寧夏枸杞根際土壤鏈霉菌V-1-3次級代謝產(chǎn)物分析

胡運琪 馬曉莉 賈榮亮 林文星 郭歡歡 李彬 李舂龍 南澤東 吳秀麗 江志波,*

(1 北方民族大學化學與化學工程學院 化工技術基礎國家民委重點實驗室，銀川 750021；2 中國科學院西北生態(tài)環(huán)境資源研究院甘肅省寒區(qū)旱區(qū)逆境生理與生態(tài)重點實驗室，蘭州 730000；3 寧夏醫(yī)科大學藥學院，銀川 750004；4 北方民族大學實驗室建設與管理處，銀川 750021)

微生物次級代謝產(chǎn)物是新藥研發(fā)的一個重要來源。20世紀青霉素和鏈霉素研發(fā)成功后，從微生物次級代謝產(chǎn)物中發(fā)現(xiàn)新抗生素曾經(jīng)歷過黃金時代[1-2]，從放線菌,尤其是鏈霉菌次級代謝產(chǎn)物中研發(fā)出了具有抗細菌、抗病毒、抗腫瘤和免疫調(diào)節(jié)等作用的藥物[3-5]。然而，近幾十年來，以新抗生素為代表的微生物藥物開發(fā)速度明顯變緩[6]，進入21世紀以來，36個成功上市的抗生素中，直接來源于微生物次級代謝產(chǎn)物的僅有達托霉素和非達霉素[7]。形成強烈對比的是，抗生素多重耐藥及泛耐藥菌的出現(xiàn)和快速流行，導致全球每年有數(shù)百萬人死于耐藥細菌感染[8-9]。2016年5月19日，英國吉姆·奧尼爾爵士(Jim O'Neill)在《全球抗生素耐藥回顧：報告及建議》預測，如果目前的情況得不到改善，到2050年全球每年將有1000萬人死于耐藥菌感染[10]?？梢姡祟愓饾u步入“后抗生素”時代，因此，發(fā)現(xiàn)新結(jié)構(gòu)、新作用機制的抗耐藥抗生素迫在眉睫。對陸地微生物長達半個多世紀的研究中，普通生態(tài)環(huán)境放線菌次級代謝產(chǎn)物的重復篩選已成為新抗生素發(fā)現(xiàn)的瓶頸之一，從中尋找新結(jié)構(gòu)抗生素已極具挑戰(zhàn)性[11]。而深海[12]、冰川[13]、火山口[14]、紅樹林[15]等極端或特殊生態(tài)環(huán)境(簡稱“特境”)微生物的研究，拓寬了藥用微生物來源，為基于物種多樣性，發(fā)掘新次級代謝產(chǎn)物生物合成基因，進而開展新結(jié)構(gòu)抗生素發(fā)現(xiàn)奠定了基礎。

據(jù)不完全統(tǒng)計，寧夏回族自治區(qū)共有鹽堿地約263.3萬畝，其中銀川北部(簡稱寧北地區(qū))占58%，該地區(qū)常年干旱少雨，年蒸發(fā)量遠大于降水量，土壤鹽堿化十分嚴重。鹽堿土具有與普通土壤明顯不同的特點，如無機鹽組分多、pH偏堿性，土壤腐殖質(zhì)淋失，通氣和透水性不良，嚴重時導致植被難以存活[16]。鹽堿環(huán)境微生物在諸多逆境因子作用下，經(jīng)過長期演化，能獲得多種特殊的代謝能力，是發(fā)掘潛在新抗生素的藥用資源。放線菌，尤其是鏈霉菌，蘊藏著豐富的次級代謝產(chǎn)物生物合成基因，采用新一代測序技術、對其次級代謝產(chǎn)物的生物合成基因簇進行預測，已成為常用的研究方法[17-18]。前期，本課題組對寧北地區(qū)寧夏枸杞根際鹽堿土進行了微生物多樣性的分離工作，獲得了56株放線菌，根據(jù)菌株形態(tài)和16S rRNA鑒定，獲得了一株與Streptomyces alfalfae相似性較高的鏈霉菌，命名為V-1-3。本研究以發(fā)掘?qū)幈钡貐^(qū)鹽堿地鏈霉菌的次級代謝產(chǎn)物為目標，結(jié)合全基因組測序技術與HPLCQ-TOF MS分析，開展了鏈霉菌V-1-3次級代謝產(chǎn)物的預測工作。

