一個Menkes病家系的臨床特征及基因變異分析

王越，王懷立，禚志紅

(鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院 兒科，河南 鄭州 450052)

Menkes病(Menkes disease,MD,OMIM:309400)是由于ATP7A基因(0MIM:300011)變異導(dǎo)致銅代謝紊亂所致的遺傳性神經(jīng)系統(tǒng)退行性病，呈X-連鎖隱性遺傳。該病較為罕見，國外不同國家不同時間段內(nèi)報道的發(fā)病率不一，從1/354 507到1/40 000，日本報道大約為1/357 000活產(chǎn)嬰兒[1]。目前國內(nèi)多為少數(shù)家系或者個例報道[2]，2017年北京大學(xué)第一醫(yī)院總結(jié)了24例男性MD患兒，是目前最大的中國MD患兒數(shù)據(jù)樣本[3]。現(xiàn)本研究對1個MD家系的臨床特點(diǎn)及基因變異特點(diǎn)報告如下，并結(jié)合近年來國內(nèi)外的研究進(jìn)展，探討該病特點(diǎn)。

1 對象與方法

1.1 研究對象患兒，男，出生日期2020年1月9日，就診時月齡為3個月，因“發(fā)熱、抽搐發(fā)作10 d”就診。2個月18天時首次出現(xiàn)抽搐發(fā)作，表現(xiàn)為頭偏向右側(cè)，雙眼向右凝視，四肢強(qiáng)直，雙手握拳伴抖動，面色發(fā)紺、口吐白沫，持續(xù)3～5 min緩解，伴發(fā)熱，熱峰38.5 ℃，抽搐發(fā)作每日2～3次并逐漸增加至每日3～5次?；純簽榈?胎，第1產(chǎn)，胎齡37周，順產(chǎn)娩出，出生體質(zhì)量2 700 g，出生時因窒息在NICU搶救。母孕期無異常。生后人工喂養(yǎng)，喂養(yǎng)困難。父母體健，非近親結(jié)婚，否認(rèn)家族遺傳病史。查體：發(fā)育落后，不能豎頭、追物，逗笑無反應(yīng)，哭無力，面頰飽滿(圖1)，頭發(fā)稀疏、色黃、卷曲且出生即有。膚色偏白，皮膚干燥、松弛、彈性差。四肢肌張力低，腱反射活躍，巴氏征陰性，肌肉松弛、無力。血常規(guī)、血氨、血乳酸正常，腦脊液常規(guī)、生化、病毒抗體、培養(yǎng)結(jié)果均正常。血清銅藍(lán)蛋白4.13 mg·dL-1(參考范圍15～45 mg·dL-1)，血清銅7.4 μmol·L-1(參考范圍8.51～25.63 μmol·L-1)，均降低。頭顱MRI：左側(cè)額顳部硬膜下積液(圖2)。視頻腦電圖：醒睡各期左右半球均可見大量尖波、尖慢波、棘慢波發(fā)放，左右同步或不同步發(fā)放。

臨床擬診為：MD，應(yīng)用左乙拉西坦口服液癲癇發(fā)作控制不佳，加用丙戊酸鈉口服液后癲癇發(fā)作次數(shù)逐漸減少至無發(fā)作。現(xiàn)口服左乙拉西坦與丙戊酸口服液維持，患兒10個月齡時電話隨訪，無癲癇發(fā)作，智力、運(yùn)動發(fā)育出現(xiàn)倒退，反復(fù)出現(xiàn)肺部感染。

圖1 患兒面容及頭發(fā)

圖2 患兒頭顱MRI平掃提示額顳部硬膜下積液

1.2 方法

1.2.1DNA提取 本研究經(jīng)醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)(2021-KY-0149-002)，經(jīng)患兒父母同意，抽取患兒及其父母靜脈抗凝血，使用全血DNA核酸提取試劑盒提取EDTA抗凝外周血基因組DNA(gDNA)，-20 ℃保存。

