SIRT1-cAMP 在白藜蘆醇改善小鼠卵巢儲備中的作用

郭 路 劉曉 程 顧 超 李 斌△

（1復(fù)旦大學(xué)附屬婦產(chǎn)科醫(yī)院婦科 上海 200011；2上海市女性生殖內(nèi)分泌相關(guān)疾病重點實驗室 上海 200090）

隨著女性生育時間的延遲以及三孩政策的開放，生育力保存及卵巢功能保護(hù)越來越受到女性關(guān)注。 早發(fā)性卵巢功能不全（premature ovarian insufficiency，POI）病因復(fù)雜，約50%以上的患者病因不明確，近年來研究發(fā)現(xiàn)氧化應(yīng)激在始基卵泡形成、卵泡發(fā)育、成熟、閉鎖等多個環(huán)節(jié)中均發(fā)揮作用，可能對卵巢儲備功能維持具有重要影響［1］。研究表明，組蛋白去乙?；福⊿irtuin1，SIRT1）參與調(diào)節(jié)細(xì)胞應(yīng)激、衰老等多個生理病理過程［2］。SIRT1 可通過激活PI3K/AKT/mTOR 通路減少POI 大鼠模型顆粒細(xì)胞氧化應(yīng)激，抑制細(xì)胞凋亡，參與調(diào)控始基卵泡募集過程［3-4］。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)POI 患者血清氧化水平升高，抗氧化水平降低，并且SIRT1 含量及活性降低。因此，我們推測氧化應(yīng)激可能通過SIRT1 影響顆粒細(xì)胞發(fā)育及功能，進(jìn) 而 參 與POI 發(fā) 生，但 其 具 體 機(jī) 制 不 詳［5］。SIRT1 特異激動劑白藜蘆醇（resveratrol，Res）預(yù)處理可以改善環(huán)磷酰胺所致大鼠卵巢顆粒細(xì)胞損傷，而SIRT1 選擇性抑制劑EX527 可以逆轉(zhuǎn)Res 的保護(hù)作用，表明SIRT1 可能是Res 作用的重要中介［6］。而Res 在卵母細(xì)胞減數(shù)分裂過程中可以上調(diào)胞質(zhì)環(huán)腺甘酸（cyclic adenosine monophosphate，cAMP），激活Epac1/CaMKKβ/AMPK/SIRT1/PGC-1α 通 路，進(jìn)而促進(jìn)脂肪酸氧化、線粒體呼吸等生理活動［7-9］。但Res 對氧化應(yīng)激誘導(dǎo)POI 的改善作用及機(jī)制尚不清楚。

因此，本研究擬從細(xì)胞水平檢測Res 對氧化應(yīng)激損傷人黃素化顆粒細(xì)胞功能作用，并從體內(nèi)實驗驗證Res 對氧化應(yīng)激損傷POI 模型小鼠卵巢作用，最后探索SIRT1-cAMP 通路是否參與其作用過程，尋找POI 潛在致病機(jī)制及可能治療方向。

資料和方法

人原代顆粒細(xì)胞培養(yǎng)2019 年11 月至2020 年5月于上海集愛遺傳與不孕診療中心收集人原代顆粒細(xì)胞15 例，并經(jīng)過復(fù)旦大學(xué)附屬婦產(chǎn)科醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)（批準(zhǔn)號：2019-47）。入選標(biāo)準(zhǔn)：（1）在診療中心就診的女性患者，年齡＜40歲，未絕經(jīng)，平素月經(jīng)規(guī)律，經(jīng)量正常，血FSH 水平、AMH 水平正常。（2）無化療、放療、自身免疫性疾病、卵巢原發(fā)或轉(zhuǎn)移腫瘤、盆腔及卵巢炎癥性疾病、盆腔或卵巢手術(shù)史。（3）無生殖相關(guān)家族病史，母親月經(jīng)規(guī)律且停經(jīng)年齡≥40 歲，若有子女，則子女青春期正常發(fā)育、月經(jīng)規(guī)律。（4）行第二代試管嬰兒，即卵胞漿內(nèi)單精子顯微注射技術(shù)（intracytoplasmic sperm injection，ICSI）。

將含有卵泡液的顆粒細(xì)胞移入刻度離心管，223.8×g離心5 min，棄去上清液。沉淀中加入3 倍體積的紅細(xì)胞裂解液，混勻，靜置3 min，223.8×g離心5 min，沉淀中加入15%胎牛血清的DMEM/F12不含酚紅培養(yǎng)基，接種于6 孔板中。