1 材料與方法

1.1 儀器、材料及試劑

NanoDrop2000超微量分光光度計購自賽默飛世爾科技公司；SangNond SN-300顯微鏡購自深圳市叁諾西努科技有限公司；Quantus熒光計購自普洛麥格(北京)生物技術有限公司；DYY-6D電泳儀購自北京六一儀器廠；YT-CJ-1ND超凈工作臺購于北京亞泰科隆儀器有限公司；SQ810C高壓蒸汽滅菌鍋購自雅馬拓科技貿(mào)易(上海)有限公司；ZHWY-211C搖床購自上海智城分析儀器制造公司；6530 Q-TOF LC/MS液相-質(zhì)譜聯(lián)用儀購自安捷倫科技(中國)有限公司；細菌基因組DNA提取試劑盒購自上海美吉逾華生物醫(yī)藥科技有限公司；SPE-C18微型固相萃取柱購自沃特世科技(上海)有限公司；Zorbax XDB-C18(4.6 mm× 250 mm,5.0 μm) 購自安捷倫科技(中國)有限公司?？扇苄缘矸塾商旖蚴斜背皆噭S生產(chǎn)；瓊脂粉為青島高科技園海博生物技術有限公司生產(chǎn)；酵母浸膏和牛肉膏為上海博微生物科技有限公司生產(chǎn)；蔗糖為福晨(天津)化學試劑有限公司生產(chǎn)；BR級水解酪蛋白為上?，幱郎锟萍加邢薰旧a(chǎn)；其他化學試劑無特殊說明均為分析純，由天津市大茂化學試劑廠提供。

1.2 菌種來源

菌株V-1-3分離自寧夏枸杞植物根際鹽堿性土壤(東經(jīng)106°08′，北緯38°38′)，菌株保存于北方民族大學化學與化學工程學院，化工技術基礎國家民委重點實驗室，同時保存于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(China General Microbiological Culture Collection Center，CGMCC)，編號為CGMCC 23478。

1.3 培養(yǎng)基

高氏一號培養(yǎng)基：可溶性淀粉20.0 g，KNO31.0 g，K2HPO40.5 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，NaCl 0.5 g和FeSO4·7H2O 0.01 g，瓊脂20 g，蒸餾水1 L，pH 7.1～7.5。

本尼特(Bennett)液體培養(yǎng)基：酵母膏1.0 g，牛肉膏1.0 g，水解酪蛋白2.0 g，葡萄糖10.0 g，蒸餾水1 L，pH 7.3。

無鐵察氏培養(yǎng)基：NaNO33.0 g，K2HPO41.0 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，KCl 0.5 g，蔗糖30.0 g，pH自然。

PBS緩沖液：NaCl 8.0 g，KCl 0.2 g，Na2HPO41.44 g，KH2PO40.24 g，蒸餾水1 L，pH 7.4。

1.4 方法

1.4.1 菌種鑒

菌株V-1-3接種至高氏一號培養(yǎng)基觀察培養(yǎng)特征，革蘭染色觀察菌絲特征和染色特性。菌株DNA的提取按照DNA提取試劑盒的操作流程進行。16S rRNA基因PCR擴增的引物、擴增體系和反應條件參照文獻方法[19]。PCR陽性結(jié)果由生工生物工程(上海)股份有限公司完成測序。測序結(jié)果利用NCBI數(shù)據(jù)庫(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)進行16S rRNA基因相似性的比對，構(gòu)建菌株V-1-3基于16S rRNA基因的系統(tǒng)發(fā)育樹，確定菌株的分類地位。

1.4.2 菌株全基因組測序和生物合成基因簇分析

將鏈霉菌V-1-3接種到高氏一號固體培養(yǎng)基上，28℃培養(yǎng)5 d，滅菌竹簽挑取新鮮菌體接種于盛有50 mL Bennett培養(yǎng)基的150 mL三角瓶中，28℃、220 r/min培養(yǎng)48 h后離心收集菌絲體，PBS緩沖液沖洗2～3 次，液氮速凍，于-80℃中保存?zhèn)溆谩龃娴木w按照細菌DNA提取試劑盒的操作流程進行基因組DNA的提取，委托美吉生物科技有限公司進行第二代+第三代(即Illumina Hiseq+PacBio)測序以及相關組裝工作，獲得菌株基因組完成圖。利用antiSMASH v6.0.1 (https://antismash.secondarymetabolites.org)在線工具對菌株V-1-3中的次級代謝產(chǎn)物合成基因簇進行預測[20]。