1.2.2全外顯子測序 將gDNA打斷，補(bǔ)平DNA末端，加“A”尾和接頭，構(gòu)建測序文庫，使用探針對gDNA進(jìn)行基因組全外顯子片段捕獲，進(jìn)行雙端高通量測序。

1.2.3生物信息學(xué)分析 利用Bcl2fastq(v2.0.1)工具將測序原始數(shù)據(jù)文件轉(zhuǎn)化為fastq文件，過濾接頭、低質(zhì)量序列，統(tǒng)計測序深度、覆蓋度等信息。使用工具將數(shù)據(jù)與hg19基因組比對?；贠MIM、ClinVar、HGMD和gnomAD等數(shù)據(jù)庫及人群大規(guī)模測序數(shù)據(jù)庫，對變異進(jìn)行篩選，并利用生信預(yù)測軟件進(jìn)行變異有害性預(yù)測，生成遺傳分析數(shù)據(jù)。

1.2.4遺傳分析 將注釋后數(shù)據(jù)過濾掉人群多態(tài)性位點(diǎn)，查閱OMIM、Clinvar、HGMD數(shù)據(jù)庫，結(jié)合美國醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)與基因組學(xué)會遺傳變異分類標(biāo)準(zhǔn)與指南[4-5]，綜合判斷變異的致病性。

1.2.5一代測序驗證 根據(jù)二代測序數(shù)據(jù)設(shè)計合成測序所需引物，進(jìn)行PCR擴(kuò)增并Sanger測序，測序結(jié)果與全外顯子測序后的結(jié)果進(jìn)行比對。ATP7A基因上游引物5’-ATAGATGATAGCCCCACAGGC-3’，下游引物5’-CAGCATAGGGGGTGTGTCAAA-3’。

2 結(jié)果

通過全外顯子測序及分析，發(fā)現(xiàn)患兒X染色體ATP7A基因(NM_000052)存在半合子變異，為c.2284_2285dupTT(p.Leu762Phefs*2)，位于第10號外顯子上，為移碼變異，預(yù)計會使變異型的ATP7A蛋白在第762位氨基酸由亮氨酸(Leu)變?yōu)楸奖彼?Phe)，造成該位點(diǎn)之后的蛋白質(zhì)三聯(lián)體密碼子閱讀框發(fā)生改變(圖3)。Sanger測序驗證家系共分離，結(jié)果顯示父親未攜帶上述變異，而母親攜帶(圖4)，即患兒變異遺傳自母親。ATP7A基因的c.2284_2285dupTT(p.Leu762Phefs*2)變異在dbSNP、gnomAD、ExAC、千人基因組G1000、ESP6500人群頻率數(shù)據(jù)庫中均未收錄，表明該變異頻率在全球人群極為罕見。數(shù)據(jù)庫HGMD、Clinvar均未見報道，通過PubMed文獻(xiàn)檢索亦未見該變異的相關(guān)報道。先證者存在ATP7A基因半合子變異，符合X染色體隱性遺傳疾病發(fā)病機(jī)制，結(jié)合先證者與家系成員符合家系共分離，該患兒被診斷為MD，最終確定ATP7A基因為先證者的致病基因。

圖3 患兒二代測序可視化圖譜 ATP7A基因c.2284_2285dupTT

圖4 Sanger測序圖譜

3 討論

MD又稱卷發(fā)綜合征，是一種罕見的由ATP7A基因變異引起的X連鎖隱性遺傳病。該病最早由Menkes等[6]在1962年報道。ATP7A基因編碼的蛋白稱為ATP7A酶，是一種P型跨膜銅離子轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，該蛋白主要在腸黏膜上皮細(xì)胞中表達(dá)，其作用是將腸黏膜上皮細(xì)胞內(nèi)的銅排至細(xì)胞外液供機(jī)體利用。ATP7A基因變異導(dǎo)致ATP7A酶功能缺陷，影響腸黏膜銅的吸收，導(dǎo)致機(jī)體銅缺乏，降低銅相關(guān)酶的活性，從而引起多系統(tǒng)功能障礙[7]。