細(xì)胞實驗分組及處理實驗前1 天顆粒細(xì)胞6 孔板鋪板（5×105/孔），隨機(jī)分為3 組：H2O2組，H2O2+Res組和正常對照組，分別予100 μmol/L H2O2，10 μmol/L Res+100 μmol/L H2O2培養(yǎng)液干預(yù)24 h。

動物實驗分組及處理6 周齡雌性SPF 級C57小鼠（上海捷思杰公司），共24 只，均經(jīng)陰道涂片篩查，性周期正常，適應(yīng)性喂養(yǎng)1 周。隨機(jī)分為對照組、3-NPA 組［10］、3-NPA+Res 組 及Res 組，每 組6只。對照組小鼠第1～3 天予0.5%甲基纖維素灌胃，第4～24 天予0.5%甲基纖維素灌胃+生理鹽水腹腔注射；3-NPA 組小鼠第1～3 天予0.5%甲基纖維素灌胃，第4～24 天予0.5% 甲基纖維素灌胃+40 mg/kg 3-NPA 腹腔注射；3-NPA+Res 組第1～3天 予40 mg/kg Res 灌 胃，第4～24 天 予40 mg/kg Res 灌胃+40 mg/kg 3-NPA 腹腔注射；Res 組第1～3天 予40 mg/kg Res 灌 胃，第4～24 天 予40 mg/kg Res 灌胃+等量生理鹽水腹腔注射［11］；從動情周期、卵巢指數(shù)、卵泡計數(shù)及激素水平評估小鼠卵巢功能［12］。每天早10 時行陰道分泌物涂片，觀察動情周期。每周稱量體重，于停藥后處死。小鼠雙側(cè)卵巢稱重并計算卵巢指數(shù)。卵巢指數(shù)=卵巢重量（mg）/小鼠體質(zhì)量（g）×100%。

檢測指標(biāo)與方法（1）細(xì)胞凋亡檢測：胰酶消化，4 ℃223.8×g離心5 min，加入5 μL 的Annexin VPE 及5 μL 7-AAD，避光孵育15 min，使用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡。（2）線粒體膜電位（mitochondrial membrane potential，MMP）檢測：加入羅丹明123 染液10 g/mL，37 ℃細(xì)胞培養(yǎng)箱孵育30 min，流式細(xì)胞儀檢測MMP 水平。（3）E2、FSH 及AMH 檢測：收集細(xì)胞上清液或血清，4 ℃223.8×g離心10 min，取上清，ELISA 檢測E2（25～2 000 pg/mL）、FSH（4～140 U/L）及AMH（0.156～10 ng/mL）濃度。（4）顆粒細(xì)胞免疫熒光FSHR 檢測：1×105/mL 顆粒細(xì)胞爬片，PBS 沖洗3 次，4%多聚甲醛固定15 min，PBS沖洗3 次，0.5%Triton X-100 室溫通透20 min，PBS沖洗3 次，室溫封閉60 min，F(xiàn)SHR 抗體（1∶500）4 ℃濕盒孵育過夜。PBS 沖洗3 次，熒光二抗室溫敷育60 min，DAPI 避光敷育5 min，PBS 沖洗，在共聚焦顯微鏡下觀察并拍照。

實時定量熒光聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）Trizol冰上裂解細(xì)胞或組織15 min，提取RNA，配置逆轉(zhuǎn)錄體系，應(yīng)用Prime Script?RT Master Mix 逆轉(zhuǎn)錄試劑盒，37 ℃15 min，80 ℃5 s，4 ℃10 min 曲線擴(kuò)增，收集cDNA。應(yīng)用SYBR Premix Ex Taq PCR試劑盒，配置擴(kuò)增體系，每孔10 μL。每個樣品設(shè)置3 復(fù)孔，384 孔板上樣，利用熒光定量PCR 儀擴(kuò)增，設(shè)置擴(kuò)增及溶解曲線，2-ΔΔCT用于作圖及計算統(tǒng)計學(xué)差異。

Western blot 法檢測卵巢組織或細(xì)胞中SIRT1、AMHR2、FSHR、LHR、SOD2、GSH-Px、MDA5 表達(dá)制備蛋白樣品，BCA 檢測蛋白濃度，30 μg 蛋白樣品上樣，60 V 電壓跑濃縮膠，120 V 分離膠電泳。330 mA 恒電流轉(zhuǎn)膜90 min，冰水混合物降溫。牛奶封閉60 min，一抗稀釋液SIRT1（1∶2 000）、FSHR（1∶2 000）、AMHR2（1∶2 000）、LHR（1∶2 000）、SOD2（1∶1 000）、MDA5（4 μg/mL）、GSH-Px（1 μg/mL），GAPDH（1∶2 000）4 ℃孵育過夜。第二天室溫?fù)u床孵育二抗60 min，應(yīng)用ECL 超敏發(fā)光液試劑盒配置發(fā)光液，放入發(fā)光儀曝光條帶。

