz，DMSO-d6): δH3.26 (1H,m,H-3a)，3.38 (1H,m,H-3b)，1.72 (2H,m,H-4),2.00 (1H,m,H-5a),1.41(1H,m,H-5b),4.06 (1H,dd,J=7.8,6.0 Hz,H-6),4.34(1H,t,J=5.4 Hz,H-9),3.01 (1H,dd,J=5.4,14.4 Hz,H-10),3.06 (1H,dd,J=5.4,14.4 Hz,H-10a),7.18 (1H,m,Ar-H-4),7.23～7.27 (4H,m,Ar-H-2,3,5,6),7.97(1H,s,-NH);13C NMR(150 MHz,DMSO-d6): δC165.0(C-1),44.6 (C-3),21.9 (C-4),27.8 (C-5),58.4 (C-6),169.0 (C-7),55.8 (C-9),35.3 (C-10),137.2 (Ar-C-1),129.8 (Ar-C-2,6),127.9 (Ar-C-3,5),126.3 (Ar-C-4)。以上數(shù)據(jù)與文獻[18]中數(shù)據(jù)對照基本一致，故鑒定該化合物為環(huán)(L-脯氨酸-L-苯丙氨酸)。

化合物3為白色無定形粉末。ESI-MSm/z284[M+H]+，分子式為C16H17N3O2。1H NMR(600 MHz,DMSO-d6): δH3.37 (1H,m,H-3a),3.25 (1H,m,H-3b),1.67 (1H,m,H-4a),1.97 (1H,m,H-4b),1.38 (1H,m,H-5a),1.61 (1H,m,H-5b),4.05 (1H,dd,J=9.6,6.6 Hz,H-6),4.29 (1H,brt,J=4.8 Hz,H-9),3.08 (1H,dd,J=15.0,6.0 Hz,H-10a),3.23 (1H,m,H-10b),7.16 (1H,brd,J=2.4 Hz,H-2'),7.56 (1H,d,J=7.8 Hz,H-5'),6.95(1H,t,J=7.8 Hz,H-6'),7.04 (1H,t,J=7.8 Hz,H-7'),7.31(1H,d,J=7.8 Hz,H-8'),7.71 (1H,s,8-NH),10.85 (1H,s,1'-NH);13C NMR(150 MHz，DMSO-d6): δC165.5 (C-1),44.6 (C-3),27.7 (C-4),21.9 (C-5),58.4 (C-6),169.0(C-7),55.2 (C-9),25.8 (C-10),124.4 (C-2'),109.3 (C-3'),127.3 (C-4'),118.6 (C-5'),118.2 (C-6'),120.9 (C-7'),111.2 (C-8'),136.0 (C-9')。以上數(shù)據(jù)與文獻[19]中數(shù)據(jù)對照基本一致，故鑒定該化合物為環(huán)(L-色氨酸-L-脯氨酸)。

2.3 化合物1～3抗菌活性測定結(jié)果

化合物1對4種檢定菌均具有較強的抗菌活性，對大腸埃希菌、肺炎克雷伯菌、鮑曼不動桿菌和銅綠假單胞菌的MIC值分別為1.56、3.125、12.5和50 μg/mL；化合物2和3在100 μg/mL時對4種檢定菌均未表現(xiàn)出抑制作用。陽性對照藥多黏菌素對4種檢定菌的MIC值分別為0.06、0.5、0.25和1 μg/mL。

3 討論

本研究以抗大腸埃希菌活性為導向，從一株發(fā)光桿菌屬細菌Photorhabdus asymbioticaATCC43950的發(fā)酵液中獲得了3 個化合物。其中化合物darobactin(1)對4株革蘭陰性菌均顯示出顯著的抑制作用?；衔?在2019年首次被發(fā)現(xiàn)，是一個W1-N2-W3-S4-K5-S6-F7氨基酸序列的七肽，并且具有2個獨特的大環(huán)，其中1個由W1吲哚基團的C-7與W3的C-β通過1個醚鍵形成1個十五元環(huán)，另一個則由W3中吲哚的C-6與K5的C-β通過C-C鍵形成1個十四元環(huán)，其中W3和K5之間碳-碳鍵連接為自然界首次發(fā)現(xiàn)[17]。作用機制研究表明，darobactin靶向于外膜蛋白(outer membrane proteins,OMPs)中的β-桶狀蛋白折疊組裝輔助因子脂蛋白A(β-barrel assembly machine A protein,BamA)[20]，通過與BamA蛋白結(jié)合，穩(wěn)定了BamA的側(cè)向關(guān)閉狀態(tài)，BamA的信號結(jié)合位點被阻斷，同源底物的結(jié)合被抑制，使得新生的OMPs無法插入外膜而抑制外膜的形成，導致菌體的死亡[21]。該化合物能夠選擇性抑制革蘭陰性菌，在體外和體內(nèi)均具較強的活性，且毒性較小，是近兩年來抗生素研究的一個熱點分子。本研究從Photorhabdus asymbioticaATCC43950中發(fā)現(xiàn)了抗革蘭陰性菌活性的darobactin，豐富了該化合物的來源，也驗證了darobactin具有顯著的抗革蘭陰性菌的活性，同時也為充分開發(fā)利用昆蟲病原線蟲共生菌的次級代謝產(chǎn)物，尋找新型抗生素先導化合物提供了科學依據(jù)。