原發(fā)性中樞神經(jīng)系統(tǒng)淋巴瘤血漿miR-21 和miR-222 的表達(dá)及其與預(yù)后的關(guān)系

徐慧雯 王珍珍 李 情 馬晶晶 陳 錕 林之光 馬 燕 陳波斌△

（1復(fù)旦大學(xué)附屬華山醫(yī)院血液科 上海 200040；2復(fù)旦大學(xué)附屬華山醫(yī)院北院血液科，3檢驗(yàn)科 上海 201907）

原發(fā)性中樞神經(jīng)系統(tǒng)淋巴瘤（primary central nervous system lymphoma，PCNSL）是一種非常罕見的非霍奇金性淋巴瘤（non-Hodgkin lymphoma，NHL），約占NHL 發(fā)病的1%，占原發(fā)性顱內(nèi)腫瘤發(fā)病的2%～3%［1-2］。90%以上的PCNSL 在病理類型上屬于彌漫大B 細(xì)胞淋巴瘤（diffuse large B-cell lymphoma，DLBCL）。隨著化療、放療、自體造血干細(xì)胞移植等治療方法的不斷改進(jìn)，以及新型靶向藥物的應(yīng)用，PCNSL 的生存率有了較大的提高，但5年生存率（約38%）仍較低，是預(yù)后最差的淋巴瘤亞型 之 一［3］。 以 大 劑 量 甲 氨 蝶 呤（high-dose methotrexate，HD-MTX）為基礎(chǔ)的化療是目前治療PCNSL 的一線化療方案。盡管基于HD-MTX 的治療方案對(duì)于多數(shù)患者有效，但僅少數(shù)患者可獲得持久的緩解，PCNSL 總體療效欠佳。

PCNSL 具有異質(zhì)性，不同患者預(yù)后差別較大，尋找合適的生物學(xué)指標(biāo)以準(zhǔn)確地判斷患者的預(yù)后，按照疾病危險(xiǎn)分層進(jìn)行治療，有助于改善PCNSL患者的生存。根據(jù)國際結(jié)外淋巴瘤研究組的研究，目前對(duì)于PCNSL 的預(yù)后判斷主要包括5 個(gè)獨(dú)立的影響因子：年齡、ECOG 體能狀態(tài)評(píng)分（performance status，PS） 、血 清 乳 酸 脫 氫 酶（lactate dehydrogenase，LDH）水平、腦脊液蛋白含量、腦深部區(qū)域累及［4-5］。目前的預(yù)后評(píng)分系統(tǒng)以臨床和生化特征為基礎(chǔ)，對(duì)PCNSL 預(yù)后的判斷存在一定的局限性。因此，進(jìn)一步尋找新的可靠的生物標(biāo)志物，以評(píng)估PCNSL 患者的治療反應(yīng)及預(yù)后具有重要意義。

MicroRNAs（miRNAs）是 一 種 小 的 非 編 碼RNA 分子，可以通過與靶mRNA 的互補(bǔ)區(qū)域結(jié)合來抑制mRNA 翻譯。目前研究發(fā)現(xiàn)miRNAs 與多種實(shí)體腫瘤以及包括DLBCL 在內(nèi)的多種血液系統(tǒng)腫瘤預(yù)后有關(guān)。有研究報(bào)道m(xù)iR-21 和miR-222 與DLBCL 預(yù)后相關(guān)，是DLBCL 預(yù)后標(biāo)志物之一，但miRNAs 在PCNSL 中研究較少［6-7］。曾有研究發(fā)現(xiàn)PCNSL 患者腦脊液及血漿中miR-21 表達(dá)水平異常升高，但對(duì)PCNSL 的預(yù)后作用尚存在爭(zhēng)議［3，8］。本研究進(jìn)一步探索miRNAs 在PCNSL 預(yù)后評(píng)估中的作用，通過檢測(cè)PCNSL 患者在初治前血漿miR-21和miR-222 的表達(dá)水平，分析其與PCNSL 預(yù)后的關(guān)系，明確血漿miR-21 和miR-222 作為PCNSL 預(yù)后生物標(biāo)志物的價(jià)值。