1.4.3 液-質(zhì)聯(lián)用分析

①樣品制備：菌株V-1-3于液體無鐵察氏培養(yǎng)基中28℃、180 r/min發(fā)酵7 d后，5000 r/min離心20 min，取上層清液(10 mL)至微型固相萃取柱，依次使用純水、50%和95%甲醇水溶液洗脫，得到洗脫液濃縮后，用于液-質(zhì)聯(lián)用分析。②色譜條件：乙腈、水為流動相，其中乙腈在30 min內(nèi)由5%遞增至95%；色譜柱：Zorbax XDB-C18；流速為0.8 mL/min，柱溫設定為25℃。③質(zhì)譜條件：高純氮(液氮)用作霧化和干燥氣體；高純氦作為碰撞氣體；采集模式為正和負離子兩種模式；毛細管噴霧電壓設定為3.5 kV；霧化室溫度設定為320℃，霧化氣體流速為5.0 L/min；一級和二級質(zhì)譜掃描范圍分別為m/z300～2000和m/z20～2000。Autoscan模式下選擇豐度大于105的離子進行二級質(zhì)譜分析。

2 結(jié)果

2.1 菌株形態(tài)與菌屬鑒定

菌株V-1-3在高氏一號培養(yǎng)基上形成黃色、圓形、較小菌落。菌落表面褶皺，中心呈不平整凸起，四周呈絨毛狀，菌落較致密不易挑取，可產(chǎn)生不溶性黃色色素。顯微鏡下觀察，可見細長菌絲，革蘭染色陽性。16S rRNA基因比對結(jié)果及系統(tǒng)發(fā)育樹(圖1)顯示菌株V-1-3隸屬于鏈霉菌，并與Streptomyces alfalfaeXY25T具有100%同源性。

2.2 菌株基因組特征

菌株V-1-3基因組大小為8243417 bp (GenBank號：SAMN20858213)，平均(G+C)含量為72.14%，含有7578個基因，編碼基因序列總長度7285665 bp，占DNA全長88.38%。在7578個基因中，長度在101～1000 bp的基因有4776個；長度大于1000 bp的基因有2802個。此外，基因組上還檢測到了67個tRNA、18個rRNA、以及一些其他特征信息。鏈霉菌V-1-3的基因功能注釋顯示有174個為合成酶基因，主要參與聚酮類(polyketide synthases,PKSs)以及非核糖體肽類(nonribosomal peptide synthases,NRPSs)等酶的合成。

2.4 次級代謝產(chǎn)物合成相關基因簇分析

利用antiSMASH(v6.0.1)對菌株V-1-3基因組的次級代謝產(chǎn)物合成基因簇進行預測及分析，檢測到33個與次級代謝產(chǎn)物合成相關的基因簇(表1)，其中：①6個為萜類合成相關，即clusters 1、8、10、12、16和25，其中clusters 10和25分別與文獻報道的Geosmin和Isorenieratene的生物合成基因簇在全長范圍內(nèi)完全相同；②16個為非核糖體肽類合成相關，clusters 2-7、13、15、18、21、23、26、27、28、31和33，其中clusters 4、13、15和23不與其它合成基因鄰近，而clusters 2、21、26和28與T1PKS處于上下游，可能編碼雜合型化合物；此外，clusters 3和6與trans AT-PKS交合，clusters 5和7與T3PKS交合，clusters 18和27分別與Ladderane和Terpene交合，clusters 31和33與RiPP交合；③4個為單純聚酮類合成相關，即clusters 9、17、24和30；④1個為非NRPS鐵載體類合成相關，即cluster 14；⑤1個為黑色素類合成相關，即cluster 19；⑥1個為吩嗪類合成相關，即cluster 20；⑦1個tRNA依賴性環(huán)二肽類合成相關，即cluster 29；⑧2個為翻譯后修飾肽類合成相關(RiPP) 即clusters 11和32；⑨1個為嘧啶羧酸類合成相關，即cluster 22。

表1 菌株V-1-3次級代謝產(chǎn)物生物合成基因簇Tab.1 Biosynthesis gene clusters in strain V-1-3

相似度篩查發(fā)現(xiàn)，有10個和已知生物合成基因簇相似度超過50%，其中clusters 3、7、8、12和20分別與oxalomycin B(87%)、feglymycin(73%)、hopene(92%)、pentalenolactone(58%)以及undecylprodigiosin(59%)具有較高的相似度，而clusters 10,13,18,22和25分別與geosmin、coelichelin、ishigamide、ectoine和isorenieratene的生物合成基因簇相似度高達100%。