統(tǒng)計學(xué)分析所有實驗均重復(fù)3 次。所有數(shù)據(jù)用±s表示，采用GraphPad Prism 6.0 軟件分析，兩組間比較用獨立樣本t檢驗。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

SIRT1 激動劑Res 可改善氧化應(yīng)激導(dǎo)致的顆粒細(xì)胞損傷免疫熒光檢測顯示人黃素化顆粒細(xì)胞表達(dá)顆粒細(xì)胞特異性受體FSHR。通過H2O2誘導(dǎo)氧化應(yīng)激損傷顆粒細(xì)胞模型，發(fā)現(xiàn)H2O2組線粒體膜電位降低，細(xì)胞凋亡顯著增加，成功建立氧化應(yīng)激損傷顆粒細(xì)胞模型。Res+H2O2干預(yù)組細(xì)胞線粒體膜電位增加，細(xì)胞凋亡顯著減少。此外，Res+H2O2干預(yù)組抗氧化指標(biāo)SOD2及GSH-Px 表達(dá)明顯升高，氧化指標(biāo)MDA5 表達(dá)降低，顆粒細(xì)胞表面功能性受體FSHR、LHR 表達(dá)部分增加，雌激素合成能力增加，雌激素合成及調(diào)控基因CYP19A1、CYP17A1、AR、NR5A1、STAR以及顆粒細(xì)胞功能受體基因FSHR、LHR、AMHR2、ESR1、ESR2mRNA 水平均顯著升高。以上結(jié)果表明Res 可能通過激活SIRT1增加顆粒細(xì)胞激素合成能力及其表面受體表達(dá)，改善氧化應(yīng)激導(dǎo)致的顆粒細(xì)胞損傷（圖1、2）。

圖1 Res 抑制氧化應(yīng)激損傷顆粒細(xì)胞凋亡Fig 1 Resveratrol inhibits the apoptosis of oxidative-stress injured granulosa cells

Res 可以改善POI 小鼠卵巢功能4 組小鼠體重未見顯著差異，3-NPA 組小鼠平均動情間期延長，平均動情期縮短，卵巢指數(shù)下降，血清FSH 水平升高，AMH 水平降低，始基卵泡數(shù)量降低，與POI 表型相似。而3-NPA+Res 組平均動情間期縮短，平均動情期延長，卵巢指數(shù)上升，血清FSH 水平降低，AMH 水平升高，始基卵泡數(shù)量增加，說明Res 具有改善小鼠POI 表型的作用。進(jìn)一步檢測發(fā) 現(xiàn)，3-NPA 組 小 鼠 血 清SOD、GSH-Px 活 性 降低，MDA 活性升高，而3-NPA+Res 組小鼠血清SOD、GSH-Px 活性升高，MDA 活性降低。以上結(jié)果表明SIRT1 激動劑Res 具有改善小鼠POI 表型的作用（圖3）。

圖3 Res 對小鼠POI 表型的作用Fig 3 Effect of resveratrol on POI phenotype of mice

SIRT1-cAMP 信號通路可能參與Res 改善氧化應(yīng)激POI 小鼠卵巢功能過程通過PCR 檢測對照組、3-NPA 組、3-NPA+Res 組、Res 組小鼠卵巢組織中cAMP 信號通路關(guān)鍵基因，結(jié)果發(fā)現(xiàn)3-NPA 組小鼠 卵 巢 組 織EPAC、RAP1a、RAP1b、PLCb3、CREB1、CAMK2α及SIRT1基因表達(dá)降低，SIRT1活性降低，說明cAMP 信號通路可能參與氧化應(yīng)激POI 小鼠的發(fā)生，而3-NPA+Res 組卵巢組織中EPAC、RAP1a、RAP1b、PLCb3、CREB1、CAMK2α及SIRT1基因表達(dá)升高，以上結(jié)果進(jìn)一步說明cAMP-EPAC-Rap-CAMK 信號通路可能參與氧化應(yīng)激POI小鼠的發(fā)生，Res通過激活cAMP-EPAC-Rap-CAMK 信號通路改善小鼠POI表型作用，cAMP信號通路與SIRT1之間可能存在正反饋作用（圖4）。