資料和方法

研究對(duì)象回顧性納入2011 年9 月至2016 年12 月期間復(fù)旦大學(xué)附屬華山醫(yī)院確診的PCNSL 患者共41 例。所有患者均為免疫功能正常人群、有明確的組織或細(xì)胞病理學(xué)證據(jù)，臨床資料完整，且留存有首次化療前外周血標(biāo)本。本研究獲復(fù)旦大學(xué)附屬華山醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（批準(zhǔn)號(hào)：2017-325），所有受試者均簽署書面知情同意書。

樣品采集在化療開始前采集外周血標(biāo)本，2 000 r/min 離心5 min，離心半徑為22.5 cm，分離上層血漿，凍存于-80 ℃保存。

qRT-PCR 檢測(cè)血漿miR-21 及miR-222 表達(dá)水平采用mirVana ?miRNA 分離試劑盒（美國Thermo Fisher Scientific 公司）從血漿樣品中提取總RNA。用Takara PrimeScript RT Master Mix 試劑盒（日本Takara 公司）逆轉(zhuǎn)錄獲得cDNA。MX3000 P Real-time PCR 儀器（德國Stratagene 公司）進(jìn)行qRT-PCR 擴(kuò) 增，加 入miR-21 和miR-222 特 異 性 引物（IBSBIO-1978021，IBSBIO-1978222，上海艾博思生物技術(shù)有限公司）。反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性3 min后，94 ℃變性20 s、62 ℃退火及延伸40 s，共40 個(gè)循環(huán)。以cel-miR-39 作為內(nèi)參，每組取3 個(gè)復(fù)孔Ct 均值做計(jì)算，通過2-ΔΔCt方法分析數(shù)據(jù)。

臨床資料收集及隨訪收集病史資料，包括患者性別、身高、體重、初次診斷時(shí)年齡、確診時(shí)間、病理檢測(cè)結(jié)果、病理獲取方法、可能與預(yù)后相關(guān)的指標(biāo)（包括ECOG PS 評(píng)分、腦脊液壓力、腦脊液常規(guī)及生化檢查結(jié)果、LDH 水平、血β2微球蛋白）以及收集患者病情進(jìn)展/復(fù)發(fā)時(shí)間，若已死亡則收集其死亡時(shí)間等。末次隨訪時(shí)間截至2019 年1 月。

統(tǒng)計(jì)學(xué)分析計(jì)量資料以±s、中位數(shù)和百分位數(shù)等表示。分類資料統(tǒng)計(jì)使用χ2檢驗(yàn)。使用Kaplan-Meier 繪制生存曲線；單因素和多因素分析分別使用Log-rank 檢驗(yàn)和Cox 回歸分析。采用14.2版STATA 進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

入組患者臨床特點(diǎn)根據(jù)病理和影像學(xué)檢查結(jié)果共納入41 名新確診為PCNSL 的患者。患者中位年齡為56 歲，其中58.54%為男性。DLBCL 是最常見的病理診斷類型（占90.24%）?；颊咂鸩r(shí)最常表現(xiàn)的臨床癥狀為：顱高壓（48.78%）、運(yùn)動(dòng)障礙（48.78%）、認(rèn)知障礙（39.02%）、視力障礙（29.27%）和言語障礙（21.95%）等。所有患者均接受以HDMTX 為基礎(chǔ)的化療方案，其中接受HD-MTX 單藥治療的患者占26.83%，HD-MTX 與Vm26、利妥昔單抗以及伊達(dá)比星聯(lián)合使用的患者分別占41.46%、21.95% 及9.76%。表1 總結(jié)了41 例患者的臨床特征。