根據(jù)臨床表現(xiàn)不同，MD可分為經(jīng)典型、輕型、枕角綜合征，其中經(jīng)典型患兒占90%～95%。絕大多數(shù)為男性患者。經(jīng)典型MD在嬰兒期發(fā)病，主要臨床表現(xiàn)為特征性卷發(fā)、進(jìn)行性加重的神經(jīng)系統(tǒng)退行性變性、結(jié)締組織異常等。新生兒期因臨床表現(xiàn)不特異容易被忽視。國外報道新生兒期的臨床特征包括黃疸時間延長、體溫過低、肌張力減退、低血糖和出生時喂養(yǎng)困難等。國內(nèi)有研究表明中國MD患兒中早產(chǎn)和窒息常見。本例患兒為男性，出生時有窒息史，且有喂養(yǎng)困難，與上述報道一致。特征性的皮膚毛發(fā)表現(xiàn)為膚白、頭發(fā)稀疏、顏色淺、容易斷、發(fā)量少，主要分布在頭頂部[8]。本例患兒出生時即出現(xiàn)頭發(fā)稀疏、色淺、卷曲。結(jié)締組織異常表現(xiàn)為皮膚干燥、松弛、腹股溝疝、臍疝、膀胱扭轉(zhuǎn)、肌張力低下、關(guān)節(jié)過度活動或脫位，血管走形迂曲，累及全身各處血管，以顱內(nèi)血管為著[9]，頸內(nèi)靜脈擴(kuò)張及肱動脈動脈瘤均有報告。骨骼異常表現(xiàn)為骨畸形、骨質(zhì)減少和長骨骨折。干骺端骨折、肋骨骨折和顱骨骨折常被誤診為虐待兒童[10]。本研究患兒皮膚干燥、松弛、彈性差，四肢肌張力低下，肌肉松弛無力，與文獻(xiàn)報道一致。

神經(jīng)系統(tǒng)受累表現(xiàn)為癲癇發(fā)作、神經(jīng)發(fā)育遲滯、倒退。一般在2～3個月左右開始出現(xiàn)發(fā)育遲滯、癲癇發(fā)作，感染或發(fā)熱會觸發(fā)癲癇發(fā)作。癲癇發(fā)作可分為3期[11]，表現(xiàn)形式多樣，較難治，多種抗癲癇發(fā)作藥物聯(lián)合應(yīng)用控制不佳，腦電圖呈中至重度異常。本研究患兒癲癇起病2個月18天，起病前出現(xiàn)發(fā)熱，抽搐發(fā)作形式、腦電圖特點(diǎn)均與上述報道相符。隨訪發(fā)現(xiàn)患兒神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育遲滯嚴(yán)重，并出現(xiàn)倒退，提示顱內(nèi)病變較重，但是該患兒口服2種抗癲癇發(fā)作藥物后未再有抽搐發(fā)作，與其他臨床表現(xiàn)不平行。國內(nèi)也有類似報道[8]，考慮可能與嚴(yán)重腦萎縮及硬膜下積液有關(guān)。但是本研究患兒后期并未再次復(fù)查頭顱MRI平掃影像學(xué)檢查，尚不能明確顱內(nèi)是否有嚴(yán)重腦萎縮病變。

血清學(xué)檢查表現(xiàn)為血清銅藍(lán)蛋白、銅減低。本研究患兒血清銅藍(lán)蛋白和銅均減低，符合MD特征。但是上述指標(biāo)在6個月以下的嬰兒中通常也偏低，也導(dǎo)致MD新生兒期早期診斷面臨困難。國外報道分析血漿中兒茶酚胺可以較準(zhǔn)確地篩查新生男嬰中MD患兒[12]。影像學(xué)檢查在MD診斷中有重要作用，典型影像學(xué)改變?yōu)椋猴B內(nèi)血管迂曲、腦白質(zhì)異常、腦萎縮、硬膜下積液等，其中顱內(nèi)血管迂曲是MD最突出的表現(xiàn)之一，具有診斷意義[13]。該患兒早期行頭顱MRI檢查發(fā)現(xiàn)單側(cè)硬膜下積液，符合上述改變，但是未進(jìn)行頭顱MRA檢測以及后期隨訪未動態(tài)觀察頭顱MRI改變，缺乏血管改變資料。