圖4 cAMP 信號通路參與氧化應(yīng)激POI 小鼠發(fā)生Fig 4 The cAMP signaling was involved in oxidative-stress induced POI mice

討 論

POI 發(fā)病率逐年增加，卵巢功能下降所帶來的一系列低雌激素癥狀嚴(yán)重影響女性身心健康和生活質(zhì)量。POI 病因復(fù)雜，其發(fā)生機(jī)制更是不詳。氧化應(yīng)激在POI 疾病中的作用目前已得到認(rèn)可，POI患者血清抗氧化活性降低，氧化活性升高［13-14］。氧化應(yīng)激通過抑制卵細(xì)胞成熟，促進(jìn)細(xì)胞凋亡，誘導(dǎo)或加速POI 發(fā)生［15-16］。

圖2 Res 可以改善氧化應(yīng)激損傷顆粒細(xì)胞功能Fig 2 Resveratrol can improve function of oxidative-stress damaged granulosa cells

近年來，多項研究提示SIRT1 參與氧化應(yīng)激過程［17-18］。SIRT1 激活可以促進(jìn)PI3K-AKT 通路介導(dǎo)的FOXO1 去乙酰化修飾，抑制氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的卵巢顆粒細(xì)胞自噬［19］。白藜蘆醇（Res）是SIRT1 特異激動劑，實驗結(jié)果提示Res 具有改善氧化應(yīng)激損傷顆粒細(xì)胞及POI 小鼠卵巢功能，進(jìn)一步說明Res 可以通過激活SIRT1 改善POI 小鼠低雌激素狀態(tài)。

cAMP 是細(xì)胞內(nèi)參與調(diào)節(jié)物質(zhì)代謝和生物學(xué)功能的重要物質(zhì)，是細(xì)胞內(nèi)信號傳導(dǎo)過程中的“第二信使”。cAMP 貫穿卵泡發(fā)育全過程，卵泡細(xì)胞內(nèi)高水平的cAMP 維持卵母細(xì)胞處于減數(shù)分裂靜止期［20］。Res 可以增強(qiáng)cAMP 信號，在黃素化人顆粒細(xì)胞中，cAMP 與SIRT1 表達(dá)之間的正反饋機(jī)制維持SIRT1 在高水平狀態(tài)［21-22］。cAMP 信號通過激活SIRT1 改善阿霉素誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激損傷、細(xì)胞凋亡及心肌毒性［23］。本研究發(fā) 現(xiàn)3-NPA 組cAMP 信號通 路 關(guān) 鍵 基 因EPAC、RAP1b、RAP1a、PLCb3、CREB1、CAMK2α及SIRT1基因表達(dá)降低，SIRT1活性降低，而3-NPA+Res 組小鼠卵巢組織EPAC、RAP1b、RAP1a、PLCb3、CREB1、CAMK2α及SIRT1基因表達(dá)升高，SIRT1 活性升高，以上結(jié)果進(jìn)一步說明cAMP 信號通路參與氧化應(yīng)激POI 的發(fā)生，Res 可以增強(qiáng)cAMP 信號通路關(guān)鍵基因表達(dá)，兩者之間可能存在正反饋機(jī)制。

綜上所述，Res 可以通過SIRT1-cAMP 通路抗氧化作用改善POI 表型，本研究有助于尋找POI 治療潛在靶點，改善POI 患者低雌激素狀態(tài)及維持卵泡發(fā)育及功能。但是本實驗存在一定的局限性，首先，氧化應(yīng)激細(xì)胞模型采用H2O2，以動物模型是3-NPA，后續(xù)應(yīng)該增加3-NPA 細(xì)胞實驗以保持一致性；其次，近年來的研究發(fā)現(xiàn)Res 在激活SIRT1 的同時，SIRT3 也參與起調(diào)控作用，后續(xù)實驗須進(jìn)一步排除SIRT3 的干擾；最后，本文機(jī)制研究較淺，SIRT1 與cAMP 信號通路之間的具體調(diào)控機(jī)制尚不清楚，仍需后續(xù)的實驗研究來闡明。

作者貢獻(xiàn)聲明郭路 文獻(xiàn)調(diào)研與整理，實驗操作，圖表繪制，論文撰寫。劉曉程 PCR 實驗及數(shù)據(jù)統(tǒng)計和分析，圖表繪制。顧超 實驗監(jiān)督與指導(dǎo)，可行性分析，論文修訂。李斌 課題構(gòu)思與設(shè)計，數(shù)據(jù)分析與解釋，論文修訂。

利益沖突聲明所有作者均聲明不存在利益沖突。