表1 41 例PCNSL 患者的一般臨床資料Tab 1 Clinical characteristics of 41 PCNSL patients ［n（%）］

血漿miR-21 和miR-222 表達(dá)水平與PCNSL 患者的臨床病理特征比較以cel-miR-39 為內(nèi)參，本隊(duì)列以miR-21 相對(duì)表達(dá)量的中位數(shù)1.17、miR-222相對(duì)表達(dá)量的中位數(shù)0.86 作為界值，將患者分為miR-21 高表達(dá)和低表達(dá)組、miR-222 高表達(dá)和低表達(dá)組。對(duì)miR-21 兩組間及miR-222 兩組間患者的年齡、性別、病理類型、腫瘤深部累積、LDH 水平、ECOG 評(píng)分等臨床病理特征分別進(jìn)行分析，結(jié)果表明miR-21 兩組間以及miR-222 兩組間的患者在以上臨床特征方面均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（表2）。

表2 miR-21 和miR-222 表達(dá)水平與PCNSL 患者的臨床病理特征比較Tab 2 Comparison of plasma miR-21 and miR-222 with clinicopathological characteristics of PCNSL （n）

血漿miR-21 和miR-222 對(duì)PCNSL 的預(yù)后評(píng)估價(jià)值本研究中位隨訪時(shí)間為44.47 個(gè)月，入組患者的中位PFS 和OS 值分別為18.7 和47.1 個(gè)月。生存分析顯示，miR-21 高表達(dá)組中位PFS 較長(zhǎng)，達(dá)到22.63 個(gè)月，顯著長(zhǎng)于miR-21 低表達(dá)組的15.5 個(gè)月，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.049，圖1A）。但是兩組間的中位OS 并無顯著差異（47.27 個(gè)月vs.47.1 個(gè)月，P=0.397，圖1B）。同樣，根據(jù)miR-222 表達(dá)水平將患者分成兩組，對(duì)miR-222 高表達(dá)及低表達(dá)組患者進(jìn)行生存分析，Kaplan-Meier 曲線顯示兩組患者間的PFS 和OS 差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，中位PFS 分別為18.37 和19.8 個(gè) 月，中 位OS 分 別 為47.87 和44.2 個(gè)月（圖1C 和1D），差異也無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

圖1 血漿miR-21 和miR-222 表達(dá)對(duì)PCNSL 患者生存的影響Fig 1 Kaplan-Meier curves of PCNSL patients with different expression level of miR-21 or miR-222

PCNSL 患者預(yù)后的單因素分析為了明確各種因素對(duì)PCNSL 患者PFS 及OS 的影響，我們對(duì)可能影響PCNSL 預(yù)后的臨床特征分別進(jìn)行單因素分析（表3）。結(jié)果表明ECOG 評(píng)分≤1 組中位PFS 為29.67 個(gè)月，長(zhǎng)于ECOG 評(píng)分≥2 組（15.5 個(gè)月），差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.018，圖2A）。LDH 正常的患者中位PFS 為25.83 個(gè)月，而LDH 異常升高的患者中位PFS 僅有16.4 個(gè)月（P=0.002，圖2B），但兩組患者的OS 無顯著差異。分析不同用藥組間的生存差異，結(jié)果表明HD-MTX 與Vm26 聯(lián)合的患者中位PFS 為26.43 個(gè)月，高于HD-MTX 單藥組14.47個(gè)月（P=0.003，圖2C），但兩組間OS 無差異。其他因素的分析結(jié)果見表3。

表3 單因素分析PCNSL 預(yù)后影響因素Tab 3 Prognostic factors for survival in PCNSL by univariate analysis

圖2 影響PCNSL 預(yù)后的危險(xiǎn)因素的Kaplan-Meier 曲線Fig 2 Kaplan-Meier curves of PCNSL patients with prognostic risk factors