確診MD依靠基因檢測。ATP7A基因變異導(dǎo)致蛋白功能缺失，是引起MD的根本原因。ATP7A與ATP7B蛋白是細(xì)胞跨膜運(yùn)輸銅的特異性ATP酶，與銅的分泌途徑有關(guān)[14]。銅本身是機(jī)體代謝途徑中關(guān)鍵酶所必須的元素，其代謝異常時容易對細(xì)胞產(chǎn)生毒副作用，影響兒茶酚胺的生物合成和結(jié)締組織的成熟，從而導(dǎo)致嚴(yán)重的疾病[15-16]。ATP7B主要在肝表達(dá)，而ATP7A在除肝外的幾乎所有器官表達(dá)。 因此，ATP7B變異導(dǎo)致的Wilson疾病主要影響肝，而MD則是全身性疾病[17]。

ATP7A基因位于染色體Xq21.1，包括23個外顯子，分布在大約140 kb的基因組DNA上。目前ATP7A被LOVD開放數(shù)據(jù)庫收錄了452個公開報道的基因變異(https://databases.lovd.nl/shared/genes/ATP7A)，以錯義變異為主。Kaler等[18]對gnomAD人群數(shù)據(jù)庫的突變類型統(tǒng)計發(fā)現(xiàn)約43%為錯義突變，剪切突變、移碼突變、無義突變等均在人群中頻率小于0.2%，提示稀有變異難以在人群中存活，而致病性較強(qiáng)。本研究通過全外顯子測序及分析發(fā)現(xiàn)患兒ATP7A基因變異位于第10號外顯子上，為c.2284_2285dupTT，屬于移碼變異，預(yù)計會導(dǎo)致蛋白質(zhì)從第762位氨基酸發(fā)生翻譯紊亂，可能形成截短蛋白，從而導(dǎo)致ATP7A蛋白功能缺陷，導(dǎo)致腸黏膜銅吸收障礙，使體內(nèi)廣泛性銅缺乏，從而引起多系統(tǒng)功能障礙。研究表明，75%患者的母親是攜帶者，其余25%是新生突變[18]。本研究患兒存在半合子變異，通過對患兒父母進(jìn)行一代Sanger測序驗證，父親未攜帶上述變異，而母親攜帶，即患兒變異遺傳自母親。目前該突變類型國內(nèi)外尚未見報道。

雖然大多數(shù)經(jīng)典型在3歲內(nèi)死亡，但是部分持續(xù)治療的患兒可以存活到十幾歲[19]。因此，MD早期診斷、早期治療特別關(guān)鍵。目前尚無根治性手段，口服銅治療是無效的，皮下或靜脈途徑給予組胺銅治療被證明安全有效。國外研究顯示，如果在嬰兒3周以內(nèi)就開始治療，某些患者的神經(jīng)退行性變可以得到有效的減輕。組氨銅治療可以有效逆轉(zhuǎn)皮膚和頭發(fā)的變化，但是治療結(jié)果取決于治療的開始時間和殘存的ATP7A功能。只有在新生兒期開始治療，組氨酸銅治療才能有效地提高生存率和減輕疾病的神經(jīng)負(fù)擔(dān)[12]。國內(nèi)尚無組氨銅藥物，尚缺乏治療資料。

MD是一種ATP7A基因變異導(dǎo)致的X連鎖隱性遺傳病。經(jīng)典型MD患者在嬰兒期發(fā)病，主要臨床表現(xiàn)為特征性卷發(fā)、神經(jīng)系統(tǒng)退行性變性、結(jié)締組織異常，多在3歲內(nèi)死亡。本研究利用全外顯子測序發(fā)現(xiàn)ATP7A基因第10外顯子核苷酸第2 284～2 285位堿基存在c.2284_2285dupTT移碼突變，為致病變異，且國內(nèi)外未見報道，豐富了ATP7A基因的變異譜，有助于深入了解該基因的結(jié)構(gòu)與功能。