2.5 液-質(zhì)聯(lián)用分析

根據(jù)生物合成基因簇分析結(jié)果，本研究進一步采用高效液相色譜-高分辨質(zhì)譜聯(lián)用 (HPLC-Q-TOF/MS)方法對鏈霉菌V-1-3的發(fā)酵液進行分析。一級分子離子峰掃描檢測出發(fā)酵液中的主要化學成分后，利用自動化采集技術，在ESI離子源模式下，對其中豐度高于105離子采集二級質(zhì)譜，得到樣品總離子圖。對基因簇中相似度高于50%的潛在化合物的分子離子進行手動提取，結(jié)果發(fā)現(xiàn)cluster 3可能編碼并表達了化合物oxalomycin B[21]。在正負離子模式高分辨質(zhì)譜中，oxalomycin B(1)的分子離子峰被提取得到，分別為m/z656.3413 [M+H]+和654.3336 [M-H]-，與計算值之間的誤差小于5 ppm；cluster 10可能編碼了geosmin(2)[22]，該分子為易揮發(fā)單萜，在水洗樣品中有殘留，保留時間為8～9 min，準分子離子峰為m/z181.0694 [M-H]-；化合物coelichelin(3)[23]和ishigamide(4)[24]的化學結(jié)構(gòu)在總離子流圖中被提取到，且豐度高于105，提示這些結(jié)構(gòu)可能存在于發(fā)酵液中，化合物1～4的化學結(jié)構(gòu)和相關信息見圖2，二級質(zhì)譜裂解如圖3所示。

3 結(jié)論與討論

寧夏鹽堿地生物多樣性的研究報道不多，而對其它地區(qū)的鹽堿地的報道表明鹽堿環(huán)境下蘊含豐富的微生物資源。賈曉宇等[25]研究新疆濕地鹽堿土發(fā)現(xiàn)，0～50 cm土層中放線菌總數(shù)最多，大部分屬于放線菌綱中的3個亞綱：放線菌亞綱(Actinobacteridae)、酸微菌亞綱(Acidimicrobidae)和紅色桿菌亞綱(Rubrobacteridae)。閻薇如[26]自河西走廊石羊河流域5種鹽堿土壤中共分離出298株線菌，80%為鏈霉菌屬，初步篩選得出有105株放線菌對動物病原菌具有不同程度的抑菌效果。張晉龍[27]以內(nèi)蒙古赤峰寧城縣青山林場土樣為材料，分離得到63株鹽堿地放線菌，并篩選出7株高活性的可以同時拮抗真菌和細菌的菌株。于洋[28]對杜爾伯特蒙古自治縣地區(qū)的鹽堿化土壤中的放線菌進行分離得到43株鏈霉菌屬放線菌，抗真菌活性初篩得到7株具有廣譜抗菌活性的菌株。本研究采用第二代和第三代測序技術，獲得了寧夏枸杞根際鹽堿土壤來源鏈霉菌V-1-3的全基因組序列，并利用anti SMASH(v6.0.1)在線工具預測了該菌株的潛在生物合成基因簇，發(fā)現(xiàn)其具有33條生物合成基因簇，至少可編碼33種化學結(jié)構(gòu)。

HPLC-Q-TOF MS具有快速、高通量、高靈敏度和特異性強的特點，適用于發(fā)酵產(chǎn)物中已知化合物的早期識別和去重復[29]。本研究對鏈霉菌V-1-3的發(fā)酵液進行了HPLC-Q-TOF MS分析，并對生物合成基因簇與其相似度高于50%的化學組分進行提取解析，發(fā)現(xiàn)鏈霉菌V-1-3可能編碼了化合物oxalomycin B(1)、geosmin(2)、coelichelin(3)和ishigamide(4)，對后續(xù)菌株發(fā)酵產(chǎn)物的分離具有指導意義。本文預測出33條生物合成基因簇，除編碼化合物1～4之外，還存在和已知化合物生物合成基因簇相似度不高的基因簇，它們可能編碼了新結(jié)構(gòu)類型的次級代謝產(chǎn)物，說明菌株V-1-3具有發(fā)現(xiàn)新結(jié)構(gòu)天然產(chǎn)物的潛力。HPLC-Q-TOF MS技術與antiSMASH(v6.0.1)預測相結(jié)合解析菌株次級代謝產(chǎn)物的方法為新結(jié)構(gòu)抗生素的發(fā)掘提供了新思路。

致謝：感謝中國科學院西北生態(tài)環(huán)境資源研究院房嬛研究員和陳永欣副研究員在液-質(zhì)聯(lián)用測試方面提供的幫助；致謝寧夏石嘴山市委組織部、市科技局、平羅縣政府提供的掛職高層次人才科研課題的經(jīng)費支持，課題名稱：平羅縣鹽堿地生物結(jié)皮中微生物、化學多樣性研究及其在鹽堿地治理中的應用；感謝河北北方學院李小俊副教授、廣西醫(yī)科大學盧覃培博士和廣東省科學院動物研究所動物生態(tài)與進化研究中心郭敏博士對本文的修改和幫助。