PCNSL 患者預(yù)后的多因素分析將單因素分析中對(duì)PCNSL 患者PFS 有顯著影響的指標(biāo)，包括miR-21 表 達(dá) 水 平、ECOG PS 評(píng) 分、LDH 水 平 以 及HD-MTX 與Vm26 聯(lián)合用藥方案，以及對(duì)PCNSL預(yù)后較為公認(rèn)的影響因素年齡，納入COX 回歸進(jìn)行多因素分析。將自變量miR21≥1.17、miR222≥0.88、ECOG PS 評(píng) 分≥2、LDH＞225、年齡≥55 歲以及采用Vm26 賦值為1，我們進(jìn)行了比例風(fēng)險(xiǎn)假設(shè)（即PH 假設(shè)），所有P值均＞0.05，滿足Cox 回歸的等比例風(fēng)險(xiǎn)模型的條件；將因變量PFS 中疾病復(fù)發(fā)或進(jìn)展的結(jié)局賦值為1，疾病未進(jìn)展的結(jié)局賦值為0。結(jié)果表明miR21 表達(dá)水平、ECOG PS 評(píng)分水平以及LDH 水平HD-MTX 是影響PCNSL 患者PFS的獨(dú)立預(yù)后因素（表4），COX 回歸進(jìn)一步說明血漿miR-21 具有PCNSL 預(yù)后評(píng)估潛能。

表4 多因素分析PCNSL 的預(yù)后影響因素Tab 4 Multivariate analysis of prognostic factors of PCNSL

討 論

自20 世紀(jì)90 年代發(fā)現(xiàn)miRNAs 以來，miRNAs已被證實(shí)在多種血液腫瘤的發(fā)生發(fā)展中起作用［9］。異常表達(dá)的miRNAs 除了存在于腫瘤組織，還能在腦脊液、外周血等體液中檢測(cè)到。因此miRNAs 有望成為腫瘤診斷及預(yù)后的生物標(biāo)志物。miR-21 是最早發(fā)現(xiàn)在腫瘤中高表達(dá)的miRNAs 之一，包括DLBCL 在內(nèi)的多種腫瘤均檢測(cè)到異常表達(dá)的miR-21，但miR-21 在PCNSL 中的研究仍舊較少［6］。曾有研究報(bào)道，PCNSL 患者腦脊液中miR-21 水平顯著高于對(duì)照組，診斷靈敏度為97.4%，腦脊液miR-21 被認(rèn)為對(duì)PCNSL 具有診斷價(jià)值［10-11］；然而，外周血miR-21 在評(píng)估PCNSL 預(yù)后方面的作用仍存在爭(zhēng)議［12-14］。因 此，本 研 究 收 集 并 隨 訪PCNSL 患 者 信息，檢測(cè)外周血miR-21 表達(dá)水平，通過生存分析發(fā)現(xiàn)miR-21 可能是PCNSL 的獨(dú)立預(yù)后因素，為明確miR-21 對(duì)PCNSL 預(yù)后的影響提供了新的依據(jù)。

本研究結(jié)果顯示，血漿miR-21 高表達(dá)組患者有更好的PFS，但對(duì)OS 的影響不大?？赡苁且?yàn)榛颊咴诩膊∵M(jìn)展后采用的治療方案異質(zhì)性較大，多種因素對(duì)預(yù)后產(chǎn)生了影響，故我們認(rèn)為miR-21 用以評(píng)估PCNSL 患者疾病早期進(jìn)展具有一定臨床價(jià)值。miR-21 在腫瘤發(fā)病中的作用機(jī)制較為復(fù)雜，研究表明miR-21 既能夠通過上調(diào)STAT3、AP1 等促癌基因，下調(diào)PTEN、SPRY2、PDCD4 等抑癌基因，刺激腫瘤微環(huán)境中的Treg 逃逸免疫監(jiān)視促進(jìn)腫瘤發(fā)生，也能夠促進(jìn)P53 抑癌基因的轉(zhuǎn)錄與表達(dá)［15-18］。本研究結(jié)果提示miR-21 優(yōu)勢(shì)表達(dá)的PCNSL 腫瘤細(xì)胞可能對(duì)HD-MTX 為基礎(chǔ)的化療方案更為敏感，但miR-21 在PCNSL 發(fā)病機(jī)制中的具體作用以及對(duì)化療敏感性高的機(jī)制目前尚未闡明，有待進(jìn)一步研究和驗(yàn)證。

此前的研究顯示miR-222 與DLBCL 預(yù)后相關(guān)，它可作為預(yù)后評(píng)估的生物標(biāo)志物。Thapa 等［19］在免疫缺陷人群中展開的研究表明，miR-222 能夠區(qū)分PCNSL 與非PCNSL，且表達(dá)水平與預(yù)后相關(guān)。但在免疫功能正常的人群中血漿miR-222 表達(dá)與PCNSL 的預(yù)后相關(guān)性尚不明確。本研究檢測(cè)免疫功能正常的PCNSL 患者血漿miR-222 表達(dá)水平，分析其與預(yù)后的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)二者無顯著相關(guān)性，血漿miR-222 不能預(yù)測(cè)免疫正常PCNSL 人群的預(yù)后。因此，免疫功能正常與缺陷的個(gè)體之間，PCNSL 發(fā)病機(jī)制以及miR-222 在發(fā)病機(jī)制中的作用可能存在差異，值得進(jìn)一步研究。

HD-MTX 為基礎(chǔ)的聯(lián)合化療方案對(duì)PCNSL的治療效果可能優(yōu)于HD-MTX 單一用藥方案，臨床常選用一些具有較強(qiáng)的血腦屏障通透性藥物進(jìn)行聯(lián)合用藥，如阿糖胞苷、Vm26、伊達(dá)比星等。然而，目前尚無研究明確何種聯(lián)合用藥方案對(duì)PCNSL 治療效果最佳。有研究報(bào)道含Vm26 的HD-MTX 化療方案可以讓PCNSL 患者獲益，本研究結(jié)果表明，HD-MTX 聯(lián)合Vm26 化療方案能夠顯著提高PCNSL 中位PFS，但該結(jié)論仍需要擴(kuò)大樣本量、開展前瞻性臨床試驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證，HD-MTX與Vm26 聯(lián)合方案中的用藥劑量也需要進(jìn)一步明確［3］。此外，近年來一些新型小分子藥物如BTK 抑制劑伊布替尼、免疫調(diào)節(jié)劑沙利度胺、PD-1 抑制劑納武單抗，在PCNSL 的基礎(chǔ)研究及臨床試驗(yàn)中取得顯著進(jìn)展［20-22］。miR-21 在此類新型靶向用藥治療中對(duì)患者預(yù)后的評(píng)估效果亦有待進(jìn)一步研究與明確。

本研究存在一定局限性：（1）僅對(duì)單中心的41例PCNSL 進(jìn)行了回顧性分析，可能存在選擇性偏倚。（2）由于樣本量有限，無法對(duì)性別、年齡、病理類型等因素進(jìn)行深入分析。但是鑒于該病的罕見性，本研究仍有一定臨床意義。

本研究結(jié)果表明血漿miR-21 或可作為PCNSL預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。除了PS 及LDH 這2 個(gè)較為公認(rèn)的影響PCNSL 預(yù)后因素外，本研究結(jié)果還表明HD-MTX 聯(lián)合Vm26 方案可以使PCNSL 患者生存獲益。

作者貢獻(xiàn)聲明徐慧雯 數(shù)據(jù)采集，論文構(gòu)思、撰寫和修訂。王珍珍 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)和分析，論文修訂。李情 臨床樣本分析。馬晶晶 文獻(xiàn)調(diào)研和整理。陳錕 數(shù)據(jù)采集與檢測(cè)。林之光 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)和分析。馬燕 論文修訂。陳波斌 研究指導(dǎo)，論文修訂。

利益沖突聲明所有作者均聲明不存在利益沖突。